Genové inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů a jejich zaváděním do organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (zejména klonování genů a jejich cílené úpravy). Objevy, které umožnily cíleně manipulovat s DNA restrikční endonukleázy a další enzymy rozštěpení DNA v přesně definovaném místě spojení dvou cizorodých DNA (DNA z různých organismů) syntéza DNA ve zkoumavce sekvencování DNA stanovení molekulární struktury genu klonování genů zavedení genu do nepříbuzných organismů (překonání mezidruhových barier) pomnožení genu do neomezeného množství cílené zavádění mutací do genu studium projevu pozměnených genů (mutace funkce) Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství 1965 – objev plazmidů 1970 – izolace prvního restrikčního enzymu 1972 – příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 – začátek klonování genů 1975 – Asilomarská konference 1977 – první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 – sekvncování DNA 1978 – příprava lidského inzulinu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně) **** mutageneze in vitro – proteinové inženýrství **** příprava transgenních organismů (rostliny, živočichové) 1980 – genové terapie 1997 – klonování živočichů Využití genového inženýrství - Základní výzkum: studium struktury a funkce genů a genomů - Praktické aplikace: Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) Genová terapie - léčba genetických chorob transformace elektroporace infekce mikroinjekce nastřelení Cizorodá DNA Klonování genů pomocí vektorů Klonování genů pomocí PCR Konstrukce (lidské) genomové knihovny © Espero Publishing, s.r.o. Soubor klonovaných fragmentů genomové DNA, které dohromady reprezentují celý genom příslušného organismu. Cizorodá DNA Klonovaná cizorodá DNA Rekombinantní molekula DNA Selekční marker Příprava rekombinantních molekul DNA Štěpení vektoru restrikční endonukleázou, spojení vektoru a cizorodé DNA enzymem DNA-ligázou Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneze Mutace se vnášejí do izolované DNA (= in vitro) typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Cílení změny aminokyselin v proteinech Příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství) Příprava transgenních organismů DNA (genotyp) fenotyp klasická genetika reverzní genetika reverzní genetika, genetika „naruby“ Mutageneze in vitro Mutageneze in vitro náhodná cílená manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneza inkorporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA oligonukleotidová mutageneza (umístění do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) záměny bazí nebo kodonů cílené změny struktury proteinů GEN mutace Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Stanovení sekvence pozměněného genu Testování funkce pozměněného genu Obecná strategie při mutagenezi in vitro Vytvoření mutace Vytváření inzercí nebo delecí v sekvenci genu Vytváření mutací v restrikčním místě exonukleáza výběr dNTP Substituce delece inzerce GGT A CTCT CCA C GAGT CCACGAGT T GGTACTCT GGTGCTCT CCACGAGT GGT A CTCT CCA T GAGT Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů Rodičovská (nemutantní) DNA Nově syntetizovaná (mutantní) DNA Nově syntetizovaná mutantní DNA Mutagenní oligonukleotid Dvojřetězcová heteroduplexní DNA mutantní homoduplex Přenos do E. coli rodičovský homoduplex „umělý“ gen Kazetová mutace Proteinové inženýrství Cíl: změna struktury a funkce proteinů prostřednictvím technologie rekombinantní DNA změny vazebných oblastí proteinů termostabilita rychlost a substrátová specifita reakcí citlivost k oxidaci a toxickým látkám Proteinové inženýrství (mutageneze in vitro) Změny primární struktury DNA (genů) prováděné in vitro 1. Izolace genu a jeho naklonování 2. Vnesení mutace (substituce bazí, delece, inzerce) manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) chemická mutageneze kazetová mutageneze 3. Stanovení aktivity pozměněného proteinu (v E. coli nebo původním hostiteli) Předpoklady pro vytváření funkčních proteinů klonovaných genů 1. Transkripce genu přítomnost funkčních regulačních oblastí pro transkripci promotor, terminátor 2. Translace přepisu genu přítomnost signálů pro translaci SD, iniciační a terminační kodon výběr kodonů pro tRNA daného organizmu 3. Posttranslační modifikace 4. Transport proteinu signální sekvence funkční v daném hostiteli Zajištění exprese cizorodých genů bakteriální gen eukaryotický gen P RBS/transport kódující oblast T P/E RBS/transport kódující oblast cDNA Syntéza DNA de novo Hybridní (chimerický) gen Fúzní protein zralý proteinštěpení, purifikace Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin (preprohormon) proinzulin (prohormon) aktivní inzulin (zralý