Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity1 Krev červený krevní obraz, krevní skupiny Praktické cvičení z fyziologie (podzimní semestr: 4. – 6. týden) Studijní materiály byly vytvořeny za podpory projektu MUNI/FR/1474/2018 Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity2 Červený krevní obraz Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity3 Červená krvinka (erytrocyt, ery) ̶ bezjaderná buňka, hlavní část formované složky krve ̶ Tvar: ̶ bikonkávní disk - tvar zvětšuje povrch asi o 30% ̶ tvar zajištuje protein spektrin ̶ plasticita tvaru důležitá pro prostup úzkými kapilárami ̶ Funkce: ̶ transport kyslíku (vázaného především na hemoglobin) do tkání ̶ účastní se na udržení acidobazické rovnováhy a transportu CO2 ̶ Velikost: ̶ Normocyt: 7,5 µm ̶ Mikrocyt: ≤ 7 µm ̶ Makrocyt: ≥ 9 µm ̶ Megalocyt: ≥ 20 µm ̶ Tloušťka cca 2,5 µm na periferii a cca 1 µm ve středu disku Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity4 Retikulocyt ̶ Prekurzor erytrocytů, fyziologicky tvoří retikulocyty 1% ± 0,5% všech červených krvinek v krvi ̶ retikulocytóza: zvýšení podílu retikulocytů v periferní krvi, nastává po ztrátě krve nebo darování krve ̶ Již nemá jádro, ale v cytoplasmě nacházíme zbytky organel (substantia granulo-filamentosa) ̶ Do 48 h dozrává ve zralý erytrocyt retikulocyt zralý erytrocyt Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity5 Poikylocytosis: nepravidelné tvaru erytrocytů Přítomná u různých typů anémii Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity6 Počet erytrocytů ̶ Počet ery - RBC (red blood count) ̶ Muž: 4,3-5,3 * 1012 / l ̶ Žena: 3,8-4,8 * 1012 / l ̶ Novorozenec: 4,4-7 *1012 / l ̶ Pohlavní rozdíly: ̶ U mužů: testosteron (mužský pohlavní hormon) stimuluje vyplavení erytropoetinu ̶ U žen ve fertilním věku: relativní erytrocytopenie způsobená pravidelnou ztrátou krve během menstruace (a nižší hladinou testosteronu) ̶ polyglobulie – zvýšený počet ery – zvýšená viskozita krve ̶ Polycytemie vera, dehydratace, adaptace na vyšší nadmořskou výšku ̶ erytrocytopenie – snížení počtu ery – nižší viskozita krve Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity7 Stanovení počtu červených krvinek ̶ Automatické metody ̶ Impedanční – měříme na podkladě nárůstu odporu a poklesu proudu při průchodu kapilárou ze zásobní nádoby do menší nádobky. Ery má nižší vodivost než diluent. Umožnuje nám zjistit i velikost ery, malý = větší proud, velký = nižší proud. ̶ Fotooptická – při průchodu kapilárou na ery dopadá světelný paprsek, ery způsobí rozptyl světla, který zachycujeme ̶ Klasická metoda ̶ Bürkerova komůrka + Hayemův roztok, sloužící k ředění ̶ 4950 µl Hayemova roztoku a 25 µl krve: ředění *198, nebo 4975 µl Hayemova roztoku a 25 µl krve: ředění *199) Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity8 Hematokrit ̶ Vyjadřuje procentuální zastoupení objemu erytrocytů v plné krvi ̶ Zjišťujeme po centrifugaci nesrážlivé krve* ̶ Plasma ̶ Buffy coat – bílá neprůhledná vrstva nad ery tvořená leukocyty a trombocyty – tvoří pouze 1% objemu krve ̶ Erytrocyty ̶ HCT (hematokrit) ̶ Muž: 42-52% ̶ Žena: 37-47% ̶ *centrifugací srážlivé krve po odstranění krevního koagula získáme krevní sérum (od plazmy se liší chyběním koagulačních faktorů) plazma (55 %) leukocyty and destičky (1%) erytrocyty (44%) Normální krev Anemická krev Polycytémie Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity9 Hemoglobin (Hb) ̶ α a β globinové jednotky u dospělého ̶ α a γ globinové jednotky u fetálního (větší afinita ke kyslíku než mateřský hemoglobin) ̶ Hem obsahuje železo Fe2+ – místo vazby O2 ̶ HGB (koncentrace hemoglobinu) ̶ Muž: 140-180 g/l ̶ Žena: 120-160 g/l ̶ Novorozenec: 160-240 g/l ̶ Spektrofotometrické stanovení: Ke krvi přidáme transformační roztok, který způsobí lýzu erytrocytů a uvolnění hemoglobinu, který zároveň přemění na kyanhemoglobin. Stanovujeme absorbanci světla roztokem. hem Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity10 Deriváty hemoglobinu ̶ Oxyhemoglobin (navázaný O2 ) hemoglobin s navázaným O2 (jasně světle červený) ̶ Karboxyhemoglobin, karbonylhemoglobin (navázaný CO) „karmínově“ červený, od 50% saturace CO nastává porucha vědomí ̶ Karbaminohemoglobin (navázaný CO2) váže se na N konec řetězce na amino skupinu (temně červený), od 5% CO2 ve vdechovaném vzduchu porucha vědomí – zhoršuje vazbu O2 na hemoglobin ̶ Methemoglobin, metHb (oxidované železo, Fe3+) neváže O2, tmavý „čokoládově“ hnědý, 1-3% jsou normální, 70 % smrtelné ̶ Glykovaný hemoglobin – na řetězec se váže glukoza – odráží dlouhodobou hladinu cukru v krvi (glykémii) – norma do 4 mmol/l, zvýšená u nekompenzovaného diabetu Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity11 Deriváty hemoglobinu – oxy a deoxyhemoglobin venózní odkysličená krev arteriální okysličená krev Spektra jednotlivých derivátů hemoglobinu Spektrum oxyhemoglobinu a karboxyhemoglobinu je podobné na vlnové délce, která hodnotí saturaci hemoglobinu kyslíkem → hypoxie způsobená otravou CO se tímto způsobem nedá zjistit, pokud na to není senzor specializovaný Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity12 Deriváty hemoglobinu - methemoglobin Krev s vysokou koncentrací metHb Normální krev Při vysoké methemoglobinémii je arteriální krev tmavší Test se provádí s okysličenou krví – čím větší je koncentrace metHb, tím tmavší je krev Barevné spektrum pro určení % methemoglobinu v krvi Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity13 Deriváty hemoglobinu - methemoglobin ̶ Vznik metHb – oxidace Hb dusitany ̶ v krvi přítomný enzym methemoglobinreduktáza - redukuje Fe+3 zpět na Fe2+ ̶ Dále neenzymatická redukce pomocí vit. C ̶ Kojenci mají nedostatečně vyvinuté redukční mechanismy (+ fetální hemoglobin snáze oxiduje) → je nutný snížený příjem dusitanů v kojenecké stravě (používání kojenecké vody) ̶ Methemoglobinémie – vrozené i získané příčiny ̶ Vrozené – porucha tvorby redukčních enzymů ̶ Získané ̶ zvýšený příjem dusičnanů a dusitanů (hnojiva) ̶ otravy (nitrobenzen, anilin) ̶ léky (benzokain, dále fenacetin, sulfonamidy) ̶ Terapie - podávání některých redukčních činidel – methylénové modři nebo kyseliny askorbové Hodnoty methemoglobinu Příznaky 0 – 2 % normální hodnota < 10 % cyanóza < 35 % cyanóza a další příznaky (bolest hlavy, dušnost) 70 % smrtelná koncentrace Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity14 Vypočítané hodnoty červené složky ̶ Objem erytrocytu (MCV, mean corpuscular volume) ̶ MCV = HCT/RBC (hematokrit/ red blood count) = 80-95 fl ̶ Množství hemoglobinu v erytrocytu (MCH, mean corpuscular hemoglobin) ̶ MCH = HGB/RBC (hemoglobin/ red blood count) = 28-32 pg ̶ Koncentrace hemoglobinu v erytrocytu (MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration) ̶ MCHC = HGB/HCT (hemoglobin/ hematokrit) = 310-360 g/l ̶ Distribuční šíře ery (RDW) = 11,5-14,5% ̶ Informuje o variabilitě ve velikosti erytrocytů ̶ ↑RDW – anizocytóza Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity15 Anisocytosis: erytrocyty rozdílné velikosti Mírná anisocytóza je fyziologická Vypočítané hodnoty červené složky HCT HGBRBC MCHC = HGB/HCTHCT/RBC = MCV MCH = HGB/RBC hematokrit muži: 140 - 180 g/l ženy: 120 - 160 g/l muži: 4,3 - 5,3 * 1012 / l ženy: 3,8 - 4,8 * 1012 / l množství hemoglobinu v ery koncentrace hemoglobinu v ery 80 - 95 fl muži: 42 - 52% ženy: 37 - 47% 310 - 360 g/l 28 - 32 pg/ery objem ery počet ery koncentrace hemoglobinu ↑MCV → makrocytémie ↓MCV → mikrocytémie ↑MCH → hyperchromní ery ↓MCH → hypochromní ery Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity17 Anémie (chudokrevnost) = nedostatek funkčního hemoglobinu v krvi ̶ Málo ery a/nebo nízký hematokrit a/nebo nefunkční hemoglobin ̶ Porucha tvorby ery (proliferace, diferenciace), zvýšená destrukce ery, nebo krevní ztráty ̶ Krvinky patří mezi nejrychleji se množící buňky v těle, a proto v krvi nejrychleji pozorujeme změny při poruše nutrice. Anémie může mít různé příčiny (získané i vrozené), zde jich uvedeme jen několik. ̶ Projevy (anemický syndrom): ̶ Tkáňová hypoxie: Bledost (pozorovatelné na konjunktivě), únava, slabost ̶ Tachykardie ̶ Zadýchání se při námaze Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity18 Sideropenická anémie: ̶ Způsobená nedostatkem Fe2+ → nedostatečná tvorba hemoglobinu → hypoxie tkání stimuluje tvorbu erytropoetinu → zvýšená tvorba erytrocytů s nedostatečným množstvím hemoglobinu ̶ Mikrocytární hypochromní anémie ̶ ↓MCV a ↓MCH, RBC vyšší nebo nezměněn ̶ Erytrocyty jsou malé, světlé, hemoglobin je jen na krajích ery Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity19 Megaloblastická anémie ̶ Přítomnost megaloblastů (nadměrně velkých nezralých erytrocytů) v kostní dřeni a snížený počet retikulocytů v periferní krvi ̶ Makrocytární hyperchromní anémie (↑MCV, ↑MCH, ↓RBC ) ̶ Malý počet velkých erytrocytů se zvýšeným obsahem hemoglobinu ̶ Vzniká v důsledku nedostatku vitamínů B12 a kys. listové - důležité pro metylaci uracilu na tymin ̶ ↓ B12 a kys. listová → ↓tvorba DNA, zatímco syntéza RNA a bílkovin je neporušena ̶ Zásoba B12 – roky; kys. listové – měsíce → projevy hypovitaminózy se zpožděním ̶ Perniciózní anémie - nejčastější typ megaloblastické anémie ̶ Autoimunitní onemocnění narušující vstřebávání B12 ̶ Autoimunitně poškozené parietální buňky žaludeční sliznice netvoří vnitřní faktor, který je nezbytný pro vstřebání B12 (porucha tvorby faktoru může být i důsledek operace žaludku) Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity20 Megaloblastická anémie megaloblast Megaloblastická anémie Normální krevní nátěr Ery jsou větší, hyperchromní, nemají tak výrazný světlý střed jako normální ery a je jich málo (+přítomnost hypersegmentovaných neutrofilů) erytrocyt neutrofil Megaloblastická anémie Normální krev Přítomnost nadměrně velkých nezralých erytrocytů (megaloblastů) v kostní dřeni Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity21 Krevní skupiny Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity22 Antigeny a protilátky krevních skupin ̶ Krevní skupiny se určují podle antigenů na membráně erytrocytu ̶ Tyto krevní znaky se dědí a jsou neměnné během celého života ̶ Lehký úvod do obecných principů imunizace ̶ Antigen je „rozpoznávací značka“, podle které imunitní systém určí, zda se jedná o buňku vlastní či cizí ̶ Pokud se imunitní systém poprvé setká s cizorodým erytrocytem v krvi, začne si vytvářet protilátky proti cizím antigenům na erytrocytu (ale ne proti těm antigenům, které jsou stejné, jako ty na vlastních ery). Cizí antigen si zapamatuje a při dalším setkání protilátky vytvoří rychleji. ̶ Pokud jsou v krvi protilátky proti určité krevní skupině, erytrocyt této krevní skupiny spustí imunitní reakci → destrukce cizorodé krvinky (hemolýza) ̶ Nejdůležitější krevní skupiny jsou AB0 a Rh ̶ Protilátky AB0 systému jsou v krvi od prvních měsíců života ̶ Protilátky proti Rh faktoru a jiným skupinám s tvoří až po imunizaci nekompatibilní krví nežádoucí imunitní odpověď při opakovaných transfuzích ne plně kompatibilní krve ̶ Existují desítky dalších systémů, na které je potřeba brát ohled z imunologického hlediska (systémy MNS, Kell, Lewis, Kidd,…) Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity23 Systém AB0 ̶ Antigen na povrchu ery (aglutinogen): A, B ̶ Protilátka v krvi (aglutinin): anti-A, anti-B (IgM) ̶ Neprochází placentou ̶ Aglutinace (shlukování): ̶ anti-A reaguje s A, anti-B reaguje s B ̶ Erytrocyty jsou pospojované aglutinogeny – vytváří se shluky ̶ Spustí se imunitní odpověď (aktivace komplementu), která zničí cizí erytrocyty (hemolyzuje) ̶ imunizace proti A a B je v průběhu prvních měsíců života (tyto antigeny jsou přítomné ve stravě) – aglutininy pak jsou přítomné v krvi po zbytek života ̶ Při podání nekompatibilní krve – silná aktivace imunitního systému, hemolýza, anémie, hemoglobinurie (hemoglobin v moči), selhání ledvin, …smrt aglutinogen na erytrocytu aglutinin Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity24 Systém AB0 ̶ Antigen na povrchu erytrocytu (aglutinogen): A, B ̶ Protilátka v krvi (aglutinin): anti-A, anti-B (IgM) Krevní skupiny Skupina A Skupina B Skupina AB Skupina 0 Zastoupení v ČR 41% 18% 9% 32% Erytrocyty Antigeny na erytrocytech A B A a B žádné Protilátky v krvi anti-B anti-A žádné anti-A a anti-B 25 Rh faktor ̶ Antigeny D, d (také C,c, E, e, které jsou slabší) - přítomné jen na erytrocytech ̶ Nejsilnější je D – je-li přítomno → krevní skupina Rh+ ̶ V případě recesivních homozygotů (dd) → krevní skupina Rh- (17% v Evropě, jinde <1%) ̶ u Rh- krve vznikají protilátky (anti-D, IgG) až po imunizaci ̶ Krev Rh- se musí setkat s krví Rh+ ̶ První reakce je slabší, další setkání s Rh+ vyvolá silnější imunitní odpověď → hemolýza ̶ Možnosti imunizace: ̶ Transfuze nekompatibilní krve – Rh- příjemce dostane Rh+ krev ̶ Porod (potrat, interrupce, krvácení z placenty, invazivní zákroky), kde matka je Rh- a plod Rh+ ̶ Imunizace se projeví až během dalších těhotenství této kombinace – IgG protilátky procházejí přes placentu a napadají krev plodu → hemolýza krve → anémie → zvýšená krvetvorba → fetální erytroblastóza (více erytroblastů - nezralých ery) ̶ nekonjugovaná hyperbilirubinemie (ikterus), anémie, hydrops (otok tkání kvůli hypoxii), smrt ̶ Prevence – po porodu (či jiné události) podání anti-D – zajistí Rh- ery dřív, než si jich všimne imunitní systém matky Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity26 Určení krevních skupin sklíčkovou metodou ̶ Na podložní sklíčko kápneme protilátky anti-A, anti-B a kombinaci anti-A a anti-B ̶ Nebo se použijí séra krevních skupin A (obsahuje anti-B), B (anti-A) a 0 (anti-A, anti-B) – sérum je krevní plazma bez koagulačních faktorů, obsahuje příslušné aglutininy ̶ protilátky smícháme s kapkou krve (séra mezi sebou se nesmí promíchat) ̶ Pozitivní výsledek je v séru, kde došlo k aglutinaci (shlukování) anti-A anti-B anti-AB - + + Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity27 Přiřaďte krevní skupiny k výsledkům testu anti-A anti-B anti-AB 1 anti-A anti-B anti-AB 2 anti-A anti-B anti-AB 3 anti-A anti-B anti-AB 4 anti-A anti-B anti-AB 5 Fyziologický ústav, Lékařská fakulta Masarykovy univerzity28 Výsledky sklíčkové metody anti-A anti-B anti-AB B anti-A anti-B anti-AB A anti-A anti-B anti-AB AB anti-A anti-B anti-AB 0 anti-A anti-B anti-AB špatná séra