Lékařská mikrobiologie Alena Ševčíková OKM, FN Brno Plán přednášek – zimní semestr •12.9.16 - stručná historie mikrobiologie, základní vlastnosti baktérií, morfologie, fyziologie, druhy kultivace, typy kultivačních půd - Mgr. Petra Myšková, Ph.D. • •12.9.16 - mikroby a prostředí, dezinfekce, sterilizace, základy epidemiologie – • Mgr. Petra Myšková, Ph.D. •14.9.16 – mikroby a makroorganismus, patogenita a virulence, průběh a formy infekce, základy klinické mikrobiologie – prim. MUDr. Markéta Hanslianová •15.9.16– odběr, zasílání a zpracování infekčního materiálu, vyšetřovací metody v bakteriologii – MUDr. Ivana Vítková • Plán přednášek – zimní semestr •16.9.16 - základy imunologie, obecná virologie, virologické a sérologické vyšetřovací metody – MUDr. Jana Bednářová, PhD. •---------------------------------------------------------------- •7.10.16 – antibiotika, vyšetřování citlivosti, rezistence kmenů na antibiotika - prim. MUDr. Markéta Hanslianová •4.11.16 – grampozitivní aerobní a fakultativně anaerobní koky, bezpečnost práce v laboratoři - MUDr. Ivana Vítková • Mikrobiologie •Mikrobiologie (z řeckého micron = malý, biologia = studium života) je věda studující mikroorganismy • –Virologie – 20 - 200nm –Bakteriologie - 1 μm –Mykologie - cca 10 μm –Parazitologie – 10 -150μm – •Parazitologie zahrnuje nauku o prvo plísně pod mikroskopem Blechy P1010118 Virus •nejjednodušší živý útvar •bez buněčné stavby •obsahuje jediný typ NK (DNA nebo RNA) •množí se syntézou svých složek, nikoliv dělením •v této syntéze je závislý na ribosomech hostitelské buňky •priony - proteinové infekční částice, vyvolávající některá onemocnění CNS Tři různé typy virů: v levé části virus infikující bakterie neboli bakteriofág, vpravo nahoře neobalený virus s ikosahedrální symetrií, vpravo dole retrovirus HIV u kterého je virová částice ještě obalena membránou s povrchovými glykoproteidy. Genomová nukleová kyselina je znázorněna modře Prion Chřipka A Rotaviry Virus Eboly Bakterie •buňky prokaryotické •vždy jednobuněčné, netvoří tkáně •nukleoid (bakteriální obdoba jádra) –není obalen membránou •neobsahuje mitochondrie, ani endoplasmatické retikulum •součást buněčné stěny je peptidoglykan • • prokaryoticka_bunka_bakterie Grampozitivní a gramnegativní bakterie Gramnegativní tyčky Grampozitivní stafylokoky Buňky eukaryotické •Kvasinky a plísně • • •Jednobuněční prvoci, vícebuněční příživníci, členovci a červi (blecha, veš) • • •Rostliny •Živočichové • calbicanscsfvpshunt3000x Vši prvok Candida Aspergillus Stručná historie •Stáří planety cca 4,5 miliardy let •Prokaryotické buňky – archea, bakterie cca 3,5 miliardy let •Eukaryotické buňky jednobuněčné – cca 2 miliardy let •Eukaryotické vícebuněčné organismy – cca 700 miliónů let •Obratlovci - cca 250 milionů let •Savci - cca 70 miliónů let •Člověk – cca 2 milióny let – 100 000 let • • • • • • Celá minulost planety zkrácená na velikost hodinového ciferníku Stručná historie • •Lidé již ve starověku tušili, že některé choroby jsou infekční a podezřívali z přenosu „neviditelné tvorečky“ •Italský lékař Fracastoro, (1485-1553) • foto2_12901 Stručná historie 1201056849 foto2_12901 20041203-bakterie Stručná historie •1676 Antony van Leeuwenhoek sestrojil jednoduchý mikroskop a pozoroval „malá zvířátka“ v hlenu svých zubů •1796 Edward Jenner zavedl očkování proti pravým neštovicím • Antoni van Leeuwenhoek byl první člověk, který pozoroval bakterie Stručná historie •Ignác Semmelweis (1818-1865) mytí rukou • cover_final_rgb • •1857 Louis Pasteur zformuloval teorii, že zkvašení vína je způsobeno mikroby a předpokládal, že stejným způsobem by mikroby mohly vyvolávat choroby a současně s Robertem Kochem prokázali •1876, že sněť slezinná může být vyvolána experimentálně vstříknutím bakterie Bacillus