Prof. MUDr. Jaroslav Masopust, DrSc. 2. lékařská fakulta UK Praha, Ustav klinické biochemie a patobiochemie ŽIVOT jako DĚDIČNÉ SMRTELNÉ ONEMOCNĚNÍ přenášené POHLAVNÍMI BUŇKAMI (Klinické projevy stárnuti stáří a choroby, horméza, regenerace a kmenové buňky, oxidační a antioxidační mechanismy, nádorová proliferace, výjimečnost lidského mozku) - 3. část 4. Klinické projevy stárnutí U žen je to známá menopauza jako důsledek vyhasínání funkce vaječníku. Menší pozornost má obdobný proces u mužů (vizobrázkyl9,20,21,22). Stáří a choroby „Stáří není nemoc, ale nebývá bez chorob." Snížená funkce orgánů u starších jedinců vede k vyššímu výskytu některých chorob (Obr. 23). Podle N. Lane {Lane N., 2003) stárnutí je spíše funkcí vzrůstajícího intracelulárního oxidačního stresu než postupujícího věku jedince. Na druhé straně však únik „volných radikálů" (ROS) z mitochondrií se zvyšuje s věkem. Mitochondriální únik ROS navozuje genetickou odpověď způsobenou předcházejícími infekcemi (nebo většími stresy); tento únik však stále pokračuje a tím i odpověď, tj. zvýšená exprese genů na kritický redox-signál (nevyváženost mezi produkcí ROS Klinické projevy stárnutí Ženy - menopauza (vyhasínání funkce vaječníku) Muži (po 40 r.) - andropauza (testosteron) - 20 % 60-80 let psycholog, problémy, únavnost, slabost, úbytek svaloviny a kostní hmoty, porucha hematopoeze, Oligospermie, sexuální dysfunkce, podrážděnost, úzkost, nespavost, porucha paměti, snížení kognitivních funkcí - adrenopauza (dehvdroepiandrosteron DHEA) - somatopauza (GH/IGF-1. melatonin) Obr 19: Klinické projevy stárnutí u žen a u mužů 4 Labor Aktuell 03/09 SARKOPENIE (úbytek svalové hmoty) - za každou dekádu o 2,5 až 5,0 kg (úbytek aktivní tělesné hmoty) - zvyšuje se hmota neaktivní - úbytek o 10 % —>- snížení imunity - snížení výdeje energie (základ rozvoje obezity) - pohybová inaktivita vede k atrofii svalových vláken (znamená to „šlápnutí na klouzačku, z níž je nesnadné vystoupit") - k oslabování svalu dochází, není-li pravidelně zatěžován na hladině 70 - 90% maxima Obr 20: Projevy sarkopenie (úbytek svalové hmoty) OSTEOPORÓZA (úbytek kostního minerálu) Postmenopauzová (nedostatek estrogenů —► potlačení životnosti osteocvtů. nedostetečná odpověď osteoblastů na mechanické podněty a opravy mikropoškození při stárnutí) *SenÍlní(převaha osteoresorpce nad osteoprodukcí) Potenciace osteoklastogeneze (změna v interakci mezi RANKL- RANK- osteoprotegerin) Tvorba kosti vyžaduje: (1) osteoinduktivní signály, (2) schopnost buněk reagovat na signály Morfogenní proteiny a nadrodina TGF Qsteoresorpci potlačuje: kalcitonin (inhibuje osteokiasty, ale nepotlačuje tvorbu kolagenu osteoblasty) aminobisf OSfonáty snižují kostní remodelaci potlačením a apoptózou osteoklastů raloxifen (agonista estrogenů) Obr 21: Projevy osteoporózy (úbytek kostního minerálu) Stárnutí EPIDERMIS (POKOŽKA) Morfologie: oploštění dermis-epidermálních spojení FAS/FASL-apoptóza: ztenčování epidermis, pokles proliferace a nárůst apoptózy buněk pod granulami vrstvou Stárnutí vlasů Cyklická rekonstrukce intaktní jednotky pigmentového vlasového váčku je shodná na celé vlasové pokrývce, a to v prvních 10ti vlasových cyklech ti. asi do 40 let věku Pak se nastává geneticky regulované vyčerpávání pigmentové potence jednotlivých foliklů a tvorba šedivých až bílých vlasů; úbytek pigmentu navozuje nejprve snížení aktivity tyrosinasy v melanocytech vlasového bulbu, po té suboptimální interakce mezi kortikálními keratocyty a melanocyty a defektní migrace melanocytů z rezervoárů v horních vrstvách kořínků do pigmentovaných