ANALYTICKÉ  METODY
Klinická biochemie


·   Spektrofotometrie
·   Turbidimetrie
·   Nefelometrie

·   Fluorimetrie
· Delfia
·   Chemiluniniscence

·   Vertikální fotometrie (reader)
·   Denzitometrie
·Reflexní spektrofotometrie
·   Atomová emisní spektrofotometrie
·   Atomová absorpční spektrofotometrie
O P T I C K É   M E T O D Y

Lambertův-Beerův zákon
I = I0  . 10 -ε  l  c
Aλ  =  ε λ  l  c

Limitace (omezení) platnosti Lambertova-Beerova zákona způsobená chemickými a instrumentálními
(technickými) vlivy - příčiny nelinearity:

ØOdchylka absorpčního koeficientu při vysokých koncentracích (>0.01 mol/l) vlivem
elektrostatických interakcí mezi molekulami
Ø
ØRozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku
Ø
ØFluorescence nebo fosforescence vzorku
Ø
ØNedokonale monochromatické světelné záření
Ø
ØNekoherentní světelné záření

Kalibrační  křivka
Citlivost  metody
Linearita metody
Měřící rozsah metody
Kalibrační faktor

Kalibrace_lineárni Kalibrace_lineárni%201bod Kalibrace_logit%20log4P
Kalibrační faktor =  Ckal  /  Akal


                         Avz
              cvz  =            .  cst
                          Ast
cvz  = Avz   .   F




Měření End – point
Kinetické měření


E N Z Y M Y
- Δ / t  substrát                + Δ / t  produkt














L-alanin + 2-oxoglutarát ↔ pyruvát + L-glutamát    (ALT)
pyruvát + NADH + H+ ↔ L-laktát + NAD+                 (LD)
pyruvát + NADH +H+ ↔ L-laktát + NAD+    (LD)
L-laktát + NAD+ ↔ pyruvát + NADH +H+   (LD)
4-nitrofenylfosfát + H2O  ↔ 4-nitrofenol + fosforečnan    (ALP)

OPTICKÝ  TEST
Opticky%20test


KONSTANTA  MICHAELISE-MENTENOVÉ
[Km]
Reakce  prvního řádu
Reakce nultého řádu

Enzymy%20Km



LUMINISCENCE
Fotoluminiscence
                  Fluorescence
                  Fosforescence
Chemiluminiscence

X  +  hν   à   X*     à      X  +  hν´
    excitační                           emisní
     primární                         sekundární
                   Stockesův  posun
FLUORESCENCE

 A  +  B  à    X*  à  P  +  hν

A a B jsou reaktanty
X* je excitovaný meziprodukt
P je produkt v základním stavu
hν je energie emitovaného světelného záření
CHEMILUMINISCENCE

DELFIA
Tento systém využívá jako fluorescenční značky cheláty lanthanidů europia, samaria a terbia.
Cheláty lanthanidů vykazují velký Stokesův posun (až 300 nm) a  delší  dobu emise než ostatní běžné
fluorofóry. Tyto dvě vlastnosti výrazně zvyšují citlivost a specifičnost.
Emitované záření může být měřeno až v době, kdy nespecifická fluorescence matrice vzorku pohasla.
Tato nespecifická fluorescence má trvání pouze 10 ns.
Vzorek je ozařován tisící pulzy za sekundu excitačním zářením o vlnové délce 340 nm.
V intervalu mezi záblesky je měřena fluorescence vzorku po dobu 400 µs vždy po časové prodlevě
v délce 400 µs.

IMUNOCHEMICKÉ  REAKCE
Kompetitivní  /   nekompetitivní
Homogenní   /   nehomogenní