Aplikace PCR v mikrobiologii doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU, 2013 bartosm@vfu.cz Obsah přednášky 1) Obecné principy diagnostiky 2) Diagnostické varianty PCR 3) Vybrané ukázky jednotlivých metod 4) Příklad a praktické vyhodnocení multiplex PCR 5) Ukázka praktického využití inverzní PCR 6) Real-time PCR 7) Emulsní PCR a pyrosekvenování Jak na PCR? Využití PCR pro detekci mikroorganismů Specificita  schopnost reakce amplifikovat pouze cílový produkt  schopnost primerů vázat se pouze na cílovou sekvenci Senzitivita  limitní detekční mez  počet kopií cílové sekvence, kterou je reakce ještě schopna amplifikovat do viditelného produktu Detekce a Identifikace Primární detekce  záchyt patogenů v primárních odběrech vzorků (krev, tkáně, tělní tekutiny, potraviny, stěry, ..)  požadavek na specificitu i senzitivitu PCR Sekundární detekce  záchyt cílové sekvence v narostlé bakteriální kultuře  požadavek na specificitu PCR Identifikace  rozlišení genů, kmenů, druhů, toxinů, apod. Evaluace PCR systémů Převzaté z literatury Test specificity PCR reakce  primárně teoreticky při navrhování systému  panel známých zdrojů (bakteriálních druhů) Detekční limit PCR reakce  na rekombinantních plasmidech  na vzorcích se známým obsahem detekovaných sekvencí Nově vyvíjené Panely pozitivních a negativních kontrol Postup vyšetření Způsob odběru vzorku  kontaminace při odběru  množství materiálu Manipulace se vzorkem  teplota skladování Uskladnění vzorků  teplota skladování  doba do izolace DNA  doba od izolace DNA do provedení PCR Vlastní PCR Systém PCR kontrol Vyloučit  falešnou negativitu – kontrola inhibice PCR reakce  falešnou pozitivitu – negativní izolační kontrola Zajistit  funkčnost všech komponent a správný průběh  reakce - pozitivní kontrola  správný průběh izolace – pozitivní izolační kontrola Diagnostické varianty PCR  PCR-REA, PRA, PCR-RFLP  asymetrická PCR  alelově specifická PCR  nested PCR  multiplex PCR  Inverzní PCR  kompetitivní PCR  RT-PCR  expresní PCR  „real-time“ PCR PCR-REA, PRA, PCR-RFLP amplifikace restrikční štěpení Praktický příklad PCR-REA, PRA, PCR-RFLP Podrobně bude probráno v přednášce číslo 4 pro 5. ročník Asymetrická PCR amplifikace jednořetězcové produkty určené k sekvenování Alelově specifická PCR efektivní annealing zajišťuje 3´-konec primeru amplifikace žádná amplifikace Příklad alelově specifické PCR Tento typ PCR je používán ke stanovení SNP u eukaryotických organismů Řada aplikací byla popsána při studiu genomu kvasinek Výroba saké  Metoda byla použita k detekci dominantní mutantní alely FAS2-1250S u kvasinek  Gen kóduje modifikovanou formu syntázy mastných kyselin Akada et al. (2001): Detection of a point mutation in FAS2 gene of sake yeast strains by allele-specific PCR amplification. J Biosci Bioeng. 92(2):189-92.  Kmeny s touto alelou syntetizují zvýšené množství ethyl kaproátu Domácí úkol? Určete místo tvorby ethyl kaproátu v metabolismu mastných kyselin Nested PCR citlivost specifičnost 1. stupeň 2. stupeň Uspořádání nested PCR double tube one tube primer 1 primer 2 primer 3 primer 4 primer 1 primer 4 Příklad nested PCR Detekce IS900 u M. paratuberculosis IS901 IS1245 M. avium subsp. avium serotypy 1-3, M. avium subsp. silvaticum IS900 M. avium subsp. paratuberculosis FR300 M. avium subsp. hominissuis, serotypy 4-6, 8-11 a 21 IS1245 Citlivost metody Citlivost pro DNA 1 genom/reakci Ředění izolované DNA Ředění lyzátu bakterií Citlivost pro lyzát ??? 257bp 257bp Analýza nepasterizovaných mlék VUM25 VUM1 NK 100bp ladder 257bp Porovnání PCR a kultivace Mléko Sýry Pasterizo vané Nepasteri zované ČR 14/0/44 (32%) 5/2/9 (65/22%) 7/0/48 (15%) Řecko - - 18/2/41 (44/12%) Celkem 142 vzorků mléka a sýrů Multiplex PCR amplifikace několika lokusů současně diagnostika více lokusů současně Příklad multiplex PCR Diferenciace poddruhů Mycobacterium avium - + 100 bp ladder dnaJ 140bp IS901 577bp IS1245 385bp IS900 215bp Ukázka diagnostické elektroforézy Morávková et al. (2008): Strategy for the detection and differentiation of Mycobacterium avium species in isolates and heavily infected tissues, Research in Veterinary Science 85 (2008) 257–264. dnaJ 140bp IS901 577bp IS1245 385bp IS900 215bp MAP MAA MAH - + 100 bp ladder A teď si to vyzkoušíme prakticky Praktické procvičení s využitím připraveného výukového materiálu Inverzní PCR I Obrácená (inverzní) PCR umožňuje amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA o známé sekvenci známá sekvence neznámá sekvenceneznámá sekvence známá sekvence restrikční štěpení ligace Inverzní PCR II známá sekvence ligace neznámá sekvence sekvenování PCR produktů