oblastí rozruší normální funkci celé vlasové jednotky, významnou roli hraje zvýšení ROS a snížení anti-ROS potenciálu s poškozováním nukleární a mitochondriální DNA Obr. 22: Stárnuti epidermis a anti-oxidačním systémem) perzistuje, což vede k chronickému stresovému stavu, charakteristickému pro vyšší věk. Strašákem seniorů je Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba. Alzheimerova choroba je neurodege-nerativní onemocnění především starších jedinců projevující se progresivní ztrátou paměti a demencí. Depozity amyloidu p (Ap) a vytváření neurofibrilárních smotků způsobuje progresivní zánik neuronů. Parkinsonova choroba je neurodege-nerativní onemocnění neuro-melanin obsahujících neuronů mozkového kmene (pars compacta substancia nigra). Při ztrátě striátového dopaminu o 80 % dochází k zhoršujícím se klinickým projevům jako je akineze, rigidita, klidový třes. Příčina j e multifaktoriální s genetickou predispozicí: exogénni ainterní (l-methyl-4-fenyl-l,2,3, 6- tetrahydropteridin-like faktor nebo OC-synuklein), toxiny a faktory stárnutí, de-plece DGNF (nervový růstový faktor glio-vých buněk) a především oxidační stres (substancia nigra obsahuje relativně málo glutathionu bránícímu účinku reaktivních forem kyslíku) iniciují zánětlivou reakci neuroglie vedoucí v konečném důsledku k zániku postižených motorických neuronů. (Obr.25) S postupujícím věkem dospělých jedinců se snižují funkce řady orgánů, u někoho pomaleji u jiného rychleji. Jako měřítko „úspěšného stárnutí", tj. bez výskytu závažnějších zdravotních nedostatků, byla doporučena hodnota cystatinu C. Jeho stanovení se používá jako měřítko funkce glomerulů; zřejmě odráží nejen dlouhodobé zvýšení krevního tlaku, ale má tímto i vliv na kardiovaskulární systém a kognitivní funkce (Guralnik JM, 2008). Stárnutí a imunitní systém Je všeobecně známo, že stárnutím ubývá na imunitní obraně organismu {De La Fuente M., 2002). Nejvíce bývá postižena imunita zprostředkovaná buňkami, což se projevuje hlavně na funkci T-lymfocytů (snížení proliferační aktivity a produkce IL-2). Přitom nespecifická imunitní odpověď nebývá dotčena. Není tomu však u všech jedinců. Ti, kteří mají zachovanou dobrou imunitní odpověď, se dožívají vyššího věku. Poruchy v imunitním obranném mechanismu se kladou na vrub zvýšenému oxidačnímu stresu. Labor Aktuell 03/09 5 *Hyperparaty re óza *Hypotyreóza *Poruchy imunity *Monoklonální gamapatie *Mnohočetný myelom "Degenerace makuly * M.Alzheimer * Ateroskleróza ICHS, AMI, iktus nefropatie * Nádory * Katarakty * Diabetes typ 2 * Osteoporóza * M. Parkinson Obr 23: Nejčastější choroby vyššího věku Mechanismus poškození neuronů u Alzheimerow chorolr Jejich přítomnost ovlivňuje hodnoty biochemických testů astrocyt GluTrans zaniklá buňk Obr 24: Schéma mechanismu vzniku Alzheimerovy choroby 5. Reparace a regenerace V průběhu života jedince buňky některých tkání jednak zanikají ajednak vznikají nové (regenerace), některé existují po celý život. Udává se, že tkáně lidského jedince se v průměru obnoví za každých sedm let. Je to zkreslený údaj; jsou značné rozdíly mezi buňkami různých tkání (orgánů). Kupř. velmi rychle se obnovují epitelové buňky tenkého střeva (každých 24-48 hodin), rovněž tak parietální buňky žaludeční sliznice; epitelové kožní buňky se obnovují v průměru během tří týdnů, životnost červených krvinek je 120 dní, hepatocyty se obnovují po sedmi měsících; kardio- myocyty v množství 1 % za rok ve věku 25 let a pouze 0,45 % v 75ti letech {Bergmann O., 2009). Buňky nervové se po narození neobnovují vůbec, j en ve velmi malém počtu v 