1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif IMUNOTOXIKOLOGIE – metody 1 Luděk Bláha blaha@recetox.muni.cz OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Tox-Stimul-Defic Imunotoxicita = narušení rovnováhy fungování IS 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příčiny imunotoxicity / imunomodulací 1)Genetická fixace 2)Vliv prostředí -získané během života -Zahrnují i chemické vlivy – předmět imunotoxikologie – • •Důsledky imunomodulací (imunotoxicity) –porušení proti-infekční a proti-nádorové ochrany –neschopnost reagovat na vakcíny –imunopatologie (autoimunita, hypersensitivity) • •Imunomodulační faktory mohou působit … –přímo na buňky I.S. –na jiné buňky, které modulují I.S. (neuroendokrinní řízení) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Primární imunodeficience •PRIMÁRNÍ = genetická fixace • –často vázané na X-chromozom (více ohroženi M) –deficity B-buněk a produkce Ab •neschopnost vyrovnávat se s bakteriemi –deficity T-buněk •funkční poruchy T-buněk – –SCID (Severe Combined ImmunoDeficiencie) •řada variant: T-B-, T-B+, NK … •krátká doba přežití jedinců se SCID • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Sekundární imunodeficience •Řada faktorů během života –metabolismus a výživa –záření (včetně slunečního) –Věk –poranění (např. popáleniny) –chronické infekce –chemické látky –stres - spojení s hormonálním řízením • •AIDS –způsoben retroviry - HIV-1, HIV-2 –integrace do genomu –infikuje CD4+ T-b a některé APC –důsledky: selhání IS •smrt v důsledku oportunních infekcí •neobvyklé nádory • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Imunotoxikologie •Část toxikologie –Základní princip: „Každá látka je toxická - o toxicitě rozhoduje jen dávka“ • •Cizorodá látka –vstupuje do těla, kde prodělává řadu dějů, které ovlivňují výslednou „dávku“ • •Toxikokinetika –Popisuje příjem, distribuce, metabolismus, vylučování látky v organismu –Závisí na povaze látek (velké x malé, hydro- filní x fobní …) • •Toxikodynamika –Popisuje mechanismy interakce látek s „receptory“ (tj. cílovými místy) –Receptor v toxikodynamice – jakákoliv biologicky významná molekula •protein, NK, fosfolipid –jedna látka může mít více mechanismů toxicity •O tom, který mechanismus převáží rozhoduje toxikokinetika • (tj. výsledná koncentrace v místě reakce a přítomnost „receptorů“) • –Příklady toxikodynamických reakcí v imunotoxikologii -Přímá chemická reakce látky s HMC à vede k strukturní modifikaci MHC à imunomodulace -Nekovalentní vazba na receptor AhR v brzlíku à aktivaci AhR à apoptoza brzlíku 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jak lze prokázat, že látka působí imunotoxicky ? •1) Epidemiologické studie • –(+) vysoká informační hodnota - studie s populacemi lidí –( - ) nákladné, velká přirozená variabilita - řada kovariant (slunce, léky, stres …) • • •imunotoxicita byla epidemiologicky prokázána pouze pro několik málo skupin látek •dioxiny (PCDD/Fs) a polychlorované bifenyly (PCBs) •Azbest •Olovo •Některé pesticidy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jak lze prokázat, že látka působí imunotoxicky ? •2) Laboratorní studie • • (+) lepší definice, nízká variabilita experimentů • lze hodnotit velké množství parametrů I.S. současně • prostudována řada chemických látek • • ( - ) výsledky „jen“ z laboratorních zvířat • „nejednotné“ efekty v různých vědeckých studiích (různé dávky, různé doby expozice …) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Cíle imunotoxikologických studií ? •? Poznání –vědecká práce imunotoxikologů –studie řady látek, různí vědci - různé experimentální přístupy –Poznávání základních informací o možném účinku na IS • •? Posouzení skutečných RIZIKA pro lidi, zvířata –Co je riziko? (nebezpečnost vs. riziko) •Riziko = pravděpodobnost, že se projeví nebezpečná vlastnost • –látka zabíjí T-buňky = nebezpečnost –látka je skutečně přítomna v toxické koncentraci = riziko • •Pokud existuje riziko àpraktické a ekonomické dopady (řízení rizika): zákaz výroby … àpotřeba standardizovaných