Příklad aplikace inverzní PCR Mapování pozic inzerční sekvence v genomu mykobakterií Inzerční sekvence IS901 u M. avium Replikativní transpozice Průběh inverzní PCR pro IS901 restrikční štěpení ligace IS901 IS901 IS901 IS901 IS901 IS901 Průběh inverzní PCR pro IS901 IS901 ligace sekvenování PCR produktů Anchor (ukotvená PCR) IS901 anchor primer nahodilý primer sekvenování PCR Inzerční sekvence a fyziologie mykobakterií  identifikace 16 lokusů MAA, do kterých se začleňuje IS901  fyzikální mapa pozic IS901 u 25 izolátů MAA s definovanými RFLP profily  identifikace inzerce IS901 do promotoru genu katE – faktor virulence  studium rezistence vybraných kmenů MAA k izonikotinhydrazidu Fyzikální mapa pozic IS901 Kompetitivní PCR stejné primery, 2 matrice kompetice o primery různé primery, 2 matrice kompetice o substrát a enzym RT - PCR PCR zpětná transkripce AAAAAAAAAA mRNA ssDNA Expresní PCR  uplatnění při translaci in vitro  příprava genového konstruktu s připojeným promotorem  translace in vitro  nevyžaduje klonování do specifických vektorů  umožňuje přípravu mutovaných variant genu pro srovnávací studie následných produktů – rekombinantních proteinů „Real-time PCR“ je nejmodernějším výdobytkem polymerázové řetězové reakce Real-time PCR - princip  kombinované provádění DNA amplifikace a detekce cílové nukleové kyseliny současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů  je možno dynamicky posuzovat průběh syntézy PCR produktu  stanovení množství matrice vložené do reakce (kvantitativní PCR) Fluorofory Navazují se na amplikony nebo jsou jimi značeny hybridizační sondy 1) Nespecifické metody: založené na nespecifické vazbě fluoroforu do vznikající molekuly dsDNA 2) Specifické metody: založené na specifické vazbě sondy označené fluoroforem Real-time PCR - formáty  fluorofory s vazbou na dvouřetězcový fragment DNA = SYBR® Green I;  princip 5’ → 3´exonukleázové aktivity DNA polymerázy na značené sondy = TaqMan®;  princip hybridizace lineárních a nebo vlásenkových („hairpin“) sond = FRET, Beacons, aj.;  princip fluoreskujících amplikonů = Amplifluor™, Scorpions; Princip použití SYBRTM Green I Co se děje uvnitř termocykleru při real-time PCR? 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Fluorescence TaqMan  monitoruje 5’ → 3’ exonukleázový efekt Taq DNA polymerázy na vzniklý duplex mezi sondou a jejím komplementárním řetězcem na PCR produktu  Taq DNA polymeráza uvolňuje a hydrolyzuje sondu hybridizovanou v průběhu syntézy správného řetězce na matrici DNA  fluorofor s excitační energií (R) a fluorofor (Q) pohlcující energii, tzv. „quencher dye“ TaqMan R QR5´ Při jakémkoli formátu je výsledek pořád stejný 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Fluorescence Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 Počet PCR cyklů Fluorescence Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10exp1 Vzorek 1 Vzorek 2 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 10exp1 10exp2 10exp3 10exp4 Koncentrace Tresholdcyclus Vzorek Typ vzorku Ct Koncentrace (kopií/ul) 1 Neznámý 25,64 3,50E+03 2 Neznámý 29,23 2,50E+02 K1 Standard 23,97 1,00E+04 K3 Standard 27,16 1,00E+03 K3 Standard 30,68 1,00E+02 K4 Standard 33,53 1,00E+01 Real Time přístroje Real-time v mikrobiologii  Umožňuje všechny formáty klasické PCR  Stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky – snížení rizika kontaminace  Je více specifická – 2 primery + sonda  Umožňuje stanovit počet mikroorganismů ve vzorku (kvantifikace)  Není třeba provádět elektroforézu  Automatizace procesu pro klinické využití Budoucnost ? - emulsní PCR  Amplifikace probíhá v emulsi (voda-olej)  Jednotlivé matrice navázány samostatně na povrch jednotlivých kapek 454 Life Sciences Emulsní PCR  Amplikon je výsledkem jedinečné PCR  Méně nespecifických produktů Konvenční PCR Emulsní PCR Využití emulsní PCR  Mapování genomů  Vyhledávání genových polymorfismů  Analýza mikrobiálních společenstev Používá se ve spojení s pyrosekvenováním  bakterie v biofilmech  mikroorganismy v potravinářských vzorcích  nekultivovatelné bakterie Pyrosekvenování Metoda popsaná Mostafa Ronaghi et al. v roce 1990 Určena pro krátké úseky DNA, SNP a úseky methylované  4 enzymy  velmi přesná  reakce se záhy „zahltí“ Pyrosekvenování - záznam Intenzita signálu odpovídá počtu začleněných nukleotidů Více o real-time PCR a moderních aplikacích uslyšíte v 5. ročníku Shrnutí 1) Obecné principy diagnostiky 2) Diagnostické varianty PCR 3) Vybrané ukázky jednotlivých metod 4) Příklad a praktické vyhodnocení multiplex PCR 5) Ukázka praktického využití inverzní PCR 6) Real-time PCR 7) Emulsní PCR a pyrosekvenování