Histologie a embryologie Program 1. praktika • obecné informace (organizace výuky) • histologie a embryologie (co je předmětem studia) • zpracování tkání (laboratorní metody) • demonstrace histologických preparátů (barvení různými metodami) Organizace praktik • Začátek - přesně • Přezouvání vstup do mikroskopického sálu pouze v přezůvkách (ne v návlecích) • Šatna – odložit svršky a zavazadla (zajistit doklady, cennosti, mobil - ztráty a nálezy – informace u dr. Daňkové) • Mobil – vypnutý nebo v tichém režimu • Mikroskopický sál = laboratoř – zákaz konzumace jídla a nápojů v šatně a v sále, – zákaz kouření na celé LF • BOZP • Pracovní místo zůstává stálé během semestru! Student je osobně a hmotně odpovědný za poskytnuté pomůcky • Průběh praktika - úvod – výklad + demonstrace vlastní práce • Samostatná práce studenta – studium preparátů ve světelném mikroskopu a fotografií v atlasu EM; jejich kreslení a popis = vyhotovení protokolu; protokol je na konci praktika zkontrolován. • Student, který zjevně práci odbyl a tedy nebude mít vyučujícím podepsaný protokol, musí dané praktikum nahradit • Student musí být připraven na dané praktikum • Rozvrh a sylaby (programy) přednášek a praktických cvičení – viz nástěnka a webové stránky ústavu • Pomůcky (vlastní) - sešit nebo volné papíry – formát A4, bez linek, dle šablony - měkká tužka, pastelky • Přestávka – 10 minut • Konec praktika – vyhlásí vedoucí cvičení www.med.muni.cz/histology Zápočet • 100% účast v praktických cvičeních; max. 30 % omluvených a nahrazených absencí • Úspěšně absolvovaný zápočtový test • Test proběhne v IS formou odpovědníku a bude zahrnovat otázky na probíraná témata. Test bude zpřístupněn posledních 14 dní semestrální výuky. Limit pro splnění testu je 90 %, test je možné libovolně opakovat od jeho otevření po dobu 14 dnů. • Kompletní sada protokolů podepsaných učitelem. • V případě neúspěchu u zápočtového testu, nebude zápočet udělen. • Během řádné semestrální výuky se studenti obracejí na vyučujícího své seminární skupiny. Jméno vyučujícího je uvedeno v rozvrhu, kontakt v IS. Pro neadresné dotazy je možné využít adresu: histology@med.muni.cz • Vyučující může průběžně ověřovat znalosti a poskytovat zpětnou vazbu formou otázek, diskuze nebo libovolného testu. Opakovaná nepřipravenost na praktickou výuku se nepromítá do případného neudělení zápočtu, ale může být zaznamenána a zohledněna v závěrečném hodnocení předmětu. • Obrázky jsou přístupné v MedAtlasu nebo ve studijních materiálech praktik v ISu Nahrazování praktik „předem“ • výjimečně, po předchozí domluvě se svým vyučujícím • nahrazování oznámit vedoucímu paralely (tomu, kdo má výklad) • zapsat se do sešitu (před nebo po výkladu) • na konci praktika předložit vedoucímu praktika protokol k podpisu Nahrazování praktik „po“ • absence musí být omluvena na studijním odd. a omluvenka zapsaná v IS http://www.med.muni.cz/histology Ústav histologie a embryologie Lékařská fakulta Masarykovy univerzity Přednosta ÚHE: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc. Doporučená literatura Ústav histologie a embryologie LF MU http://www.med.muni.cz/histology Doporučená literatura http://www.med.muni.cz/histology/multimedia-and-textbooks/ HISTOLOGIE • nauka o stavbě normálních, tj. zdravých buněk, tkání a orgánů na mikroskopické a submikroskopické úrovni • cytologie a obecná histologie • speciální histologie = mikroskopická anatomie (stavba orgánů jednotlivých systémů) EMBRYOLOGIE – nauka o prenatálním (intrauterinním) vývoji jedince • obecná embryologie (do konce 