Izolace DNA z kvasinek Jana Kopecká 223187@mail.muni.cz Oddělení mikrobiologie a molekulární biotechnologie ÚEB PřF MU Obsah 1. Proč? 2. Kvasinky 3. Izolace – postupy 4. Kontrola a další použití Doporučená literatura Přednáška !! Podrobněji např.: Sambrook a Russell (2001): Molecular cloning, a laboratory manual. Giudici a Pulvirenti (2002): Molecular methods for identification of wine yeasts. a mnoho dalších článků a knih… Proč izolovat DNA/RNA z kvasinek? běžné mikrobiologické a biochemické testy jsou často nepřesné a nedostatečné testy mohou být ovlivněny kultivačními podmínkami jednotlivé rody či druhy mají shodné či variabilní výsledky → analýza sekvencí evolučně konzervativních genů či oblastí na DNA nejčastěji oblast ITS (Internal Transcribed Spacer), která se nachází mezi podjednotkami genů pro rDNA, 18S, 5,8S a 26S (chromozom XII) ITS region Schématické znázornění ITS, NTS a D1/D2 regionu (Giudici a Pulvirenti, 2002, upraveno) (zdroj: ttp://www.biomedcentral.com/1471-2415/8/7/figure/F1?highres=y) Proč izolovat DNA/RNA z kvasinek? Ověření přítomnosti mikroorganizmů Porovnání + klasifikace PCR – klonování, exprese genů mtDNA chromozomální DNA RNA plazmidová DNA … Kvasinky Eukaryota, heterotrofní Široké využití (potravinářství, farmacie, medicína, modelové organizmy, atd.) Ale i patogenní kvasinky Genom: S. cerevisiae 12 Mb, 16 chromozomů (1996) S. pastorianus 25 Mb, 36 chromozomů (2009) Buněčná stěna kvasinek Odlišné složení od prokaryot!!!! Tvorba jizev - pučení (chitin) Shlukování (i s bakteriemi), rozpoznávání buněk opačného párovacího typu, přilnavost k povrchům, … polysacharidy (β-1,3-glukan, β-1,6-glukan) glykozylované bílkoviny (manoproteiny) chitin Buněčná stěna kvasinek Izolace DNA - obecně Zisk kultury + nárůst buněk Odstranění buněčné stěny Lyze buněk Izolace a přečištění DNA Ověření gelovou elektroforézou Izolace DNA – fenol I. 1. Promytí buněk vodou a EDTA (vyvázání iontů, které jsou potřebné pro funkčnost nukleáz) 2. Mechanické rozbití buněk, sonikace nebo enzymatická lyze buněčné stěny - hydrolýza poly-β(1→3-)glukózy Lytikáza (endoglukanáza, proteáza) Zymoláza (β-1,3-glukan laminaripentaohydroláza, β-1,3-glukanáza, proteáza, mananáza) β-d-glukuronidáza (glusulase) Izolace DNA – fenol II. 3. Tvorba sferoplastů (protoplastů) 4. Lyze – EDTA, proteináza K, 10 % SDS (rozpouští tuky .. narušení membrány) Izolace DNA – fenol III. 5. Přidání fenolu a následně směsi izoamylalkohol:chloroform v poměru 1:24 (ve které se rozpouští fenol a tedy vymizí z vodné fáze) 6. Rozdělení směsi na spodní organickou a horní vodnou (s DNA) fázi, mezi nimi jsou vysrážené proteiny !!!odpipetování špičkou s ustřihlým koncem (střižné síly, velikost a počet chromozomů) 6. Přídavek RNázy Přečištění DNA K hrubému lyzátu se přidá 0,7 objemu izopropanolu/etanolu Vysrážení při -20°C Centrifugace DNA při vysokých otáčkách Vysušení, rozpuštění → zakoncentrování (TE pufr, voda, 10 mM Tris) Uchování při 4°C (zmražení může poškodit chromozomy) Izolace DNA - kity Bez fenolu, většinou „silika kolonky“ Mechanické X enzymatické rozbití buněk Většinou neobsahují enzym pro rozbití buněčné stěny – nutno dokoupit! Často je třeba namíchat pufr pro rozbití buněk (není součástí kitu) Nižší výtěžky, stabilita, kompaktnost chromozomů Pro jednorázové stanovení dostačující, pro dlouhodobou manipulaci s DNA zvolit šetrný způsob izolace Izolace DNA - kity Jednoduché Rychlé (ALE rozbití buněčné stěny) Neznámé složení roztoků Dražší v porovnání s fenolovou metodou Nutno dokoupit enzym a namíchat roztoky Macherey-Nagel (Německo) Kontrola Gelovou elektroforézou M – velikostní standard 1,3 – hrubý lyzát před přidáním RNázy 2,4 – hrubý lyzát po přidání RNázy 5,6 – přečištěná DNA M 1 2 3 4 5 6 ← plazmid.DNA Mitochondrie kvasinek „Buněčná elektrárna“ → ATP Vnější a vnitřní membrána Počet: 15 - 29 v závislosti na fyziologickém stavu buňky Velikost: 0,6 – 2,1 m Replikace mitochondrií (Solieri. 2010. Trends in Microbiol. 18:521-530) mtDNA 85 779 bp u S. cerevisiae 70 578 bp u S. pastorianus 64 300 bp u S. bayanus Různá velikost, pořadí genů, … Identifikace – RFLP, štěpení genů pro cytochrom oxidázu, … mtDNA u rodu Saccharomyces (Nakao et al. 2009. DNA Research. 16:115-129) (Ricchetti et al. 1999. Nature. 402: 96-100.) Pořadí genů na mitochondrii (Saccharomyces sensu stricto; Groth et al. 2000) COX geny (Cardazzo et al. 1998. Curr. Genet. 33:52-59.) RFLP mtDNA Jiné % G+C oproti chromozomální DNA → vhodné restrikční enzymy (Rainieri et al. 2008. FEMS Yeast Res. 8:586-596) Izolace mtDNA Zisk kultury + růst buněk Odstranění buněčné stěny Rozbití/lyze buněk Odstranění zbytků buněk a izolace mitochondrií (na základě centrifugace) Lyze mitochondrií Izolace a přečištění DNA Ověření gelovou elektroforézou