1. roce života. Získané informace uložené v cytoplasmě neuronů v průběhu ontogeneze by jejich zánikem zanikly také. Zánik pro organismus nepotřebných nebo „opotřebovaných" buněk se děje pochodem, nazývaným apoptóza. Jde o proces, který probíhá v organismu nepozorovaně a je programovaný, narozdíl od násilného zániku buněk způsobeném škodlivinou, který se nazývá nekróza. Ta navozuje větší nebo menší odpověď orga- nismu (lokální nebo celkovou). Obrazně řečeno: apoptózu můžemepřirovnatkja-kési „eutanázii buňky" a nekrózu k „buněčné vraždě". Za „odklízecí četu" proteinových molekul j e možno považovat ubikvitin-prote-asomový systém nazývaný také multika-talytický proteinázový komplex. Jde 0 velmi důležitou extralysozomální degradaci nepotřebných proteinů v eukary-ontních buňkách. Odstraňují se takto kupř. klíčové proteiny důležité při regulaci cyklu buněčného dělení (cykliny aktivující cyklin-dependentní kinázy), které splnily momentálně svoji úlohu, a další proteinové faktory umožňující vývoj plodu, diferenciaci, apoptózu, genovou transkripci, signální transdukci, stárnutí, zánětlivou nebo stresovou odpověď. Oxidované proteiny jsou přednostně degradovány 20S-proteasomovým komplexem nezávislým na přítomnosti ATP, kdežto proteiny označené ubikvitinem a polypeptidy jsou degradovány 26S-proteasomem, který potřebuje ATP. Lysozomy jsou dalším místem, kde dochází k degradaci proteinů proteolýzou. 1 tato dráha je aktivována stárnutím buněk. Akumulace lipofuscinu, což je agregát oxidovaných proteinů a lipidů, který tvoří typické inkluze ve stárnoucích buňkách, ovlivňuje lysozomální aktivitu. Opravné mechanismy začínají už při poškození jaderné DNA (Obr. 26). Dalším důležitým mechanismem, který ovlivňuje přenos genetické informace, je interference RNA (RNAi). Efektorovou molekulou j e soubor tzv mikroRNA (miRNA = RNA), cožjsoukrátké (19 - 24 bází) nekódující úseky RNA, které post-translačně regulují genovou expresi. V lidském genomu bylo identifikováno asi 300 molekul různých miRNA. Tímto mechanismem lze rovněž zabránit uplatnění škodlivých alterací v DNA. Udržování buněk ve funkčním stavu a jejich regenerace Děj e se tak za pomoci mechanismu nazývaného hormesis. Aplikace hormézy v aktivitách ovlivňujících stárnutí respektive zpomalujících stárnutí je založena na hypotéze, že biologické stárnutí spočívá na progresivním selhávání homeodynamiky (Suresh I.S. Rattan, 2006). Se vzrůstajícím věkem se hromadí narůstající alterace nuk- 6 Labor Aktuell 03/09 (1 - methyl -4 -fenyl-1,2,3,6 -tetra- MPTP hydropteridin) ■ 5-OHDA Jiné toxiny: a-synuklein MPP+ (1-Tiethyl-4-fenyl-pyridinium) ^ dopamin 02*" H2Oz Zvýšení ROS Oxidační stres Lipoperoxidace Poškození DNA Respirační mitochonfrie řetězec —>. Inhibice komplexu I Vzestup ROS/ pokles ATP Vzestup aktivity Cy C Vzestup intracel. Ca2+ APOPTOZA Obr 25: Schéma mechanismu vzniku Parkinsonovy choroby A T_ C G*t» T A T — A T — G U — G C— C Gsr T A A c OH -0 C G G C T A A G G C C G T A G C T A-G C- V Přímá obnova poškození Oprava baze vystřižením Oprava nukleotidu vystřižením Oprava „mis-match" chyby (chybného párování bazí) Oprava přerušení jednoho vlákna Oprava přerušení dvojvlákna Obr. 26: Schéma opravných mechanismů poškozeného úseku DNA leových kyselin, proteinů a lipidů. Neschopnost udržovat tyto molekuly ve funkčním stavu a porucha mechanismů jejich obnovy ve stáří značně stoupá. Tuto nepříznivou situaci zlepšuje krátké vystavení buněk i celého organismu mírným stresovým podnětům, které navodí expresi genů produkujících faktory, které pozitivně ovlivňují mechanismy údržby a reparace