anthracis do těla zvířat • • • 300px-Tableau_Louis_Pasteur Stručná historie •Joseph Lister 1827 – 1912 začal operovat pod sprškou kyseliny karbolové, aby zamezil infekci ran mikroby ze vzduchu - antisepse • chfa_03_img0510 Érou Louise Pasteura a Roberta Kocha nastalo období označované jako zlatý věk mikrobiologie •Louis Pasteur (1822 – 1895) –očkování proti vzteklině, sněti slezinné, choleře drůbeže –příčina kvašení piva a vína, pasterizace –kultivace bakterií v tekutých půdách –objevil mikroby vytvářející spóry, anaeroby •Robert Koch (1843 – 1910) –zavedl izolaci čistých kultur na pevných půdách, barvení bakterií a mikrofotografii –podílel se na objevu původce cholery a izoloval původce tuberkulózy – – – •Podle metod a postupů zavedených Pasteurem a Kochem byla postupně objevena většina původců bakteriálních infekcí •Zakladatelem virologie je považován Ivanovskij, který v roce 1892 popsal přenos mozaikové choroby tabáku •1898 – objeven první živočišný virus •1911 – první lidský virus, žlutá zimnice •1915 – viry bakterií - bakteriofágy 1900 - 2013 Bakteriologie Mikrobiologie – –lékařská – zabývá se mikroorganismy, které jsou patogenní pro člověka, vyvolávají u něj onemocnění nebo se u člověka přirozeně vyskytují –veterinární –potravinářská – mikrobiologie potravin, jejich konzervace, využití v potravinářských technologiích – – – – • Taxonomie věda zabývající se rozdělením a zařazením organismů podle určitých pravidel •Počet nově popisovaných mikroorganismů vzrůstá a je třeba je pojmenovat, uspořádat na základě vzájemných vztahů do taxonomických skupin a nově izolovaný kmen řádně identifikovat a zařadit do známého pojmenovaného taxonu • Součástí taxonomie –Nomenklatura – názvosloví –Klasifikace - třídění –Identifikace – určování Klasifikace - třídění •Uspořádání mikroorganismů na základě vzájemných vztahů do taxonomických skupin, taxonů •Základním taxonem je bakteriální druh (species) –soubor kmenů sdílejících stálé vlastnosti a lišící se od kmenů jiné skupiny •Kmen je populace mikrobů pocházející z jediné mikrobiální buňky Nomenklatura – názvosloví •Pojmenování taxonu, bakteriálního druhu, podle mezinárodně dohodnutých pravidel •Název bakterií se skládá ze jména rodového (rod, genus) a jména druhového (druh, species) –Streptococcus pyogenes –Rickettsia prowazekii –Kocuria kristinae, Yersinia aldovae • • StreptococcusGramStain2 Identifikace – určování •Postup, kterým zjistíme, že nově izolovaný kmen náleží do známého, pojmenovaného taxonu –morfologické znaky (tvar, velikost, uspořádání, barvitelnost buněk, vzhled kolonií) –fyziologické znaky (tvorba nebo štěpení různých sloučenin) –chemotaxonomické znaky (složení buněčné stěny, analýzy mastných kyselin) –genetické znaky a molekulární vlastnosti – Základní morfologie bakterií •Velikost – většina patogenů 0,5 – 3 μm •Tvar a uspořádání –koky ve dvojicích, řetízcích, shlucích, tetrádách –tyčinky –spirály •Barvitelnost dle Grama –grampozitivní - modré –gramnegativní – červené •dle acidorezistence • – • – • bakterie bakterie-5 Streptococcus sp. - Staphylococcus sp. staphylococcus_bacteria_phoyomicrographs_germs Stavba bakteriální buňky •Cytoplasma buňky obsahuje –nukleoid-jaderný ekvivalent, cirkulární DNA –ribosomy a inkluzní tělíska, vakuoly, –Plasmidy – malé molekuly DNA •Cytoplasmatická membrána •Buněčná stěna •Polysacharidová pouzdra nebo slizová vrstva – glykoprotein, chrání před fagocytózou •Bičíky – orgány pohybu a fimbrie – adheze bakterií k epitelu – – 400px-Average_prokaryote_cell_cs Cytoplasmatická membrána •Složena z dvojité vrstvy fosfolipidu a různých bílkovin •Bílkoviny se uplatňují –v transportu živin do buňky –v respiračních pochodech –v syntéze některých složek membrány, stěny i slizové vrsty –v sekreci látek z cytoplasmy do zevního