hormon) DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B Beta-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu Příprava podjednotkové vakcíny viru hepatitidy B (HBV) ve kvasinkách Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské CDRs -complementarity determining regions Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou Přenos cizích genů do rostlin pomocí Ti-plazmidu Živné medium s růstovými faktory Transgenní rostlina přenášející geny do potomstva Protoplast disky Ti-vektor nesoucí cizí gen T-DNA Product Company Therapeutic indication Date approved Table 26.1 (cont´d) Využití genového inženýrství u rostlin A. Potraviny a krmiva Ovlivňování agronomických vlastností Rezistence k herbicidům Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.) Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd) Modifikace posklizňových vlastností Prodloužení skladovatelnosti Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám Vylepšování nutriční hodnoty a chuti Využití genového inženýrství u rostlin B. Produkce sekundárních metabolitů Studium a přenos genů pro klíčové enzymy biosyntetichých drah Farmakologické přípravky C. Technické plodiny Produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití Biodegradovatelné plasty D. Fytoremediace Transgenní rostliny A. Rezistence k virům Zavedení genu pro plášťový protein VTM do Ti-plazmidu, přenos do tabáku, rajčat Vakcína je multivalentní, působí na jiné virózy B. Rezistence k pesticidům Vnesení genu pro endotoxin z Bac. thuringiensis působícího na hmyzí škůdce (BT-rostliny: kukuřice, tabák, brambor, aj.) Nepřímý způsob – naklonování genu pro tvorbu toxinu do bakterií kolonizujících rostliny (listy, kořeny) – např. Pseudomonas fluorescens C. Rezistence k herbicidům Např. glyfozátu (nejpoužívanější neselektivní herbicid) inhibuje enzymy tvorby esenciálních aminokyselin 1. Vnesení genu pro tvorbu cílového enzymu (větší množství zajistí odolnost rostlin) 2. Vnesení genu pro tvorbu pozměněného (méně citlivého) enzymu 3. Vnesení genu pro tvorbu enzymu, který inaktivuje herbicid Transgenní rostliny D. Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově Rajče FlavrSavr fy Calgene – transgen: antisense mRNA genu pro polygalakturonidasu – prodloužená konzumní zralost Rýže – vhodná pro alergiky Řepka – olej ze semen obsahující zvýšený podíl kys. Laurové (mýdla a detergenty) Řepka – olej ze semen bohatý na myristát (kosmetika) nebo kys. Eruková (mazadla a výroba nylonu) Arabidopsis a řepka – tvorba biodegradovatelných polymerů v chloroplastech využitelných jako plasty (polyhydroxybutyrát, polymery podobné polyesteru ve vláknech bavlníku) E. Produkce vakcín rostlinami Syrová zelenina obsahující antigen (vakcínu), který indukuje tvorbu imunoglobulinů mukózního imunitního systému v zažívacím traktu Povrchový antigen viru hepatitidy B Podjednotka B toxinu cholery Bt-rostliny Rostliny rezistentní k hmyzím škůdcům Promotor Ligace Binární vektor Terminátor Bacillus thuringiensis Klonovaný gen pro toxin Štěpení restrikčními enzymy Fragment genu kódující aminokyseliny 454-615 Přenos do Agrobacterium Infekce rostlin Regenerované transgenní rostliny exprimující vysoké hladiny Bt toxinuNapadení larvami hmyzu List z rostliny, usmrcující larvy, zůstává nepoškozen List z kontrolní rostliny je napaden Syntetický gen pro toxin kódující aminokyseliny 1-454 Cíle studia přenosu genů do živočišných buněk 1. Studium funkce genů a způsobu jejich regulace 2. Příprava transgenních organismů studium fungování genů v rámci celého organismu příprava živočichů s cíleně upravenými geny modely pro studium genetických chorob příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi, vytváření cizorodých proteinů hledání možností pro genovou terapii Způsoby přenosu cizích genů do savčích buněk DNA klonovaná ve vektoru nebo infekce virovým vektorem Sledování exprese mRNA v žabích oocytech Projádro transfekce DNA (Ca-korecipitace, elektroporace) Buňky ve tkáňových kulturách embryonální kmenové buňky infekce rekombinantním retrovirem náhrada jader Transgenní zvíře (+/- mozaikové) Začlenění DNA homologní rekombinací Selekce a přenos do blastocyst mikroinjekce DNA vývoj embrya v náhradní matce blastocysta infekce rekombinantním retrovirem mikroinjekce DNA Příprava transgenních savců Vytváření transgenních myší mikroinjekcí cizího genu do oplozeného vajíčka DNA SV40, tkHSV, lidský inzulin, B-globin, interferon Důkaz transgenu, např. PCR, in situ hybridizací Úspěšnost uchycení 10-30% exprese umlčení Až 40% potomstva obsahuje transgen začleněný náhodně, obvykle tandemově ve více kopiích v jednom chromozomu Manipulace s embryonálními kmenovými buňkami Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Vnesení