protokolů pro hodnocení toxicity (imunotoxicity): viz dále 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Standardizace hodnocení imunotoxicity •NEEXISTUJE jednoznačné a komplexní nadnárodní doporučení nebo standard (OECD, ISO) • •Různé postupy/návody pro různé skupiny chemických látek –Doporučení pro Humánní léčiva (Guidelines Evropské agentury pro léčiva – EMA) •studenti znají principy prostudovat (!) –Zmínky v rámci dalších legislativ, neexistují jednoznačné postupy •REACH (průmyslové chemikálie) •Legislativa o pesticidech, biocidech – •Využívají se postupy vyvinuté národními agenturami –USA •Food and Drug Administration •National Toxicology Program (NTP) of National Institute of Environmental Health and Safety (NIEHS) –Holandsko •RIVM - National Institute for Public Health and the Environment • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif doseres1 Praktické testování imunotoxicity 1)Nejdříve - zjištění obecné akutní toxicity (existují standardy postupů - ISO, OECD …) • •Akutní toxicita (24-48 hodin, i.p. aplikace) • •Příklad experimentu –Kontrolní skupina 10 zvířat přežívá: 10 –Expozice –- koncentrace 1 5 zvířat přežívá: 5 –- koncentrace 4 5 zvířat přežívá: 4 –- koncentrace 20 5 zvířat přežívá: 2 –- koncentrace 100 5 zvířat přežívá: 1 –- koncentrace 500 5 zvířat přežívá: 0 • •Vyhodnocení LD50 • LOEC (LOAEL) • • •Sledování známek imunotoxického působení (ovlivnění krvetvorby, orgánů…) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Praktické testování imunotoxicity •2) Stanovení chronické toxicity •Chronická toxicita •28 dní •Použité dávky - dle akutní toxicity, tedy: –1/2 akutní LD50 –LOAEL –1/10 LOAEL • •Sledování běžných toxikologických parametrů a parametrů, které by indikovali imunotoxikologické působení • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Praktické testování imunotoxicity •3) Specifické testování imunotoxicity •Provádí se pokud standardizované testy toxicity indikují imunotoxicitu •Detaily – viz dále • • •Poznámky k praktickým aspektům testování •Nutné jsou in vivo experimenty –potřeba velkého množství zvířat –realizace jen v oprávněných případech •Existují rozhodovací schémata (viz příklad) - kdy a jak testovat? •? Lze in vivo nahradit in vitro ? –v některých případech ANO - viz dále • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Guidlines - EMA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Guidlines - EMA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.fda.gov/cdrh/ost/ostggp/immunotox.html 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Testování imunotoxicity – „tiered“ approach •Tier 1 (test chronické toxicity – viz dříve) –aplikace xenobiotika –sledování vlivu na obecné a základní vlastnosti IS • •Tier 2 (specifická imunotoxicita) –aplikace xenobiotika –sledování funkční odpovědi na specifické antigeny (aplikace antigenů) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TIER 1 (příklad léčiva – EMA) „Standarní testy toxicity“ - Sledování známek imunotoxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Standardizované „národní“ postupy –Zahrnují Tier 1 + 2 –Holandsko - RIVM (potkan) –USA - NIEHS/NTP (myš kmen B6C3F nebo BALB/C) – • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Hodnocení imunotoxicity – postup dle RIVM Tier 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 1 Tier 1 – Hematologie a buněčnost • •Celkové počty krevních buněk/mL •Počty leukocytů, lymfocytů („diferenciál“) • : stanovení - mikroskopie: počítací komůrka • - jednoduché počítače - „cell counter“ • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Tier 1 – množství a třídy protilátek •ELISA proti Fc fragmentům IgG, IgM, IgE –Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay – •!!! Znát princip ELISA proti protilátkám • •Základní postup –Získání protilátek proti „Fc“ fragmentu jednotlivých tříd IgG •Polyklonální nebo monoklonální protilátky •Jeden „díl“ protilátek se využívá pro imobilizaci („sorbci“) reakce v mikrodeskách •Druhý díl se využívá pro vizualizaci rozpoznávací reakce: Protilátky