2. měsíce – EMBRYO - zárodek) od gametogeneze po raný embryonální vývoj • speciální embryologie (od 3. měsíce do porodu – FETUS - plod) organogeneze (vývoj orgánů v jednotlivých systémech) • teratologie – defektní vývoj orgánů (příčina, důsledek), vrozené vývojové vady (VVV = malformace = anomálie); metody prenatálního screeningu – ultrasonografie, amniocentéza, genetické vyšetření chromozomálních aberací (diagnostika, prevence a terapie). Histologie • Rozlišovací schopnost oka – ~ 0,1 mm • Rozlišovací schopnost SM – ~ 0,1 - 0,5 m • Rozlišovací schopnost EM – ~ 0,1 - 1 nm Zpracování tkání a orgánů pro účely histologického vyšetření ve světelném mikroskopu (příprava trvalého histologického preparátu) • ODBĚR vzorků • FIXACE tkáňových bločků • PRANÍ • ZALÉVÁNÍ - (parafinové) bločky • KRÁJENÍ - řezy • NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů • BARVENÍ řezů • MONTOVÁNÍ (uzavírání) 1. ODBĚR MATERIÁLU • malý kousek tkáně (orgánu) je odebrán a rychle vložen do fixačního media: • biopsie z živého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr – stěr z povrchu sliznice) = excise (vyříznutí) = punkce (dutou jehlou – jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň) = kyretáž (např. endometrium) • nekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře • velikost odebraného vzorku 0,5 – 1 cm3, fixace následuje bezprostředně! • označení Pomůcky k odběru: kyreta trokar – dutá jehla s mandrenem 2. FIXACE • Definice: denaturace a stabilizace proteinů v buňce („šetrné usmrcení buňky“ s minimem artefaktů) • Důvod fixace: chemická nestabilita tkáně – vysoušení, svraštění, autolýza v důsledku působení bakterií, hypoxie. Fixace má předcházet těmto změnám a stabilizovat strukturu vzorku. Během fixace jsou proteiny konvertovány do inaktivní, denaturované formy. • Druhy: – fyzikální vysokou teplotou (var, žíhání nad plamenem), nízkou teplotou (lyofilizace, mrazová substituce – kryoprezervační látky) – chemická roztoky organických a anorganických látek • imerze – ponoření do fixativa • perfuze – promývání intravenózní aplikací fixativa Požadavky na fixační činidlo: • zachovat strukturu • rychle penetrovat do tkáňového bločku • neovlivňovat výsledek barvení CHEMICKÁ FIXACE Fixační činidla: organická – ALDEHYDY – formaldehyd (SM) – glutaraldehyd (EM) – ALKOHOL – 96 – 100 % (absolutní etanol) – ORGANICKÉ kyseliny – led. octová, pikrová, trichloroctová - anorganická – ANORGANICKÉ kys. – chromová, osmium tetraoxid (OsO4) – SOLI TĚŽKÝCH KOVŮ – HgCl2 - směsi: FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol) Postup: fixace – při pokojové teplotě, 12 – 24 hodin, vzorek musí být přelit 20 – 50násobným množstvím fixačního činidla: (1 cm3 : 20 – 50 cm3) PRANÍ a ZALÉVÁNÍ • odstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího media závisí na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%) • důvod zalévání: „tvrzení“ měkkých tkáňových vzorků krájitelnými médii Zalévací média • ve vodě rozpustná – želatina, celodal, vosky • ve vodě nerozpustná – parafin, paraplast, celoidin Zalévání do parafinu • dehydratace – odvodnění fixovaných vzorků (parafin se s vodou nemísí) vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96% každá lázeň alkoholu 2 – 6 hodin) • projasnění – vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s parafinem – xylen • infiltrace – rozpuštěným parafínem (bod tání 56C); provádí se v TERMOSTATU: parafinová lázeň – 3 x 6 hodin. • vlastní zalití – do komůrek (plastové, papírové nebo kovové). Do komůrek se nalije rozpuštěný parafín a do něj