genů Vrstva ibroblastů, LIF Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Příklady transgenních živočichů Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv) Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky) Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a farmakologii) Ovce s vylepšenou srstí Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny studium lidských genetických poruch: neurodegerativní, imunitní, hormonální choroby, vliv faktorů na organismus faktorů (např. léků, mutagenů) studium poruch paměti Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty) orgány s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních (animal farming: zvířata jako bioreaktory) „animal farming“ Příklady látek vytvářených v transgenních zvířatech Antikoagulans krveLidský protein Cprase Léčba cystické fibrózyRegulátor CFTRovce, myš Léčba nanismuLidský růstový hormonkoza Náhražka krve při transfúzihemoglobinprase Navození srážení krveFaktor pro srážení krve VIII, IXovce Rozpouštění krevních sraženinTkáňový aktivátor plazminogenukoza Léčba rozedmy plicAlfa-1-antitrypsinovce VyužitíLátkaZvíře Klonování savců Možné způsoby léčby genetických onemocnění 1. Úprava diety - karenční terapie (galaktosemie, fenylketonurie) 2. Substituční terapie (hemofilie, diabetes, nanismus) 3. Genová terapie (kauzální léčba) vnesení funkčního genu (funkční alely) do genomu cílená záměna poškozeného genu homologní rekombinací cílené usmrcování geneticky pozměněných buněk cílená inhibice exprese genů zodpovědných za genetickou poruchu Genové terapie Léčba genetických chorob dědičných nádorových Podle typu buněk, do nichž jsou geny vneseny: A. genová terapie zárodečných buněk B. genová terapie somatických buněk Podle způsobu přenosu genů: A. genová terapie in vitro (ex vivo) B. genová terapie in vivo Příklady lidských chorob podmíněných monogenně a připada-jících v úvahu pro genovou terapii v současnosti Genová terapie in vitro Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro zavádění genů do organismu 1. Snadné získání buněk z těla 2. Snadná kultivace v kulturách in vitro 3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů 4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se musí pomnožovat přetrvávat po dostatečně dlouhou dobu Kmenové buňky kostní dřeně Kožní fibroblasty Hepatocyty Myelocyty Schéma postupu při genové terapii deficience na adenozindeaminázu Schéma genové terapie melanomu Viry jako vektory nejpoužívanější v GT, velmi dobře infikují lidské buňky. Asi 70% pokusů s GT Onkoretroviry: transgen začleňují do chromozomu do dělících se buněk výhoda při léčbě nádorů (např. nádory mozku). Riziko inzerční inaktivace endogenů Adenoviry: infikují nedělící se buňky, DNA zůstává jako epizom v jádře. Jsou bezpečné, ale exprese je krátkodobá. Problém je imunogenicita. Uplatnění tam, kde je nutná vysoká exprese během krátké doby, např při léčbě rakoviny pro zabití buněk. Adenoasociované viry AAVs: Nepatogenní, schopné infekce jen s využitím adenovirů jako pomocných virů k replikaci. Integrují DNA do chromozomu na specifické místo, umožňující dlouhodobou expresi bez rizika inzerční mutageneze. Lentiviry: HIV (retrovirus) – infikují nedělící se buňky. Do chromozomu se integrují náhodně - dlouhodobá exprese. Nutnost odstranění virových genů a zachování schopnosti infikovat nedělící se buňky. Herpes simplex viry: Mají tropii pro CNS, v latentní infekci jsou epizomální, tj. dlouhodobě exprimují transgen a šíří jej do okolní synaptické sítě. Hlavní úloha: přenos genů do neuronů pro léčbu nervových chorob (Parkinsonova ch.) a tumory CNS. Zábrana exprese genů navozená protismyslovou RNA Genová terapie nádorů 1. Dodání genu: obnova funkce nádorových supresorových genů 2. Inaktivace genu: zábrana exprese aktivovaného onkogenu 3. Genetická manipulace: vyvolání apoptózy nádorových buněk 4. Modifikace nádorové buňky tak, aby byla více antigenní a byla zničena imunitním systémem 5. Modifikace dendritických buněk ke zvýšení nádorověspecifické imunitní odpovědi 6. Použití geneticky upravených onkolytických virů selektivně usmrcujících nádorové buňky 7. Genetická modifikace nádorových buněk zajišťující konverzi netoxického prekurzoru na toxický produkt Příklady léčby nádorů pomocí genové terapie Použitá strategie genové terapie Genová terapie in vivo Do nádoru jsou injikovány buňky, do nichž byl in vitro vnesen retrovirový vektor, který obsahuje gen pro tymidinkinázu (TK). Vektor se uvolňuje a infikuje okolní nádorové buňky, v nichž se pak vytváří TK (retrovirus je schopen infikovat jen dělící se buňky!). Do těla pacienta je intravenózně podána netoxická látka gancyklovir (gcv), která je TK konvertována na toxický gcvtrifosfát usmrcující buňky.