Aplikace molekulární biologie - Genové inženýrství
Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných
či nových genů a jejich zaváděním do organizmů s
cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu.
Metodickým základem genového inženýrství jsou
manipulace s DNA in vitro (zejména klonování genů a
jejich cílené úpravy). Cílené změny v genetické
informaci lze provádět také in vivo.
Objevy, které umožnily cíleně manipulovat s DNA
restrikční endonukleázy a další enzymy
rozštěpení DNA v přesně definovaném místě
spojení dvou cizorodých DNA (DNA z různých organismů)
syntéza DNA ve zkoumavce
sekvenování DNA
stanovení molekulární struktury genu
klonování genů
zavedení genu do nepříbuzných organismů
(překonání mezidruhových barier)
pomnožení genu do neomezeného množství
cílené zavádění mutací do genu
studium projevu pozměnených genů (mutace funkce)
Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství
1965 – objev plazmidů
1970 – izolace prvního restrikčního enzymu
1972 – příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro
1973 – začátek klonování genů
1975 – Asilomarská konference
1977 – první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny
1977 – sekvenování DNA
1978 – příprava lidského inzulinu v bakteriích
(od r. 1982 vyráběn komerčně)
**** mutageneze in vitro – proteinové inženýrství
**** příprava transgenních organismů (rostliny, živočichové)
1980 – genové terapie
1983 – objev a zavedení PCR
1997 – klonování živočichů
Po roce 2000: editace genomů - rekombinantní meganukleázy –
Využití genového inženýrství
- Základní výzkum: studium struktury a funkce genů a genomů
- Praktické aplikace:
Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu
vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání
produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier
Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících
nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj.
Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů
příprava mikroorganizmů pro biotechnologie,
zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat
(odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce
cizích látek v tělech rostlin a zvířat)
Genová terapie - léčba genetických chorob
transformace
elektroporace
infekce
mikroinjekce
nastřelení
Cizorodá DNA
Klonování genů pomocí vektorů
Klonování genů
pomocí PCR
Cizorodá DNA
Klonovaná
cizorodá DNA
Rekombinantní
molekula DNA
Selekční marker
Příprava rekombinantních
molekul DNA
Štěpení vektoru restrikční
endonukleázou, spojení
vektoru a cizorodé DNA
enzymem DNA-ligázou
Konstrukce (lidské)
genomové knihovny
© Espero Publishing, s.r.o.
Soubor klonovaných fragmentů
genomové DNA, které
dohromady reprezentují celý
genom příslušného organismu.
Mutageneze in vitro
site-directed mutagenesis
místně cílená (řízená) mutageneze
lokalizovaná mutageneze
Mutace se vnášejí do izolované DNA (= in vitro)
typy mutací: substituce, delece, inzerce
Cíle: analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK
Objasnění funkce genů a regulačních oblastí
Cílení změny aminokyselin v proteinech
Příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství)
Příprava transgenních organismů
DNA (genotyp) fenotyp
klasická genetika
reverzní genetika
reverzní genetika, genetika „naruby“
Mutageneze in vitro
Mutageneze in vitro
náhodná cílená
manipulace s restrikčními místy
inzerce linkerů
chemická mutageneza
inkorporace chybných bazí
vyhledání genu nebo
funkčních oblastí na DNA
oligonukleotidová mutageneza
(umístění do konkrétního místa)
syntéza genů
(kazetová mutageneza)
záměny bazí nebo kodonů
cílené změny struktury
proteinů
GEN
mutace
Způsoby používané při mutagenezi in vitro
1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA
2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru)
3. Chemická mutageneze
4. Kazetová mutageneze
5. Metody založené na PCR
6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA
Stanovení
sekvence
pozměněného
genu
Testování funkce pozměněného genu
Obecná strategie
při mutagenezi in vitro
Vytvoření mutace
Vytváření inzercí nebo
delecí v sekvenci genu
Vytváření mutací
v restrikčním místě
exonukleáza
výběr dNTP
Substituce
delece
inzerce
GGT A CTCT
CCA C GAGT
CCACGAGT
T
GGTACTCT
GGTGCTCT
CCACGAGT
GGT A CTCT
CCA T GAGT
Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů
Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů
Rodičovská
(nemutantní) DNA
Nově syntetizovaná
(mutantní) DNA
Nově syntetizovaná
mutantní DNA
Mutagenní
oligonukleotid
Dvojřetězcová
heteroduplexní DNA
mutantní homoduplex
Přenos do E.