se vloží tkáňové vzorky. Komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené vody. Parafinové bločky se po vynětí z komůrek zbaví přebytku parafínu a jsou připraveny ke krájení. odvodňovací tkáňový automat Leica TP 1020 Zalévací komůrky - papírové - kovové s orientačními plastovými prstenci výsledek zalití KRÁJENÍ • Mikrotom – regulace tloušťky řezů: 5 – 10 μm je optimum Sáňový mikrotom – blok je upevněný v držáku, nůž nebo břitva se pohybuje horizontálně Rotační mikrotom – nůž je fixní, držák s bločkem se pohybuje vertikálně Rotační mikrotom Sáňový mikrotom kryostat = rotační mikrotom v mrazicím boxu (– 60º C); zmrzlou tkáň lze krájet bez zalévání páska řezů parafinový bloček KRÁJENÍ NAPÍNÁNÍ ŘEZŮ • Napínání: na hladině teplé vody (45ºC) se řezy narovnají a vypnou • Lepení: z vody jsou řezy přeneseny na podložní skla s adhezivním filmem (želatina nebo směs glycerin-bílek) a uloženy do termostatu (37º C). Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv. Např. parafin – deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylenem. 1 2 3 4 5 7 8 1 – odběr 2, 3 – fixace 4 – zalévání 5, 6 – krájení 7, 8 – napínání řezů 4 6 Napínání na teplé vodě Napínání na teplé podložce BARVENÍ • zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují afinitu k barvivům dvou skupin: • zásaditá /bazická/ barviva („jaderná“) – reagují s kyselými strukturami buňky a tkání (NK v jádře aj.) bazofilie – bazofilní struktury • kyselá barviva („cytoplazmatická“) – reakce se zásaditými strukturami acidofilie – acidofilní struktury v buňce - chromofilní /chromatofilní/ x chromofobní - polychromatofilní – afinita k oběma druhům barviv • ORTOCHROMAZIE - bunečné struktury se barví stejnou barvou, jakou má barvivo (HE) • METACHROMAZIE - bunečné struktury se barví jinou barvou, jakou má barvivo Př. toluidinovou modří se v žírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a granula červenofialově (metachromaticky) Hematoxylin a eosin (HE) cytoplazma jádra xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace projasnění dehydratace praní barvení praní RUTINNÍ BARVENÍ: HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) Hematoxylin – zasaditý Eosin – kyselý • Postup: • Odstranění parafinu xylenem • Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% 96% 80%) • Barvení hematoxylinem  jádra - modro-fialová • Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) • Barvení eosinem  růžová - cytoplazma, vazivo, svaly • Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) • Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% 96%) • Projasnění v xylenu Výsledky barvení: • HE = Hematoxylin – Eosin jádra – modro-fialová cytoplazma a kolagenní vlákna – růžová svalová tkáň – červená • HEŠ = Hematoxylin – Eosin – Šafrán kolagenní vlákna – žlutá • AZAN = AZokarmín – Anilinová modř – oranž G jádra – červená erytrocyty – oranžové svalová tkáň – červená kolagenní vlákna – modrá Výsledky barvení: • HE = Hematoxylin – Eosin jádra – bright clear blue or dark violet cytoplasm and collagen fibers – pink muscle tissue – red • HES = Hematoxyline – Eosin – Safron connective tissue – yellow • AZAN = AZocarmin – ANiline blue – orange G nuclei – red erythrocytes – orange muscle – red collagen fibers – blue ≈ řada boxů (kyvet) s barvicími médii MONTOVÁNÍ • uzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem  trvalý preparát • rozpustná v xylenu – kanadský balzám • rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma trvalé histologické preparáty ke studiu ve SM Hematoxylin a eosin (HE) ren