Jméno, Obor datum
skupina
POZOROVÁNÍ KVASINEK, VITÁLNÍ TEST
Úvod: Vitální test slouží ke stanovení procenta živých a mrtvých buněk (důležité např. při
stanovení jakosti pekařského droždí nebo kontrole pivovarských kvasnic). K vitálnímu testu
se používá methylenová modř, která zbarví mrtvé buňky modře, živé zůstávají nezbarveny.
Pomůcky: Bürkerova komůrka, Erlenmeyerovy baňky, zkumavky, pipety, krycí sklíčko, Pasteurova
pipeta, mikroskop
Chemikálie: methylenová modř (R6), sterilní voda
Postup: 1) 0,5 ml zásobní kultury kvasinek z pekařského droždí napipetujeme do 5 ml
sterilní vody v Erlenmeyerově baňce.
2) Z Erlenmeyerovy baňky pipetujeme do čtyřech zkumavek po 1 ml suspenze. První
zkumavku ponecháme při laboratorní teplotě, ostatní umístíme do horké vodní lázně ­
druhou zkumavku na 5 minut, třetí na 10 minut a čtvrtou na 15 minut. Po vyjmutí
zchladíme studenou vodou.
3) Provedeme stanovení počtu živých a mrtvých buněk v jednotlivých zkumavkách. Do
prohlubně Bürkerovy komůrky naneseme kapku suspenze a zakryjeme krycím sklem.
K okraji krycího skla kápneme kapku methylenové modři.
4) Pozorujeme pod mikroskopem při vhodném zvětšení. Stanovíme počet živých a mrtvých
buněk v deseti čtvercích. Buňky ležící na levé a spodní straně do počtu buněk
zahrnujeme, buňky na pravé a horní straně ne. Postup opakujeme pro suspenze kvasinek v
jednotlivých zkumavkách.
5) Stanovíme koncentraci buněk v Erlenmeyerově baňce a sestrojíme graf závislosti
přeživších kvasinek na čase, po který byly vystaveny zvýšené teplotě.
Obrázek: čtvereček Bürkerovy komůrky
1/25 mm2
(objem 1/250)
1/100 mm2
1/400 mm2
Tabulka:
čas [min]
počet živých b.
v 10 čtvercích
počet mrtvých b.
v 10 čtvercích
celkový počet b.
v 10 čtvercích
přežívající b. [%]
0 68 4 72 94
5 47 17 64 73
10 43 25 68 63
15 26 40 66 39
Graf: Graf závislosti počtu přeživších kvasinek na čase, po který byly vystaveny zvýšené teplotě.
Výpočet: celkový počet buněk v deseti čtvercích ­ 72, objem nad čtverečkem ­ 1/250 mm3
,
potom 72  250  103
/ 10 = 1,8  10 6
CFU/ml
Závěr: Koncentrace kvasinek zjištěná mikroskopicky byla 1,8  10 6
CFU/ml. S prodlužující se
dobou, po kterou byly kvasinky vystaveny zvýšené teplotě, postupně docházelo k ubýtku
živých buněk.
0 5 10 15
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
čas [min]
přežívajícíbuňky[%]