s navázanou značkou (enzymem) – • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Získání protilátek pro ELISA reakci – „polyklonální“ Ab 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Získání protilátek pro ELISA reakci – „monoklonální“ Ab 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Princip ELISA - stanovení tříd protilátek •Princip – viz obrázek •Stanovení „titru“ - čím vyšší ředění - tím více protilátek • •Vždy srovnání Kontrola vs. Exponované • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Slezina Tier 1 – hodnocení histologie http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=RaTzR3II10Q#t=4s •Hmotnost (a poměr k hmotnosti těla) orgánů IS a dalších –zejména: slezina, thymus, uzliny • •Histopatologie –fixace orgánu v parafinu –tenké řezy cca 5 mm (mikrotom) –barvení & mikroskopie • •Profesně náročné hodnocení histopatologie –Nutná je expertíza • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Tier 1 - Stanovení BUNĚČNOSTI •Buněčnost v kostní dřeni –preparace femuru –odstřihnutí hlavic –výplach kostní dřeni • •Buněčnost ve slezině –slezina / homogenizace •Slezina - myš: 108 buněk • - 4-8% adheruje MF • - 60% B-b • - 40% T-b. • •Stanovení počtů bb. (cell counter) •Stanovení typů bb. (flow cytometer) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Průtoková cytometrie – základní principy •Stanovení typů buněk (např. typů lymfocytů) •Fluorescenčně značené protilátky proti povrchovým antigenům –CD3, CD4 … • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Zástin na detektoru = „buňka a její velikost“ Fluorescence = Typ buňky Průtoková cytometrie – základní principy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Průtoková cytometrie – datové výstupy FSC – forward-scatter (zástin) FL - fluorescence 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Hodnocení imunotoxicity – postup dle RIVM Tier 2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Testování imunotoxicity – Tier 2 •Tier 1 (test chronické toxicity – viz dříve) –aplikace xenobiotika –sledování vlivu na obecné a základní vlastnosti IS • •Tier 2 (specifická imunotoxicita) –aplikace xenobiotika –aplikace antigenů •sledování funkční odpovědi na specifické antigeny 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Tier 2 – Stanovení protilátkové odpovědi •Protilátková odpověď: –Stanovení produkce protilátek –Stanovení kvality B-buněk (proliferační odpověď) –Stanovení počtů protilátek, které produkují Ab – – • •1) Stanovení produkce protilátek • •ELISA proti IgM na T-nezávislý Ag (LPS) • • •Antigenně specifické ELISA –ELISA proti T-závislým Ag • •Modelové T-závislé antigeny –tetanový toxin (anaT) –beranní erytrocyty (SRBC) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 1 Homogenizace a izolace buněk -lyza erytrocytů Buňky do mikrodestiček přidání LPS -> stimulace (pouze) B-lymfocytů kultivace in vitro (48 h) 1 Přidání *3H-Thy Inkorporace do DNA dělících se buněk (24 h) Oplach radioaktivního media Stanovení radioaktivity (CPM) v buňkách 1 Stanovení proliferační odpovědi B-lymfocytů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 - aplikace xenobiotika vs. kontrola - podání antigenu (=SRBC) - izolace buněk ze sleziny à agar 1 - opět přidání stejného antigenu (SRBC) a přidání komplementu (morče) do agaru - kolem buněk produkujících Ab proti SRBC -> lyza SRBC: plaky (PFC = plaque forming cells) 1 Stanovení počtů B-buněk, které produkují Ab („Plaková metoda“) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Varianta – stanovení počtů buněk technikou ELISPOT •- destička krytá antigenem (anaT) •- přidání buněk (v různých ředěních) •- produkce Ab proti anaT v jamce •- sekundární Ab-HRP •- HRP - NEROZPUSTNÝ produkt •- počítání „spotů“ • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení funkčnosti T-buněk - proliferační odpověď • •Design stejný jako u proliferace B-buněk • •Přidání T-specifických mitogenů –lectiny/sacharidy - ConA, PHA –lymfocyty z jiného zvířete –(smíšená lymfocytová reakce - MLR) –- specifické antigeny (SRBC, anaT) • •