Azokarmín a anilin. modř (AZAN) kolagenní vlákna modrá ren Barvicí metody: přehledné – HE, AZAN demonstrují všechny složky tkání speciální zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové složky impregnační soli Ag, Au nebo Os HE – nejpoužívanější barvení Zpracování tvrdých tkání (zub, kost) • dekalcifikace (odvápňování) – převedení nerozpustných vápenatých solí do roztoku pomocí kys. mravenčí nebo chelatonu (EDTA), časově náročné – dny až týdny • výbrusy – tenké ploténky (50 – 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním materiálu Histochemie & Imunohistochemie • Význam: zjišťování povahy a lokalizace chemických látek v buňce „in situ“ (průkaz biomolekul - proteinů, AA, NA, sacharidů, lipidů, enzymů, pigmentů, anorg. látek – Fe, Ca, Zn aj.) • Provedení: detekce Ag-Pl* komplexů nebo Ag-Pl + Pl* (sekundární značená Pl) • * - marker 1. fluorochromy – rhodamin, Texas red, FITC 2. enzymy – křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza, 3. radioizotopy (I125) Antigen Primární Ab specifická vůči epitopu Ag Sekundární Ab specifická vůči primární Ab Enzym konjugovaný se sekundární Ab zajistí vizualizaci Aktin (cytoskelet) DAPI (jádro) Mikrotubuly (cytoskelet) KI-67 In-vivo/live cell imaging - US, MRI, PET… - Buňky s fluorescenčním reportérem doi:10.7150/thno.3694 - FACS Zpracování tkání pro elektronovou mikroskopii (EM) Požadavky na pracovní podmínky: • pH všech roztoků (medií) 7,2 – 7,4 (pufry – kakodylátový nebo fosfátový) • bezprašnost • roztoky (media) – šetrné působení na tkáně (minimum artefaktů) POSTUP • ODBĚR – okamžitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm3 • FIXACE – glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO4 (vazba lipidů) – dvojitá fixace • PRANÍ – destilovaná voda • DEHYDRATACE - alkohol • ZALÉVÁNÍ – vzorky se vkládají do želatinových kapslí nebo forem z plastu vyplněných zalévacím mediem (polymerizace – změna skupenství). Používají se epoxidové pryskyřice (Epon, Durcupan, Araldite) – ve vodě nerozpustná media Zalévací komůrky: želatinové (1), plastové (2) nosiče (držáky) kapslí (3) ploténky s komůrkami (4, 5) bločky připravené pro krájení 1 2 3 4,5 Odstranění přebytku tvrdého zalévacího media a zhotovení pyramidy s minimální řeznou plochou (0.1 mm2). Minimum tkáně (černý shluk) ve vrcholu pyramidy Úprava pyramidy (trimování) KRÁJENÍ • po odstranění přebytku media (trimming) a vytvoření pyramidy se z malé plošky (0.1 mm2) krájí jednotlivé ultratenké řezy (70 – 100 nm) - ultramikrotomy • používají se skleněné nebo diamantové nože s vaničkou – řezy splývají na hladinu vody ve vaničce a odtud jsou přeneseny na síťky (Ni) Ultramikrotomové nože: skleněný diamantový Krájení, nosné síťky Síťka se 3 páskami řezů typy sítěk KONTRASTOVÁNÍ • princip diferenciace struktur – různý rozptyl svazku elektronů v závislosti denzitě struktur ; „elektronová barviva“ – směsi těžkých kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý Na kapce barviva je položena nosná síťka tak, aby ultratenké řezy byly vystaveny působení barviva. Rozdíly mezi SM a EM SM EM Odběr  1 cm3 minuty  1 mm3 sekundy Fixace formaldehyd 12 – 24 hod. glutaraldehyd 1 – 3 hod. Zalévání parafin epoxid. pryskyřice (Durcupan) Krájení Tloušťka řezů mikrotom 5 – 10 m ultramikrotom 50 – 100 nm Barvení (LM) Kontrastování (EM) barviva (hematoxylin – eosin) těžké kovy (uranylacetat, citrát Pb) Montování + --- Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka - elektronogram Děkuji za pozornost Petr Vaňhara, PhD. pvanhara@med.muni.cz http://www.med.muni.cz/histology