Molekulární biologie (přednáška JS 2016, 3 hod) prof. RNDr. Jiří Doškář, CSc. Molekulární biologie - předmět studia • Vědní obor zabývající se studiem vztahu struktury a interakcí biomolekul, zvláště informačních biomakro-molekul, k funkcím a vlastnostem živých soustav. • Cílem molekulární biologie je vysvětlit funkce a vlastnosti živých soustav strukturou a interakcemi jejich molekul (makromolekul). • Tento vztah vysvětluje z komplexního hlediska integrujícího fyzikální, chemické a biologické přístupy. Studium procesů, které probíhají v živých soustavách na molekulární úrovni a jimiž se realizuje genetická informace Definice pojmu „Molecular Biology" - is the study of the structure and function of biological molecules. - study of the molecular basis of life including the biochemistry of molecules such as DNA, RNA and proteins and the molecular structure and function of the various parts of living cells - a branch of biological science that studies the biology of a cell at the molecular level. Molecular biological studies are directed at studying the structure and function of biological macromolecules and the relationship of their functioning to the structure of a cell and its internal components ... - the science of studying the genetic composition and mechanism of living organisms at the molecular level. The molecular studies of all other organic molecules like proteins, fats, and carbohydrates is called biochemistry. - the study of molecules that are found in cells. - field of biology that concerns itself with understanding the interactions among the molecules of life. - a general term referring to study of the structure and function of proteins and nucleic acids in biological systems. Biochemie se zabývá chemickými pochody v živých organismech. Předmětem studia biochemie je struktura a funkce základních stavebních kamenů živé hmoty jako jsou například cukry, tuky, bílkoviny, nukleové kyseliny a další biomolekuly. Vznik a vývoj molekulární biologie umožnily tři základní objevy 1. Poznání struktury a funkce nukleových kyselin (DNA a RNA) 2. Rozluštění genetického kódu 3. Poznání procesů, jimiž se realizuje genetická informace (transkripce, translace, regulace genové exprese) Specifické rysy historie vzniku molekulární biologie 1. Zaměření molekulární biologie na řešení genetických problémů 2. Návaznost molekulární biologie na biofyziku, fyzikální chemii, biochemii, mikrobiologii a genetiku 3. Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a štrukturalistické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Vznik molekulární biologie v podobě molekulární genetiky syntézou funkcionalistické a štrukturalistické koncepce ve výzkumu proteinů a nukleových kyselin Strukturalisté (fyzici, chemici) - zaměření na objasnění struktury biomakromolekul (proteinů, NK) (nezajímali se o funkci biomakromolekul ani genetickými problémy) W. T. Astbury J.D. Bernal L. Pauling E. Chargaff M.H.F. Wilkings F. H.C. Crick Funkcionalisté (biochemici, mikrobiologové, genetici) - zaměření na vysvětlení, které biomakromolekuly jsou nositeli genetické informace a jaké funkce plní (objektem studia byly bakterie a bakteriofágy) M. Delbrück, E. Schrödinger, G.W. Beadle, E.L. Tatum O.T. Avery, CM. MacLeod, M. McCarty, J. Lederberg, A.D. Hershey, J.D. Watson Rosypal S.: K historii pojetí molekulární biologie. DVT, 18: 193-209,1985. Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1944 - transformace bakterií pomocí purifikované DNA • 1953 - model struktury DNA (J. Watson, F. Crick, M. Wilkins) • 1956 - genetická informace v DNA je zapsána pořadím bází • 1958 - při replikaci se oddělují komplementární vlákna DNA • 1958 - izolace DNA-polymerázy I a syntéza DNA in vitro • 1958 - vyhlášení ústředního dogmatu molekulární biologie • 1960 - objev mRNA a důkaz její funkce • 1961 - mRNA použita k rozluštění genetického kódu • 1961 - experimentální důkaz ústředního dogmatu MB • 1961 - postulování operonové teorie - regulace genové exprese • 1966 - kompletní vyřešení genetického kódu • 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu • 1970 - objev reverzní transkriptázy u retrovirů • 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro • 1973 - začátek klonování genů - základ Gl Důležité etapy ve vývoji molekulární biologie • 1975 - Asilomarská konference-moratorium na práce s rekombinantní DNA • 1977 - první rekombinované molekuly nesoucí savčí geny • 1977 - objev složených genů - exony/introny - sestřih pre-mRNA • 1977 - zavedení metod sekvenování DNA • 1981 - objev katalytické aktivity RNA - ribozymy • 1982 - komerční výroba lidského inzulínu z bakterií • 1983 - stanovení sekvence DNA bakteriofága A • - projekty sekvenování genomů modelových organismů Genomická a postgenomická éra • Analýza sekvencí genomů • Vztah genomu k proteomu • Bioinformatické přístupy 'Z*1 iŕ í> Ä S S -S '5 •?!• S 'ľh iíŤ" 'ý Současná etapa molekulární biologie • Oblast výzkumu O analýza genomu (genomika) a proteomu (proteomika) O studium regulace genové exprese a procesů diferenciace buněk (buněčný cyklus, signální dráhy, poruchy regulace, výzkum kmenových buněk) O neurobiologie O Využití metodologie mol.biologie v řadě oborů: molekulární mikrobiologie, virológie, imunologie, fyziologie, evoluce ... • Praktické aplikace O genové inženýrství - moderní biotechnologie, příprava trans-genních organismů a nových látek cílenou změnou genů O molekulární diagnostika infekčních, dědičných a nádorových chorob, nové způsoby jejich léčby O farmakogenomika - léky „šité na míru" O genové terapie = léčba genetických onemocnění Sylabus přednášky z Molekulární biologie (JS 2016) 1. Úvodní přednáška. Předmět studia molekulární biologie, její vznik a hlavní etapy vývoje. Struktura a funkce nukleových kyselin 2. Genetická informace, genetický kód, definice genu, typy genů, struktura a informační obsah genomů 3. Replikace DNA (zúčastněné enzymy a mechanismus) 4. Transkripce u prokaryot a eukaryot, posttranskripční úpravy RNA 5. Translace, translační aparát, kotranslační a posttranslační procesy, samosestavování 6. Regulace genové exprese u prokaryot a eukaryot, struktura a vlastnosti regulačních molekul a regulačních sekvencí, pozitivní a negativní regulace, atenuace, specifické rysy regulace jgenové exprese u eukaryot. Regulace na posttranskripční úrovni. 