prostředí (bakteriální toxiny, extracelulární enzymy) mem Buněčná stěna •Silná tuhá vrstva odolávající osmotickému tlaku a umožňující bakterii uchovat svůj tvar •Stěna grampozitivních bakterií je jednodušší a tvoří ji mohutná 20 nm silná peptidoglykanová struktura, protkaná řetězci kys.teichoové • P1010128 Buněčná stěna •Stěna gramnegativních je tenčí, ale složitější 15 nm – tenký peptidoglykan, proteiny tvořící poriny ve fosfolipidové dvojvrstvě, lipoproteiny, lipopolysacharidy, periplasmatický prostor (endotoxin, O antigen) • P1010133 Vnější vrstvy •Polysacharidové pouzdro (pneumokoky, klebsiely, hemofily) •Polypeptidové pouzdro (anthrax) •Slizová vrstva (Streptococcus mutans, koaguláza negativní stafylokoky) – biofilm •Bakteriální bičíky •Pili, fimbrie • • • Fig-1 Streptococcus%2520pneumoniae%2520fig11 Bakteriální spory •Rody Bacillus a Clostridium reagují na vysychání či úbytek živin tvorbou spor – vysoce odolné útvary, mohou přežívat stovky let při nepříznivých podmínkách •Bakteriální endospory nepřijímají Gramovo barvivo – světlolomné útvary •Tvar, velikost a uložení spor jsou někdy typické pro různé druhy •Clostridium tetani Clostridium1 Odolnost spor •Vůči teplu, UV záření, vysychání, některým desinfekčním prostředkům (ethanol, fenol) •Spory jsou ničeny –Clostridium tetani při 100o C za 90 min –C.botulinum Autoklávováním při tlaku 2 atm (121o C) za 20 min –Oproti tomu vegetativní buňka – je zničena při 70o C za 10 min • • • • • Metabolismus bakterií •Katabolismus – štěpením složitějších sloučenin vzniká adenosintrifosfát (ATP) slouží jako pohotový zdroj energie •Anabolismus – biosyntéza •Většina procesů je katalyzována enzymy, které snižují aktivační energii chemických reakcí, aby probíhaly dostatečně rychle a nedošlo k narušení vnitřního prostředí Zdroj energie •Přeměna energie slunečního světla na energii chemickou - fototrofy - sinice •Získávání energie oxidací redukovaných látek chemotrofy –Bakterie redukující látky anorganické (chemolitotrofy) bakterie sirné a železité –Bakterie redukující látky organické (chemoorganotrofy) – patogeny Jako zdroj uhlíku může být oxid uhličitý – autotrofy Nebo organické látky – heterotrofy – všechny patogenní bakterie získávají energii i uhlík z organických látek (chemoheterotrofy) Katabolické procesy – získávání energie •Fermentace – kvašení – bez přítomnosti kyslíku, proces je anaerobní –Alkoholové, mléčné, propionové •Respirace – uvolněné elektrony jsou přenášeny na dýchací řetězec Krebsova cyklu na cytoplasmatické membráně, proces je aerobní za přístupu vzduchu (po energetické stránce vydatnější) kyslík je konečným příjemcem elektronů –Výroba octa, kyseliny citronové •Obligátní intracelulární parazité – nedovedou sami získávat energii, potřebují živou hostitelskou buňku – viry, chlamydie Rozdělení mikrobů podle vztahu ke kyslíku •Aeroby: Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium •Anaeroby: –Obligátní,(striktní):Clostridium haemolyticum, Clostridium difficile –aerotolerantní: Clostridium perfringens •Fakultativní anaeroby: většina, např. enterobakterie, stafylokoky, enterokoky •Mikroaerofilní mikroby: lactobacily, kampylobaktery •Kapnofilní: zvýšená tenze C02: meningokoky, gonokoky Termostaty P1010116 P1010117 Anaerostaty BUGBOX1 04 Biosyntéza •Zdroj uhlíku – organické sloučeniny (monosacharidy, disacharidy, škrob, glykogen, pektin, chitin, celulóza, lipidy, proteiny, nukleové kyseliny •Zdroj dusíku – vzdušný N2, amoniak •Síra, fosfor •Mg, Ca, K – vysoké koncentrace •Mn, Zn, Mo, Se, Co, Cu – stopové prvky •Růstové faktory – vitaminy, aminokyseliny Bakteriální růstový cyklus •Růst buňky –koordinovaná tvorba makromolekul a buněčných složek –po dosažení určité velikosti (iniciační perioda) je zahájena replikace chromosomu, vzniknou dvě kruhové