Izolace DNA z kvasinek
Jana Kopecká
223187@mail.muni.cz
Oddělení mikrobiologie a molekulární biotechnologie
ÚEB PřF MU
Obsah
1. Proč?
2. Kvasinky
3. Izolace – postupy
4. Kontrola a další použití
Doporučená literatura
Přednáška !!
Podrobněji např.:
Sambrook a Russell (2001): Molecular cloning, a laboratory
manual.
Giudici a Pulvirenti (2002): Molecular methods for
identification of wine yeasts.
a mnoho dalších článků a knih…
Proč izolovat DNA/RNA z kvasinek?
běžné mikrobiologické a biochemické testy jsou často
nepřesné a nedostatečné
testy mohou být ovlivněny kultivačními podmínkami
jednotlivé rody či druhy mají shodné či variabilní výsledky
→ analýza sekvencí evolučně konzervativních genů či
oblastí na DNA
nejčastěji oblast ITS (Internal Transcribed Spacer), která se
nachází mezi podjednotkami genů pro rDNA, 18S, 5,8S a
26S (chromozom XII)
ITS region
Schématické znázornění ITS, NTS a D1/D2 regionu (Giudici a Pulvirenti, 2002, upraveno)
(zdroj: ttp://www.biomedcentral.com/1471-2415/8/7/figure/F1?highres=y)
Proč izolovat DNA/RNA z kvasinek?
Ověření přítomnosti mikroorganizmů
Porovnání + klasifikace
PCR – klonování, exprese genů
mtDNA
chromozomální DNA
RNA
plazmidová DNA
…
Kvasinky
Eukaryota, heterotrofní
Široké využití (potravinářství, farmacie, medicína,
modelové organizmy, atd.)
Ale i patogenní kvasinky
Genom: S. cerevisiae 12 Mb, 16 chromozomů (1996)
S. pastorianus 25 Mb, 36 chromozomů (2009)
Buněčná stěna kvasinek
Odlišné složení od prokaryot!!!!
Tvorba jizev - pučení (chitin)
Shlukování (i s bakteriemi), rozpoznávání buněk
opačného párovacího typu, přilnavost k
povrchům, …
polysacharidy (β-1,3-glukan, β-1,6-glukan)
glykozylované bílkoviny (manoproteiny)
chitin
Buněčná stěna kvasinek
Izolace DNA - obecně
Zisk kultury + nárůst buněk
Odstranění buněčné stěny
Lyze buněk
Izolace a přečištění DNA
Ověření gelovou elektroforézou
Izolace DNA – fenol I.
1. Promytí buněk vodou a EDTA (vyvázání iontů, které
jsou potřebné pro funkčnost nukleáz)
2. Mechanické rozbití buněk, sonikace
nebo
enzymatická lyze buněčné stěny
- hydrolýza poly-β(1→3-)glukózy
Lytikáza (endoglukanáza, proteáza)
Zymoláza
(β-1,3-glukan laminaripentaohydroláza, β-1,3-glukanáza, proteáza, mananáza)
β-d-glukuronidáza (glusulase)
Izolace DNA – fenol II.
3. Tvorba sferoplastů
(protoplastů)
4. Lyze – EDTA, proteináza K, 10 % SDS
(rozpouští tuky .. narušení membrány)
Izolace DNA – fenol III.
5. Přidání fenolu a následně směsi
izoamylalkohol:chloroform v poměru 1:24
(ve které se rozpouští fenol a tedy vymizí z vodné fáze)
6. Rozdělení směsi na spodní organickou a horní
vodnou (s DNA) fázi, mezi nimi jsou vysrážené
proteiny
!!!odpipetování špičkou s ustřihlým koncem
(střižné síly, velikost a počet chromozomů)
6. Přídavek RNázy
Přečištění DNA
K hrubému lyzátu se přidá 0,7 objemu
izopropanolu/etanolu
Vysrážení při -20°C
Centrifugace DNA při vysokých otáčkách
Vysušení, rozpuštění
→ zakoncentrování
(TE pufr, voda, 10 mM Tris)
Uchování při 4°C
(zmražení může poškodit chromozomy)
Izolace DNA - kity
Bez fenolu, většinou „silika kolonky“
Mechanické X enzymatické rozbití buněk
Většinou neobsahují enzym pro rozbití buněčné stěny –
nutno dokoupit!
Často je třeba namíchat pufr pro rozbití buněk (není
součástí kitu)
Nižší výtěžky, stabilita, kompaktnost chromozomů
Pro jednorázové stanovení dostačující, pro dlouhodobou
manipulaci s DNA zvolit šetrný způsob izolace
Izolace DNA - kity
Jednoduché
Rychlé
(ALE rozbití buněčné stěny)
Neznámé složení roztoků
Dražší v porovnání
s fenolovou metodou
Nutno dokoupit enzym
a namíchat roztoky
Macherey-Nagel (Německo)
Kontrola
Gelovou elektroforézou
M – velikostní standard
1,3 – hrubý lyzát před přidáním RNázy
2,4 – hrubý lyzát po přidání RNázy
5,6 – přečištěná DNA
M 1 2 3 4 5 6
← plazmid.DNA
Mitochondrie kvasinek
„Buněčná elektrárna“ → ATP
Vnější a vnitřní membrána
Počet: 15 - 29 v závislosti
na fyziologickém stavu buňky
Velikost: 0,6 – 2,1 m
Replikace mitochondrií
(Solieri. 2010. Trends in Microbiol. 18:521-530)
mtDNA
85 779 bp u S. cerevisiae
70 578 bp u S. pastorianus
64 300 bp u S. bayanus
Různá velikost, pořadí genů, …
Identifikace – RFLP, štěpení genů pro cytochrom
oxidázu, …
mtDNA u rodu Saccharomyces
(Nakao et al. 2009. DNA Research. 16:115-129)
(Ricchetti et al. 1999. Nature. 402: 96-100.)
Pořadí genů na mitochondrii
(Saccharomyces sensu stricto; Groth et al. 2000)
COX geny
(Cardazzo et al. 1998. Curr. Genet. 33:52-59.)
RFLP mtDNA
Jiné % G+C oproti
chromozomální DNA
→ vhodné restrikční enzymy
(Rainieri et al. 2008. FEMS Yeast Res. 8:586-596)
Izolace mtDNA
Zisk kultury + růst buněk
Odstranění buněčné stěny
Rozbití/lyze buněk
Odstranění zbytků buněk a izolace mitochondrií
(na základě centrifugace)
Lyze mitochondrií
Izolace a přečištění DNA
Ověření gelovou elektroforézou