7. Molekulární základ tvorby imunitních molekul 8. Změny genetické informace: mutace, obecná a místně specifická rekombinace. Reparace mutačně poškozené DNA 9. Mobilní genetické elementy (prokaryotické a eukaryotické transpozony, retrotranspozony) 10. Základy genového inženýrství, příprava transgenních organismu a jejich o využití, mutageneze in vitro, příprava biopreparátů metodami Gl, genové terapie Doporučená literatura • Rosypal S. a kol.: Úvod do molekulární biologie. l.-IVdíl. Brno 1999-2002 (třetí vydání). 2006 - I. díl (čtvrté vydání) • Rosypal S. a kol.: Terminologie molekulární biologie, Brno 2001. • Šmarda J. a kol.. Metody molekulární biologie, Brno, 2005. • Lewin B. Genes VII, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 2002. • Alberts et al.: Molecular biology of the cell. Garland Sei. 2008,2015 • Alberts a kol: Základy buněčné biologie, Espero, 2000, 2005. • Clark D.: Molecular biology, Elsevier, 2005. • Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. • Snustad P.P., Simmons M.J.: Genetika (překlad originálu Principles of Genetics), MU Brno, 2009 • Předlohy k přednáškám: IS MU ÚVOD DO MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Stanislav Rosypal VSTUP DO MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE ■ MOLEKULÁRNÍ BIOLOKIE PROKARYOTICKĚ BUŇKY BRMO 21)1)6 ČTVRTÉ (INOVOVANÉ) VYDANÍ METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jan Šmarda, Jiří Doškář, Roman Pantůček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Molecular Biology of THE CELL Sixth Edition I ALBERTS JOHNSON LEWIS MORGAN RAFF ROBERTS WALTER PRINCIPLES OF GENETICS Second ); cl i i i u n SNUSTAD • SIMMONS Důkaz, že genetická informace je uložena v DNA Nepřímé důkazy: - DNA se nachází v chromozomech; RNA a proteiny jsou i v cytoplazmě - Množství DNA v somatických buňkách koreluje s počtem sad chromozomů, v pohlavních buňkách je množství DNA poloviční - DNA je stabilnější než RNA nebo proteiny Přímé důkazy: - Transformace u Streptococcus pneumoniae - změna virulence - Analýza bakteriofága T2 - do bakteriální buňky vstupuje jen DNA, nikoliv proteiny - U viroidů a některých virů je nositelkou genetické informace RNA -experiment s virem TMV Experiment demonstrující transformaci bakteriálních buněk Streptococcus pneumoniae (Griffith 1928) S buňky = virulentní, tvoří hladké kolonie, R buňky = avirulentní, tvoří drsné kolonie Transformace R buněk myš umírá na pneumonii myš je zdravá myš je zdravá myš umírá na pneumonii hladké kolonie drsné kolonie žádné kolonie drsné a hladké kolonie Princip transformace bakteriálních buněk Donorová buňka Recipientní buňka Důkaz, že chemickou substancí zodpovědnou za transformaci buněk R na S je DNA (O. Avery, C. Mac Leod, M. McCarty 1944) \ Přidání ^ RNázy \ Extrakt z buněk S (obsahuje DNA, RNA a proteiny) R kolonie • S kolonie Přidání proteázy Kultivace s buňkami R ▼ Potomstvo R buněk vytváří R kolonie a S kolonie (důsledek transformace) Přidání DNázy Potomstvo R buněk vytváří pouze R kolonie Záver: transformující aktivitu vykazuje pouze DNA, ne RNA nebo proteiny Struktura DNA navržená Watsonem a Críckem (1953) Vlastnosti navržené struktury DNA umožňují: 1. Replikaci spočívající v párování komplementárních bází 2. Spontánní mutabilitu v důsledku tautomerie bází 3. Kódování genetické informace ve formě pořadí (sekvence) bází Dceřiný duplex Mateřský duplex Z re p li kován é řetězce Nukleové kyseliny • DNA - tvoří génom