buněk. Indukce stresové odpovědi se děje prostřednictvím transkripčních faktorů reagujících na tepelný šok (heat shock transcription factors — HSF), působících jako zprostředkovatelé mezi environmen- tálním stresem a stresovou odpovědí buněk (organismu). U obratlovců byly identifikovány čtyři různé HSF (HSF1 až HSF4). Tyto transkripční faktory aktivují v buněčném jádře geny kódující produkci proteinů teplotního šoku (heat shock proteins — HSP). HSP u savců tvoří rodiny členů, které se liší mírou inducibility intracelulární lokalizací a funkcí (jako cha-perony nebo proteázy). Úloha chaperonů spočívá v renaturaci „rozbalených" (un-folded tj. částečně denaturovaných) molekul proteinů. Na ty, které nelze takto opravit, působí proteázy, pomáhající denaturované proteiny odstranit. Na bifázický efekt při aplikaci různých látek (kupř. jedů) upozorňoval už Paracel-sus, když konstatoval, že každá látka se může stát j edem, záleží j en na množství podané dávky. Přitom v určitém malém množství může působit i blahodárně (Obr. 27). Hormetický efekt (bifázický účinek) se netýká jen podávaných chemických látek (nebo nutrientů), ale též různých aktivit organismu, přísunu a výdeje energie a také vlivu vnějšího prostředí (Tab. 4). Na rozdíl od mírného stresu nadměrný stres (!!) způsobuje urychlení stárnutí (viz Obr. 28) (Ben-Porath I., 2004). K tomu se váže další termín - allostasis, což je nastavení organismu na hraniční hodnoty zátěže (stresoru), které mají ještě schopnost pomocí regulačních mechanismů ustát a adaptovat se i na větší změny prostředí, tj. udržet stabilitu organismu při větších a dlouhodobých změnách prostředí. Porušená alostáza je charakterizována výrazně zvýšenou stresovou odpovědí a pomalým návratem k normě. (Tab. 4) Mírný stres navodí aktivaci transkripčních faktorů jako jsou faktory odpovědi na teplotní šok (heat shock factors = HSFs) a jejich translokaci do buněčného jádra, kde iniciují expresi genů teplotního šoku s následnou transkripcí a preferenční translací a tvorbou proteinů teplotního šoku (HSP). Optimální odpověď na mírný stresor prostřednictvím syntézy a aktivity HSP je nezbytná pro přežívání buněk. Na druhé straně nedostatečná nebo pozměněná odpověď navozuje abnormální růst a vývoj, stárnutí a apoptózu. Když na buňky začne působit stresor, projeví se to ve změnách cytoskeletonu a cytoplazma-tických struktur, morfologii buněčných povrchů, celulárním redox-stavu, syntéze DNA, proteinovém metabolismu a na stabilitě buněčných bílkovin. Stres vyvolává molekulové poškození, zejména abnormální poskládání polypepti-dového řetězce proteinů, které mohou agregovat a navodit kaskádu stresové odpovědi (Rattan S., 2006). Na stresovou odpověď buněk možno nahlížet jako na adaptivní reakci, jejímž účelem je ochrana a uchování jejich strukturální a funkční integrity. Pravidelná mírná tělesná námaha (Ra-dakZ., 2008) zlepšuje kardiovaskulární systém stimulací adaptačních mechanis-můjako je produkce NO (vazodilatace), zvyšuje objem svalové hmoty a ovlivňuje Labor Aktuell 03/09 7 účinek 11 \ příznivý nepříznivý dávka Obr 27: Bifázický efekt při podání určité látky v různém množství HORMETICKÉ BUNĚČNÝ STRES. FAKTORY SIGNALIZACE HORMETICKÉ EFEKTY Životní styl Pohyb Restrikce energie Strava Mentální cvičení Volné radikály Tok iontů Deplece energie i Antioxidanty Superoxiddismutasa Katalasa Glutathionperoxidasa Expozice zevních škodlivin toxiny, radiace teplota 1— voda i Receptory k Kinázy, fosfatázy y deacetylázy 1 Proteinové chaoeronv HSP-70 GRP-78 Expozice vnitřních faktorů Ischemie Endokrinní faktory neurotransmitery