1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif IMUNOTOXIKOLOGIE – metody 2 Luděk Bláha blaha@recetox.muni.cz OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Tier 2 – RIVM – testování funkce makrofátů 1)Hodnocení „oxidativního vzplanutí“ MF –Při likvidaci patogenů - řada enzymů à oxidační reakce –cukry - LPS, zymosan, škrob à nespecifická stimulace oxidativního vzplanutí – •Stanovení reaktivních radikálů (ROS) po stimulaci –krev (nebo bb. ze sleziny) –přídavek sondy citlivé na oxidaci (luminol, fluorescein …) + stimulace (LPS …) –měření kinetiky luminiscence (luminol) / fluorescence (fluorescein) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Zdravé MFs Záznam kinetiky oxidačního vzplanutí MF Suprese oxidativního vzplanutí Vyhodnocení: Integrál (plocha pod křivkou) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Tier 2 – RIVM – testování funkce makrofátů •2) In vitro fagocytoza (a likvidace patogena) • •buňky ze sleziny nebo výplach břicha i.p. (adherence na povrch) •aplikace na sklíčko / misku •+ přídavek fagocytovaných objektů: –fluorescenčně značené latexové kuličky NEBO –bakterie Listeria monocytogenes •+ možnost přidat cytokiny (IFN-gamma) • •inkubace 15-30 min –fixace (& barvení) - fluorescence: • SCHOPNOST FAGOCYTOVAT –nebo: kultivace živých L. monocytogenes • SCHOPNOST ZABÍJET • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Sledování fagocytozy in vitro 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Tier 2 - Sledování funkce NK buněk •1) In vitro likvidace nádoru • •buněčná nádorová linie YAC-1 (nebo P815, L1210…) •pre-inkubace nádoru s radioaktivně značeným substrátem Na251CrO4 –(varianta: fluorescenční značení - méně nebezpečné pro personál, méně citlivé) • •dokonalé odmytí média (radioaktivní jsou jen buňky - nikoliv médium) • •smýchání nádoru s buňkami ze sleziny (specif. poměr „effector:target“ ratio) •Modifikace: + přídavek IFN-gamma a LPS = zabíjení nádoru MAKROFÁGY (odlišení od funkce NK bb. - NK bb. nepotřebují stimulaci !) • •Inkubace 20h, centrifugace všech buněk • •Stanovení radioaktivity v médiu (aktivita pochází z rozbitých nádorových buněk) varianta: měření fluorescence (méně citlivé) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Radioaktivita v myších po aplikaci YAC-1 (rozvoj nádorů) Inhibice lýzy YAC-1 po přidání modelové látky Sledování likvidace nádorových buněk 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Testy specifické imunity Hostitelská rezistence ? Projeví se in vivo imunotoxicita pro určitou část IS ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelové patogeny v testech INFEKČNÍ rezistence •Experimentální uspořádání: –Expozice látkou (in vivo) –Aplikace patogena (! Potenciální nebezpečí pro personál) –Sledování odolnosti vůči patogenům • •Bakterie – modely –Listeria monocytogenes •intracelulární patogen, •likvidace T-závislá (vyžaduje stimulaci MF) –Streptococcus •extracelulární G+ bakterie •likvidace - funkce Ab + MF • •Viry – modely –Virus chřipky - neutralizační Ab, správná funkce IFN-a,b –Cytomegaloviry (herpes) - Tc, makrofágy, NK-bb. • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Příklad – vliv TCDD na přežití myší po infekci chřipkou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Vliv cyklofosfamidu (cytostatikum, karcinogen) na přežívání virů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Testování protiparazitární a protinádorové imunity •Likvidace parazitů –Trichinella spiralis •helmint - infekce přes GIT •T-buňěčná imunita + eosinofily –Plasmodium yoelli – prvok •malarie (infikuje ERY) •likvidace: B-b / T-b / MF • •Likvidace nádorů –B16F10 melanoma •i.p. injekce nádorů do myší - 21 dnů •diseminace na plicích – vyhodnocení makroskopicky •likvidace: NK a MF –PYB6 sarcoma •intramuskulární injekce - zde vývoj nádoru (hodnocení) – • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Počty T.spiralis kultivovaných z infikovaných potkanů v závislosti na ozařování UV (dny) Protiparazitární infekce 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.jpg Metastázy B16F10 na plicích myši Makroskopické hodnocení Efekt cyklofosfamidu à Výskyt nádorů po aplikaci PYB6 Hodnocení protinádorové imunity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Testy hypersensitivity a autoimunity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Průkaz proti-jaderných protilátek (ANA) - lidské buňky fixované na mikroskopickém skle - přidání séra (pokud obsahuje ANA, naváží se …) - následná vizualizace (fluoresceinem-značené protilátky) C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Průkaz autoimunity – ANA protilátky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kontaktní hypersensitivita Průkaz DTH reakce à aplikace Ag na kůži à po delší době zarudnutí C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.jpg „DTH“ test (delayed type hypersensitivity) viz také MEST - Mouse Ear Swelling Test C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.jpg Kontaktní dermatitida 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 MEST test •MEST - Mouse Ear Swelling Test –Vyholení břicha, opakovaná aplikace Ag v pásce (3-5 den) –po 10 dnech: Ag do jednoho ucha (solvent do druhého) •Interpretace –Test funkčnosti Tc buněk – T-závislé Ag (ovalbumin, tuberculin, Listeria) –Test „DTH“ – aplikace potenciálního sensitizéru • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Test stimulace v lokálních uzlinách – LLNA •Stimulace v lokálních uzlinách (myši) •Local Lymph Node (LLN) Assay • •Opakovaná i.d. injekce látky (za uši) 5 dní •Následně i.v. injekce 3H-Thy - 5 h expozice •Usmrcení •Izolace lokálních (krčních) uzlin • •Vyhodnocení hmotnost uzliny –proliferace buněk z uzliny in vitro = stanovení radioaktivity v uzlině (proliferace T-buněk) • • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vyhodnocení imunotoxikologických experimentů Hledání ovlivněné části IS 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Různé typy antigenů – zapojení různých složek IS •T-závislé –př. SRBC •T-nezávislé –DNP-Ficol (=dinitrofenyl-ficoll) –LPS • •Exper. design: –1) působení toxické látky –2) podání modelových Ag • •Kombinace různých Ag • àreakce různých složek IS • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Příklad – tetrachlormetan à „selektivní toxicita“ pro T-bb. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Příklad - casein – toxicita pro T-buňky a Makrofagy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Příklad TCCD - toxicita zejména pro B-buňky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif In vitro možnosti studia vlivu xenobiotik na IS •Separace jednotlivých typů buněk ze sleziny • •Oddělené expozice buněk –rekonstituce různých buněk & spojení dohromady –odpověď na podávaný Ag • •Výsledky –srovnání různých xenobiotik –posouzení vlivu na jednotlivé typy buněk • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif 1) Homogenát buněk ze sleziny: (kontrolní / exponované zvíře) 2) oddělení makrofágů (adherence na povrch) - 3) neadherující buňky (T- a B-lymfocyty) - rozdělení vzorku na 2 části - ½ lyza T-buněk - ½ lyza B-buněk 4) oddělené expozice cizorodé látce 5a) toxicita pro jednotlivé typy buněk 5b) spojení buněk po expozici a provedení plakového testu (funkce) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Plocha\1.gif Expozice B- a T-buněk in vitro (TCDD vs VH - kontrola) -> spojení a sledování produkce IgM