prokaryot, eukaryot a DNA-virů • n DNA - jaderná, gDNA - genomová, mtDNA - mitochondriová, ctDNA -chloroplastová, pDNA - plazmidová, recDNA - rekombínantní, rDNA -ríbozomální, rDNA • cDNA (copy DNA, complementary DNA) - komplementárni; • dsDNA - dvou řetězcová, ssDNA - jednořetězcová, cccDNA - kovalentně uzavřená kružnicová, ocDNA - otevřená kružnicová, linDNA - lineární • A-DNA, B-DNA, Z-DNA - konformace ovlivněná sekvencí a prostředím • RNA - tvoří genom RNA-virů, u buněčných organismů je složkou ribozomů a plní různé funkce při přenosu a realizaci genetické informace • m RNA - mediátorová, hnRNA - heteronukleární, tRNA - transferová, rRNA - ribozomová, snRNA - malá jaderná, snoRNA - malá jadérková, scRNA - malá cytoplazmatická, gRNA - řídící • Ribozymy: RNA s katalytickou funkcí (např. siRNA, miRNA aj) Složení nukleových kyselín Nukleotid O kyselina fosforečná O pentóza • ribóza • deoxy ribóza O organická báze • purinové báze • adenin • guanin • pyrimidinové báze • cytozin • tymin • uracil N-glykozidická vazba Nukleozid = pentóza org. báze Kys. deoxyribonukleová O kys. fosforečná O deoxy ribóza O adenin, guanin, cytozin, tymin* Kys. ribonukleová O kys. fosforečná O ribóza O adenin, guanin, cytozin, uracil* *modifikace bází (metylace, acetylace...) Organické báze • Adenin = 6-aminopurin • Guanin = 2-amino-6-oxopurin • Cytozin = 4-amino-2-oxopyrimidin • Tymin = 2,4-dioxo-5-metylpyrimidin • Uracil = 2,4-dioxopyrimidin Purinové báze Pyri midi nové báze Pentózy nukleových kyselin RNA DNÁ 5HO-CH2 B-D-ribóza 8-D-ribofuranóza 5HO-CH2 B-D-2-deoxyribóza 2-deoxy-8-D-ribofuranóza Nukleotidy (nomenklatura) 3' OH H 2' OH H 2' -deoxyadenozin-5' -monofosfát 2' -deoxycytidin-5' -monofosfát \ « ATP, GTP Polynukleotidový řetězec • Významné strukturní rysy: O5'- a 3'- konec polynukleotidového řetězce O Páteř polynukleotidu (pentózafosfátová kostra, cukr-fosfátová kostra) O Prodlužování (syntéza) polynukleotidového řetězce -probíhá vždy ve směru 5-3' Část polynukleotidového řetězce DNA 5' -konec N N «- N-glykozidická vazba "A \ H 3] páteř polynukleotidu Strukturní úrovně DNA Polydeoxyribonukleoti- -► primární struktura dový řetězec i dvoušroubovice DNA _» sekundární struktura ^nadšroubovicové vinutí nadšroubovice DNA terciární struktura superhelix nadšroubovice relaxovaná DNA kružnicová nebo lineární *zrušení nadšroubovicového vinutí Párování bází párování bází = spojování protilehlých bází vodíkovými vazbami a) mezi dvěma řetězci = duplex b) mezi třemi řetězci = triplex c) mezi čtyřmi řetězci = kvadruplex Watsonovo-Crickovo párování bází N H adenin (aminoforma) tymin DNA (ketoforma) Watsonovo-Críckovo párování bází N 0 NH H-N N N H N N —H - -0 H guanin (ketoforma) N H cytozin (aminoforma) Watsonovo-Críckovo párování bází adenin uracil (aminoforma) (ketoforma) Charakteristika dsDNA 1. společná osa 2. komplementarita řetězců 3. vnitřní část tvoří báze AT a GC 4. páteř - osa = 1nm 5. antiparalelizmus = směr fosfodiesterových vazeb S'-B* a 3'-5' 6. Chargaffova pravidla A+G G+c Ť+Č~ = 1 Ä+Ť" ^e různý 7. planární charakter bází 8. menší a větší žlábek = místa vazby proteinů k DNA 3+9 12 AGGGGGGGAAGG puriny 3+9 " 12 TCCCCCCCTTCC Pyridiny 9+9 18 . o , ÍO/rr\ 3^3"= =>e ruzny (%GC) Sekundární struktura DNA (schéma dvoušroubovicové