TANDEMOVÁ AFINITNÍ PURIFIKACE JAKO METODA STUDIA PROTEIN-PROTEINOVÝCH INTERAKCÍ Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D. Oddělení funkční genomiky a proteomiky, ÚEB Jana Majerská Obsah  Tandemová afinitná purifikácia  Materiál  Metódy  Výsledky a diskusia  Literatúra Tandemová afinitná purifikácia  univerzálna metóda izolácie proteínových komplexov za natívnych podmienok  vyvinutá v roku 1999 Rigaut a kol.  dvojkroková purifikácia na imunoafinitných kolonách  značenie epitopom – tzv. „TAP-tag“ (Burckstummer a kol., 2006) proteín proteín G proteín GSBP TEV Tandemová afinitná purifikácia (Puig a kol., 2006; upravené) asociované proteíny kontaminácia väzbové miesto pre streptavidín 2x proteín G TEV miestocieľový proteín väzba štepenie proteázou TEV 1. afinitná kolóna imobilizovaný IgG Tandemová afinitná purifikácia (Puig a kol., 2006; upravené) 2. afinitná kolóna imobilizovaný streptavidín väzbové miesto pre streptavidín kompetitívny elúcia biotínom 1 1 1 1 233 271 582 582229 597 987 972 1123 1123 Materiál  cDNA kódujúca katalytickú podjednotku telomerázy húseníčka roľného (Arabidopsis thaliana) a jej fragmenty Metódy  príprava expresných klonov  Gateway cloning technology  obsahujú: promotor 35S, ORF, TAP-tag, GFP, AtbR  transformácia baktérie Agrobacterium tumefaciens  transfekcia suspenzných kultúr Arabidopsis thaliana  usmrtenie A. tumefaciens a selekcia transfektantov  pomnoženie transfekovaných buniek Metódy  fluorescenčná mikroskopia Bunky A.thaliana divokého typu Transfekované bunky A.thaliana Výsledky a diskusia  suspenzné kultúry exprimujú fragmenty:  RID1 s N- aj C- terminálnym tagom  Fw2N_NLS s C-terminálnym tagom  po pomnožení bude vykonaná prvá purifikácia  v prípade úspechu budú napestované kultúry exprimujúce aj zvyšné fragmenty Výsledky – „GST PULL-DOWN ASSAY“ Slabá interakcia medzi dvomi rôzne značenými C-koncovými fragmentami CTE2 (aa 972-1123) His6-GST-CTE2 (~ 50 kDa) His6-CTE2 (~ 22 kDa) CTE2 Literatúra  Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M. and Seraphin, B. 1999. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17(10): 1030-1032.  Burckstummer, T., Bennett, K. L., Preradovic, A., Schutze, G., Hantschel, O., Superti-Furga, G. and Bauch, A. 2006. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat Methods 3(12): 1013-1019.  Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., BragadoNilsson, E., Wilm, M. and Seraphin, B. 2001. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods 24(3): 218-229.