Metody přípravy a analýzy vzorků steroidů, hormonů a léčiv matrice •Většina biochemických vyšetření se provádí z krve (plazmy, séra) a moči –Méně často z mozkomíšního moku, stolice, výpotku či pankreatických šťáv Fáze analýzy •Preanalytická – nejčastěji důvod nesprávného výsledku –Mimo laboratoř –Příprava pacienta –Vlastní odběr –Transport do laboratoře –V laboratoři –Příprava vzorku –Skladování •Analytická – zásady GLP •Postanalytická –Tisk, přenos dat (i telefonicky apod.) Preanalytická fáze •Osoba pacienta •Odběr vzorku •Transport vzorku •Skladování před analýzou •Příprava vzorku ke zpracování Osoba pacienta •Neovlivnitelné faktory –Pohlaví (počet červených krvinek) –Rasa, etnikum, sociální skupina (jiné geny, stravování) –Věk –Cyklické změny (cyklus ženských pohlavních hormonů, denní biorytmus) –Gravidita –Současně probíhající jiné onemocnění –Biologický poločas stanovované látky • •Ovlivnitelné faktory –Fyzická aktivita –Psychický stres –Vliv potravy, alkoholu, množství tekutin –Kouření –Léky, operace Odběr vzorku •Odběr venózní krve ( kapilární, tepenná) •Poloha pacienta (vstoje dochází k přesunu tekutiny do intersticia) •Dezinfekce kůže- povrchově aktivní látky-hemolýza •Stažení paže a „cvičení“- přesun tekutiny do intersticia, hemolýza, anaerobní metabolismus •Nasávání krve- podtlak- hemolýza, mokrá stříkačka – osmotická hemolýza •Odběr ze zavedené jehly- odpuštění malého množství krve •Moč –Jednorázový odběr –ranní moč –24 hodinový odběr Transport a skladování •V uzavřených odběrových nádobách •za vhodné teploty (ne pod bod mrazu-hemolýza; někdy za teploty tajícího ledu) •chráníme před světlem •na delší vzdálenosti raději sérum, ne celou krev- mechanická hemolýza •Celá krev nesnese skladování •Oddělené sérum lze skladovat při +4°C až několik dní, popřípadě zmrazené při -20 °C, popř. -80 °C •Při analýze látek, které podléhají metabolickým pochodům konzervační činidla, analýza co nejdříve nebo alespoň oddělení séra od krevního koláče Referenční hodnoty •Určují se různými způsoby (gaussova křivka) •Někdy je důležitá jen dolní či horní hranice •Asi 5% populace hodnoty mimo referenční rozmezí i bez patologického nálezu Příčiny chybných výsledků •Analytické •Administrativní-přepis výsledků, přeslechnutí v telefonu •Organizační- záměna vzorku- dnes se kompletně přechází na čárové kódy Hormony •Většina dobře rozpustná ve vodě •Špatně rozpustné ve vodě – steroidní hormony a hormony štítné žlázy – při transportu se vážou na specifické transportní bílkoviny, což prodlužuje biologický poločas hormonu a dobu jejich účinku, koncentrace v krvi jsou ovlivněny koncentrací transportních bílkovin Stanovení hormonů •Nepřímé stanovení –sledujeme metabolické působení (glykémie-inzulin) •Stanovení v moči –obvykle stanovujeme metabolity hormonů –Obsah kolísá v závislosti na sekreci hormonu během dne a koncentraci moči – obvykle se stanovuje z moči za 24 hod nebo alespoň poměr k močovému kreatininu –S výjimkou hCG (choriový gonadotropin) se močí nevylučují hormony bílkovinné povahy a peptidy –Stanovení v krvi je přesnější •Enzymová imunoanalýza – ELISA •Radioimunoanalýza •|Fluoroimunoanalýza •Chemiluminiscenční analýza –Dostupné komerční soupravy ELISA •Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay –Na povrch polystyrenových jamek je navázáno neznámé množství antigenu –Do jamek je napipetována specifická protilátka s navázaným enzymem –Promytí –Přidána látka, která s enzymem vytváří možnost detekce – fluorescence, zabarvení – spektrofotometr – Nepřímá ELISA –Do jamek je napipetováno známé množství protilátky –Přidáno sérum, které se neváže na protilátku, ale zablokuje možnost nespecifické vazby „našeho“ antigenu na plast –Přidán roztok hledaného antigenu ®naváže se na protilátku –Přidán antigen s navázaným enzymem – obsadí dosud volná vazebná místa protilátky –Přidán substrát enzymu umožňující kvantifikaci –Čím větší odezva, tím méně bylo sledovaného antigenu –Mezi jednotlivými kroky promývání • Kompetitivní ELISA •Analyzovaný antigen je inkubován se známým množstvím protilátky •Roztok je vpraven do jamek s navázaným antigenem – volné protilátky se navážou, protilátky s analyzovaným antigenem se vyplaví •Přidána sekundární protilátka s konjugovaným enzymem, která se specificky váže na primární protilátku •Přidá se substrát Radioimunoanalýza •Známé množství značeného antigenu (stejný jako