DNA - konformace B) vzdálenost mezi dvěma pary bazi Jo^34 nm vzdálenost páteře od osy 3,4 nm v jeden závit C 10,5 bp Velký a malý žlábek na dsDNA Rekogniční kód DNA INTERAKCE DNA S PROTEINY velký žlábek malý žlábek velký žlábek KEY: ^) = H-bond acceptor ^ = H-bond donor (P) = hydrogen atom (^) = methyl group malý zlabek Antíparalelísmus komplementárních řetězců dsDNA = opačný směr fosfodiesterových vazeb 5'-konec oh a 3'-konec deoxyribóza fosfodiesterová vazba 5'-konec Vinutí dvoušroubovice DNA • Vinutí = mnohonásobné otáčení jednoho řetězce kolem druhého • Vinutí může být pravotočivé nebo levotočivé Vinutí dvoušroubovice DNA Konformace dvouřetězcové DNA (RNA) • Konformace = prostorové uspořádání biomakromolekuly do struktury, která je za daných podmínek energeticky nejvýhodnější • Konformace DNA závisí na: O nukleotidové sekvenci O obsahu vody v prostředí O iontové síle prostředí Konformace dsDNA A-DNA B-DNA menši žlábek menši žlábek větší žlábek větší žlábek menši žlábek větší žlábek A, B = pravotočivá A-DNA • dsDNA při vysoké konc. solí nebo dehydrataci • dsRNA, DNA/RNA hybrid, Z-DNA • vysoké konc. solí • úseky obsahující (GC)n nebo (GT)n Z = levotočivá Z-DNA Terciární struktura DNA • Terciární struktura dsDNA = nadšroubovice • Vzniká zavedením dalšího vinutí (záporného nebo kladného) do dvoušroubovice. • Nadšroubovice se může vytvářet jak z relaxované uzavřené kružnicové DNA, tak i z lineární DNA • Záporné vinutí vzniká odvinováním dvoušroubovice (ubíráním závitů), kladné vinutí jejím svinováním (přidáváním závitů). Konformace dvouřetězcových kružnicových molekul DNA Kovalentně uzavřené kružnicové Konformace dvouřetězcových kružnicových molekul DNA Lineární (LIN) 5' 3' 3' 5' Lear double-stranded DNA molecule (a) Circular DNA molecule (b) Otevřená kružnicová DNA (OC forma) superhelikální kovalentně uzavřená kružnicová molekuly (CCC forma) (OC forma) (CCC forma) Nadšroubovícové a relaxované oblastí v lineární dvouřetězcové DNA závity solenoidové relaxovaná nadšroubovice smyčky oblast Eukaryotická DNA, která je lineární a dvouřetězcová, se váže k proteinovému lešení. Tvoří se v ní závity nadšroubovice, solenoidové smyčky a také relaxované oblasti. Přechod relaxované DNA do nadšroubovícové levotočivá pravotočivé solenoidové nadšroubovice smyčky Parametry nadšroubovice 1 celkove cislo vinuti dvousroubovicovečíslů nadšroubovicové číslo i w i 1 CetKovy po cet za vi- Počet závitu či překři- Počet nadš roub ovico-tů č j překřížení jed- žení jednoho řetězce vých závitů čipřekří-noho řetězce druhým druhým v dvoušrcubo- žení dvousroubovice v nadšroubovici. vici. y nadšroubovici. T a L jsou kladna cisla W je záporné, když vyjadřuje počet záporných nadšroubovicových závitů, nebo kladné, jestliže vyjadřuje počet kladných nadšroubovicových závitů Příklad vztahů mezí veličinami L, T a W Přechodné stavy - vzniká pnutí volné lineární dsDNA volné konce L = 16; T = 16; W = 0 konce xxxxxxxxxoxxxooc 1 2 3 4 5 6 7 8 910111213141516 početzávítů Spojen/ relaxovaná kružnlcová dsDNA"*- volných—^ 15 16 -i konců. Upevnění volných konců. částečně odvinutá kružnicová dsDNA Odvinutí 4-šesti závitů. Spojení obou konců. Uvolnění pnutí. nadšroubovice L= 10 Vnesení záporného . nadšroubovicového vinutí L se sníží o počet nadšroubovicových zavitu Přechod relaxované uzavřené dsDNA do nadšroubovíce nebo toroidní (solenoidní) dsDNA Uzavřená relaxovaná pravotočivá dsDNA Zavedení záporného nadšroubovicové-ho vinutí. Ubírání závitů (odvinování). 