molekuly dvojřetězcové DNA •Tvorba septa •Dělení buňky – každá dceřinná buňka získává svou kopii DNA a polovinu cytoplasmatického obsahu Diplokok_jpg Generační doba •Délka růstového cyklu, je doba, za kterou se počet bakterií zdvojnásobí •Její délka je individuální vlastností buňky a závisí také na množství živin •Generační doba u Escherichia coli za optimálních podmínek je při 37o C 20min, při 30o C jedna hodina •Generační doba u Mycobacterium tuberculosis je 12 hodin Bakteriální růstový cyklus •Stacionární růstová křivka –Lag-fáze –Logaritmická, exponenciální fáze –Stacionární fáze –Fáze odumírání • •Kontinuální kultivace – udržení populace v logaritmické fázi růst –v průmyslové mikrobiologii –růst bakterií v zažívacím traktu • 250px-Bacterial_growth Typy růstu •Planktonický růst –v podobě izolovaných buněk • 250px-Gram_Stain_Anthrax P1010103 Typy růstu •Růst bakterií v podobě biofilmu –Biofilmy jsou strukturovaná mikrobiální společenství, uložená v mezibuněčné hmotě a adherující k inertním i živým povrchům –Jsou více chráněny proti vysychání, desinfekčním látkám, ale také proti účinku fagocytů, protilátek a antibiotik • lifecycle Vznik biofilmu •Na umělých materiálech: intravenozní katetry, umělé srdeční chlopně, kloubní náhrady, nitroděložní tělíska, močové katetry (koagulázanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus, aktinomycéty) •Zubní povlak, zubní kaz, záněty středního ucha, osteomyelitida, zánět žlučových cest, endokarditida, záněty plic při cystické fibróze Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Voda – 80 % živé bakterie, 15% u spor –Nejvíce citlivé na vyschnutí jsou neisserie (gonokok) –Odolnější jsou zástupci kožní flóry –Původce tuberkulózy – vydrží několik týdnů –Vysoce odolné – nokardie, aktinomycety – půdní, plísně, spory, cysty prvoků, vajíčka červů Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Teplota –Minimální, optimální, maximální růstová teplota –Teplotní rozmezí růstu •20-40o C – většina lékařsky významných bakterií –Nejužší teplotní rozmezí má gonokok 30-38,5o C –Schopnost množit se při 0o C mají listerie, yersinie –Schopnost množit se při 8o C mají salmonely, zlaté stafylokoky –Kolem 45o C ještě rostou salmonely, kampylobaktery, Bacillus cereus Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Teplota optimální –0 - 20o C psychrofily – nepatogenní mikroby, žijící ve vodě a půdě –20 - 40o C mesofily – většina mikrobů významných pro lékařskou mikrobiologii –Nad 40o C termofily, horké prameny, kompost, chlévská mrva, nepatogenní, Archaea –Nad 80o C hypertermofily, podmořské sopečné oblasti, Archaea Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Hydrostatický tlak –Stoupá o 1atm na 10m vody –Do hloubky 2000m převažují mikroorganismy barotolerantní –V extrémních hloubkách žijí barofily Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Osmotický tlak –Většinou v hypotonickém prostředí chrání mikroby pevná buněčná stěna –V hypertonickém prostředí ztrácejí vodu, přestávají se množit, podléhají plasmolýze (princip konzervace potravin pomocí soli, cukru) •enterokoky tolerují 6,5% NaCl, stafylokoky 10% •Vibria bez přídavku 1% NaCl většinou nevyrostou Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Koncentrace vodíkových iontů –Většinou je optimální pH neutrální pH6-pH8 –Vibrio cholerae – vyhovuje zásadité prostředí pH 7,4 – 9,6, při kyselém rychle hynou –Enterokoky jsou vysoce tolerantní pH 4,8 – 11 –Při kultivaci v uzavřeném systému vznikají metabolity převážně kyselé, po vyčerpání nárazníkové kapacity růst se mikroorganismů zastavuje Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Oxidoredukční potenciál –Odráží poměr mezi oxidovanými a redukovanými látkami v daném prostředí –Oxidované prostředí vyhovuje aerobům, i když při svém