analyzovaný) – často isotopy jódu navázaného na tyrosin •Přidá se sérum pacienta- neznačené •Značený a neznačený antigen kompetitivně soutěží o vazebná místa protilátky •Volný antigen se oddělí a analyzuje množství značeného antigenu •Podle kalibrační křivky se vyhodnotí množství antigenu pacienta Mikrotitrovací destička pro ELISU (obvykle ve 8 X 12 jamek) hCG •Lidský choriový gonadotropin- těhotenský hormon. •Zvýšená koncentrace i u některých druhů rakoviny např. varlat a vaječníků, ve druhém trimestru jeden z ukazateků možné genetické vady –např. Downův syndrom •Produkován placentou již krátce po oplodnění – stanovitelný cca za sedm dní po oplodnění • •Test moči –Méně spolehlivý než ze séra –Využívá specifickou reakci hCG s anti-hCG monoklonální protilátkou –Proužek ponořen do moči, moč vzlíná po proužku, na hCG se specificky váže barevný konjugát. Ten se následně zachytí v testovací zóně na proužku fixované anti-hCG protilátky. Moč dále vzlíná a nenavázaný konjugát se zachytí v kontrolní zóně • steroidy •Deriváty cyklopentan-o-perhydrofenantrenu •Žlučové kyseliny, vitamin D, pohlavní hormony •Steroidní hormony- antikoncepce, doping – umožňují přírůstek svalové hmoty až 5kg za měsíc • Steroidy v prostředí •Hůře odbouratelné, asi 20% přečká čistírnu odpadních vod – syntetické estrogeny stabilnější než přírodní •Vyskytují se v povrchových i podpovrchových vodách, sklony ke kumulaci v sedimentech •Endokrinní disruptory, demaskulinizace a defiminizace ryb, snížená plodnost a hermafrodizmus vodních organismů • možná souvislost se zvyšujícím se množstvím výskytu některých abnormalit-reprodukčního systému člověka – rakovina varlat, prsu, endometrióza,… Analýza steroidů •Sedimenty, kaly –Transport a uchovávání za nízkých teplot a nepřítomnosti světla, před uskladněním často lyofilizace –Extrakce - ultrazvuková nebo tlaková extrakce rozpouštědlem aceton-methanol (1:1), –Přečištění SPE (C18) –GC/MS •vyžaduje derivatizaci konjugátů –složitější než LC –(HP)LC - fluorescenční, spektrofotometrická detekce,diodovým polem –(HP)LCMS//MS-MS s elektrosprei ionizací nebo chemickou ionizací za atmosférického tlaku •Eluční činidlo : voda-methanol/ voda-acetonitril s gradientovou elucí Estradiol, testosteron •Estradiol- aktivita folikulů, sleduje se při umělém oplodnění, diagnostice menopauzy •Testosteron-androgenní ženy, polycystický syndrom vaječníků •Radioimunoanalýza •ELISA- s kolorimetrickým nebo chemiluminiscenčním, popř. fluorimetrickým stanovením Doping •Testování androgeních steroidů v moči –Testosteron-sleduje se poměr mezi testosteron glukuronidem a epitestosteron glukuronidem (epitestosteron minoritní produkt metabolismu testosteronu a nezvyšuje se při jeho externím dodání) –GC-MS- sleduje se izotop. poměr 13C/12C. Exogenní testosteron obsahuje méně 13C než endogenní homolog (GC/C/IRMS- spalování/isotopový hmotmostní spektrometr) •GC –Metabolity druhé fáze – konjugované – tepelně nestálé –Příprava vzorku •dekonjugace (hydrolýza) –chemickou nebo biologickou (enzymatickou)cestou •derivatizace pro lepší účinnost chromatografie • •LC –Nastřikují se přímo konjugáty –Může být ovlivněna např. matricovými efekty Léky •U léků vytvářejících stabilní hladiny je nejvhodnější odebírat krev před další dávkou, je nutno vyčkat rovnovážného stavu- doba 4-5poločasů eliminace •U léků s rychlou eliminací se stanovuje koncentrace před podáním(bazální koncentrace) a maximální hladina •Stanovení v krvi i v odpadní vodě, potravinách,… antibiotika •Tetracyklin-použití: širokospektrální antib. V lékařství, v živočišné výrobě –v nízkých dávkách profylakticky, popř. k potlačení infekce •Stanovení tetracyklinu –Mikrobiální test – bakterie, které obsahují gen pro luciferázu, reagují na přítomnost tetracyklinu – světélkování –ELISA –Spektrofotometricky – tetracyklin reaguje v přítomnosti kyseliny sírové s FeIII za vzniku barevného komplexu •Chemiluminiscenčně –reakce s- N-bromsukcinimidem –Bromem –Peroxidem vodíku (katalyzováno mědnatými ionty) •HPLC – z živočišné matrice –vysrážení proteinů –SPE –-různé detektory –Např.: HPLC (MF-směs kyseliny šťavelové, methanolu a acetonitrilu), kolona C18, UV detektor –MS/ MS-MS ,…V potravinách APCI •CE stanovení –Poměrně rychlá metoda –Derivatizace zlepšuje stanovení –Extrakce chloroformem –S UV nebo elektrochemickou detekcí –Skleněná kapilára pokrytá polyakrylamidem – • • • Děkuji za pozornost