1 Záporná nadšroubovíce Má záporné vinutí. Je pravotočivá. Proti relaxované dsDNA má nižší hodnotu L. LL0 pravotočivá toroidní (solenoidní) dsDNA L = celkové číslo vinutí po svinování nebo odvinování L0 = celkové číslo vinutí před svinováním nebo odvinováním Účinek topoizomerázy I topoizomeráza I Vytvoření zlomu Přesunutí druhého v jednom řetězci řetězce přes zlom zlom = přerušení fosfodiesterové vazby mezi sousedními bázemi Mechanismus účinku topoizomeráz I a II typu Nadšroubovicová DNA Typ II Zlom v jednom řetězci Zlom v obou / řetězcích Řetězec se přesune přes zlom a spojí se L se sníží o 1 Oba řetězce se přesunou přes zlom a spojí se L se sníží o 2 Nadšroubovicové uspořádání dsDNA Kružnicová uzavřená Nadšroubovicová Nadšroubovicové uspořádání DNA (relaxovaná) DNA (negativní) DNA - bakteriální chromozom Typy sekvencí zodpovědné za vznik alternativních struktur • Jedinečná DNA sekvence: ....AATGCTGATGTCTGACTCGGA... • Repetitivní (opakující se) sekvence neboli repetice (jednotka repetice, délka jednotky repetice, četnost repetice). ATG...ATG....ATG....ATG... (jednotka = ATG, délka = 3 nukleotidy, četnost = 4x) • Tandemová repetice ..ATGCATGCATGC. • Přímá repetice (5'....ATGC.....ATGC.....3') opakuje se na temže řetězci ve stejném směru (5'—► 3') Obrácená repetice (opakuje se na druhém řetězci v obráceném směru - potenciál pro vytvoření vlásenky nebo vlásenky se smyčkou) 5' ...ATGCGCAX-..3'__► palindrom (vlásenka) 3...TACGCGTA...5' (madam; Karla zamazal rak, tahat) (a dál vidí lítat netopýry potentát i lid i vláda) 5 ...ATGCXXXXXGCAT...3' vlásenka se smyčkou 3'.. TACGYYYYYCGTA... 5' -* (na dsDNA vzniká křížová struktura) • Dlouhá koncová repetice (sekvence LTR) 5'-ATGC...GCAT.........................ATGC...GCAT-3' 3' -TACG...CGTA.........................TACG...CGTA-5' LTR = long terminal repeat Schéma vlásenkových struktur DNA (RNA) Vlásenkové struktury se vytvoří na jednom řetězci DNA v místech, kde se vyskytují obrácené repetice. vlásenka ATCTA TAGAT obrácené repetice vlásenka se smyčkou ATCTA TCCAG TAGAT A T C T A T A G A T A T C T A T A G A T Vznik křížových struktur křížová struktura bez smyčky TCTATAGA ...... m AGATATCT palindrom lA T C T A G A T křížová struktura se smyčkou mim ATCTA TCCAG TAGAT ..... i m i i TAGAT AGGTC ATCTA T- A T C T A T A Denaturace a renaturace dsDNA • denaturace dsDNA = přechod dsDNA na ssDNA, opačný pochod = renaturace • k denaturaci dsDNA dochází zvyšováním teploty roztoku, k renaturaci snižováním teploty (nebo změnou pH prostředí z neutrální hodnoty na alkalickou nebo kyselou) • denaturace dsDNA se projevuje hyperchromním efektem, tj. zvýšením absorbance UV-světla o vlnové délce 260 nm. • hodnota Tm nebo-li teplota tání = teplota, při které zdenaturovalo 50% molekul dsDNA Denaturační křivka dsDNA Arx 260 Ar25 260 1 A ■ t v ' I A *= absorbance roztoku DNA při 260 t>25°C. I Ar25 ^ 2 260 = Qbsorbance roztoku DNA pn t = 25°C. 1,2 1,1 Absorbance se stanoví při 260 nm 50 % molekul DNA zdenaturováno 50 60 70 80 T 90 m teplota roztoku DNA (