Transkripční faktory Nrf-2 FOXO, CREB NF-kB Růstové faktory BDNF, VEGF bFGF Mitochodr. proteiny Ca-reg. faktory Tab. 4: Hormesis (indukující faktory, mechanismus, následné účinky) pozitivně rezistenci vůči stresu. Ukázalo se, že pravidelná tělesná cvičení snižují incidenci Alzheimerovy choroby zvýšením tvorby neurotrofinů jako je nervový růstový faktor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dochází k aktivaci IGF-1 nebo Ca-kalmodulinové proteinki-názy II. Hormetický účinek na mentální zdraví lze navodit nejen cvičením, plaváním ale též zdravou dietou a správným životním stylem (Gomez-Pinilla R, 2008). Regenerace pomocí kmenových buněk Pro regenerační medicínu by se z teoretického hlediska hodily nejlépe embryonální kmenové buňky, které se vyznačují omni-potencí (pluripotencí), to znamená, že z nich mohou vzniknout všechny buňky určitého jedince, kupř. kdyby byly k dispozici skladované buňky z oplodněného vajíčka jednoho z identických dvojčat. Toto není v humánní medicíně reálné, proto jsou hledány jiné cesty, kupř. reprogra-mování somatických buněk, které by tak získaly vývojový program (pluripotencí) embryonálních kmenových buněk. Byly hledány způsoby, jak buňky s pluripotent-ními vlastnostmi připravit z buněk tkání daného jedince i v dospělosti. Jednou z takových technik je příprava indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS). Princip spočívá v simultánním vnesení definovaných transkripčních faktorů aktivujících vývojový embryonální program pomocí retrovirových vektorů (kupř. Okita K., 2007 nebo Yamanaka S., 2007). Tento způsob ale má potenciální nebezpečí mutageneze (nepředvídatelné genetické dysfunkce). Jsou proto hledány další modifikace. Jednou z velmi slibnýchje repro-gramování somatických buněk za použití polycistronového vektoru (Carey BW, 2009). Reprogramování spočívá v non-virové transfekci multiprotein exprimující-ho vektoru (vazba na 2A peptidy), který kóduje sekvenci čtyř transkripčních faktorů (Oct3/4, Sox2, c-Myc a Klf4) charakteristických pro pluripotencí embryonálních kmenových buněk, do genomu somatických buněk (kupř. fibroblastů nebo kera-tocytů). Kombinací tohoto non-virového vektoru s „piggyBac transposonem" se výrazně zvýšila exprese potřebných mar-kerů pluripotence. Vysoce diferencované savčí buňky jakou jsou kupř. kardiomyocyty nejsou schopny dále se dělit; jsou-li poškozeny (akutní infarkt myokardu), neregenerují a jsou nahrazeny jizvou. Naproti tomu embryonální a fetální kardiomyocyty si schopnost proliferovat udržují. Nedávno (Engel FB, 2005) bylo v experimentu prokázáno, že ovlivněním jednoho z regulačních faktorů cyklu buněčného dělení, kterým je p38 MAP-kináza, lze navodit proliferaci též u dospělých savčích kardiomyocytů. Faktorp38 je negativní regulátor exprese genů působících na mitózu, jako jsou cyk-liny A a B. Aktivita kardiospecifického p38anepiímo koreluje s proliferaci kardiomyocytů v embryonálním a fetálním období. Tyto experimenty prokazují, žeje možné ovlivnit potlačenou proliferaci buněk srdečního svalu, navodit jejich dedi-ferenciaci (návrat do embryonálního stádia) a umožnit jejich regeneraci v poškozeném místě aplikací látek inhibujících faktor p38. Srdeční tkáň obsahuje také malý rezervoár kmenových a progenitorových buněk (Barile L., 2007; Roccio M, 2008) prokazatelné přítomností charakteristických markerů j ako je c-Kit, Sca-l,Isl-l nebo MDR-1 s regeneračním potenciálem. Toto otvírá novou terapeutickou strategii - kardiomyoplastiku. která by mohla být využita pro obnovení poškozeného myokardu. Pokračování příště 8 Labor Aktuell 03/09