metabolismu redox potenciál snižují a umožňují množení anaerobů –Anaeroby vyžadují redukované prostředí, nízký redox potenciál Pěstování bakterií •Tekuté kultivační půdy (Pasteur, Koch) •Kultivace na pevných agarových půdách (Walter Hesse) •1887 Richard Petri zavedl skleněné misky s plochým víčkem – Petriho misky •1914 – první komerčně připravované sušené kultivační půdy Podmínky pěstování bakterií •Dostatek vody, živin, růstových faktorů, optimální teplotu, vhodné složení atmosféry, odpovídající redox potenciál, optimální pH, vhodný osmotický tlak, ochrana před zářením, sterilita prostředí a jeho ochrana před kontaminací •Termostaty – většinou při 37oC, vlhkost, případně se zvýšenou tenzí CO2 •Anaerostaty Druhy kultivačních půd •Tekuté půd –Různé druhy bujónů (masopeptonový bujón, thioglykolátový bujón) •Použití k pomnožení malého množství mikrobů •Zákal, sediment, blanka –Cukrové půdy •Štěpením substrátu dochází ke změně pH roztoku a ke změně barvy přidaného indikátoru • střevní laboratoř Druhy kultivačních půd •Pevné půdy - ztužení původně tekutého základu přidáním 1-2% agaru, (5%) •Výhoda - pěstování mikrobů v izolovaných koloniích •Bakteriální kolonie je společenství buněk vzniklé z původně třeba z jedné životaschopné mikrobiální buňky •Viditelnou kolonii tvoří několik set miliard buněk •Rozočkováním jedné kolonie získáme čistou mikrobiální kulturu Staphylococcus aureus na krevním agaru S Znaky bakteriální kolonie •Velikost – v mm •Tvar – kulatý, laločnatý, plazící se •Profil – plochý, vypouklý, miskovitý •Okraje – rovné laločnaté •Povrch – hladký, drsný, lesklý, matný •Transparence – (ne)průhledná •Barva – bílá, žlutá, bezbarvá •Změny v okolí – zbarvení, hemolýza •Konsistence – hlenovitá, drobivá, vrůstající do agaru •Zápach – po jasmínu, Escherichia coli na MacConkey agaru P1010104 Plazivý růst Protea hauseri a izolované kolonie Escherichia coli P1010105 Typy půd •Základní – bujón, peptonová voda •Obohacené – krevní agar, čokoládový agar, Bordet-Gengouova půda (Bordetella pertussis, parapertusis), Šulova půda (mykobakteria) •Selektivní – obsahují inhibitor zabraňující růstu nežádoucí flóry, KA s 10% NaCl (stafylokoky), selenitová půda (salmonely), alkalická peptonová voda (vibria), antibiotické disky: bacitracin (hemofily), vankomycin-colistin (meningokoky) Černé kolonie vankomycin rezistentního enterokoka na selektivní půdě Enterokok - půda VRE • Campylobacter sp. na selektivní půdě P1010095 Typy půd •Diagnostické půdy – sledujeme, zda mikrob dokáže využít přidaný substrát, –štěpení cukrů, např. glukozy, –Desaminace fenylalaninu (proteus) –Dekarboxylace aminokyselin (lysin, arginin, ornithin) –Štěpení močoviny, redukce nitrátu, –Tvorba H2S, indolu, acetoinu, využití citrátu –Průkaz enzymu - katalása, oxidáza, Pyr-test, ONPG –Chromogenní půdy, kombinované půdy Hajn, –Pestrá řada, komerční soupravy, Charakteristické znaky Salmonella sp. na půdě dle Hajna a na půdě dle Švejcara P1010160 Identifikace 4 kmenů enterobakterií na Enterotestu 24 (Lachema) P1010093 Chromogenní půda (žlutě roste Proteus sp., červeně Escherichia coli, modře Klebsiella sp.) P1010100 Typy půd •Selektivně diagnostické – kombinují vlastnosti půd selektivních a diagnostických –Pro gramnegativní mikroby •Endova, MacConkeyho, XLD, SS, CIN, TCŽS –Pro grampozitivní mikroby Claubergova půda (původce záškrtu) •Slanetzův-Bartleyho agar (enterokoky) –Pro anaerobní kultivaci •VL bujón, thioglykolátový, Schaedlerův Salmonella sp. rostoucí na Endově půdě (průhledné kolonie) a na XLD (černě) Endo XLD Typy půd •Půdy ke zjišťování testů citlivost –MH – agar (Muellerův-Hintonové) –MH - bujón •Půdy k uchovávání kultur –Glycerolový sérový bujón •Půdy transportní –Amies Testy citlivosti P1010086 Transportní půda s Amiesem Lahvičky na hemokultury