coli
rodičovský homoduplex
„umělý“ gen
Kazetová mutace
Editace genomů (chromosome enginnering)
Cílový gen
Delece/inzerce
Nehomologní
spojování konců
Dvojřetězcový
zlom
Homologní
rekombinace
Náhrada
sekvence
donorovou DNA
endonukleáza
Nukleázy používané pro editaci genomů
-Meganukleázy
-ZNF
-TALEN
-CRISPR/Cas
17
Typy nukleáz používané pro editaci genomů
18
Možnosti editace genomů pomocí systému CRISPR/Cas9
TSS = transcription start site
EGFP = fluorescenční proteiny
dCas9 – deficientní na
nukleázovou aktivitu
Proteinové inženýrství
Cíl: změna struktury a funkce proteinů prostřednictvím technologie
rekombinantní DNA
změny vazebných oblastí proteinů
termostabilita
rychlost a substrátová specifita reakcí
citlivost k oxidaci a toxickým látkám
Předpoklady pro vytváření funkčních proteinů
klonovaných genů v nepříbujzných organismech
1. Transkripce genu
přítomnost funkčních regulačních oblastí pro transkripci
promotor, terminátor
2. Translace přepisu genu
přítomnost signálů pro translaci
SD, iniciační a terminační kodon
výběr kodonů pro tRNA daného organizmu
3. Posttranslační modifikace
4. Transport proteinu
signální sekvence funkční v daném hostiteli
Zajištění exprese cizorodých genů
bakteriální gen eukaryotický gen
P RBS/transport kódující oblast T P/E RBS/transport kódující oblast
cDNA
Syntéza DNA de novo
Hybridní (chimerický) gen
Fúzní protein zralý proteinštěpení, purifikace
prokaryotická část eukaryotická část
Gen pro inzulin
pre-mRNA
mRNA pro
pre-proinzulin
pre-proinzulin
(preprohormon)
proinzulin
(prohormon)
aktivní inzulin
(zralý hormon)
DNA
řetězec C
řetězec C
řetězec C
řetězec B
řetězec A
řetězec A
řetězec A
řetězec B
Enzymové
štěpení řetězec B
pre-sekvence
mRNA
ribozom
Translace
Sestřih
Transkripce
Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách
CNBr štěpí peptidovou vazbu
následující za metioninem
Transformace
E. coli
Působení
kyanbromidem
(CNBr)
Purifikace
řetězců A a B
β-galaktozidáza
Purifikace fúzního
proteinu B-gal-inzulín
Kultura buněk
Aminotermální část
zralého řetězce B
Vytvoření aktivní
formy inzulínu
disulfidová vazba
Aktivní inzulín
řetězec Břetězec A
řetězec Břetězec ABakteriální
promotor
Infekční
částice HBV
Plášťový protein
Klonovaná DNA viru HBV
Izolace sekvence
kódující HBsAg
Kvasinkový
promotor
transkripce
Vnitřní protein
Ligace
Počátek
replikace pro
kvasinky
Počátek
replikace pro
bakterie
Kvasinkový
expresní vektor
Kvasinkový
terminátor
transkripce
Transformace kvasinkových
buněk
Selekce buněk, které
obsahují plazmid
Kultura buněk
ve fermentoru
Shromáždění buněk
centrigací
Rozbití kvasinkových buněk
Purifikace částic HBsAg
Výhody:
1. Přesně definovaný antigen
2. Stabilní, skladovatelný
3. Nevyvolává vedlejší účinky
Nevýhody
1. Drahá purifikace
2. Odlišná konformace proteinu
Příprava podjednotkové vakcíny viru hepatitidy B (HBV) ve kvasinkách
Příprava humanizovaných protilátek
Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka
Variabilní,
konstantní a
hypervariabilní
oblasti jsou
z protilátek myši
Konstantní oblast je
z lidské protilátky,
variabilní a
hypervariabilní oblasti
jsou z myši
Hypervariabilní
oblasti jsou
z myších protilátek,
ostatní jsou lidské
CDRs -complementarity
determining regions
Protilátka vázající se na
antigeny na povrchu
tumorových buněk
Protilátka vázající se
na antigen na povrchu
T buněk
manipulace
na úrovni cDNA
rekombinace
protilátka s dvojí
specifitou
Tumorová buňka T buňka
T buňka usmrcuje
tumorovou buňku
Protilátka s dvojí specifitou
Jednořetězcové protilátky a imunotoxiny
Záměna peptidového linkeru za disulfidický
můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu
scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití
- exotoxin A Pseudomonas
- difterický toxin
- ricin
Protinádorové působení (vazba
na receptory a povrchové proteiny
nádorových buněk)
Např. fúzní protein
HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas
Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1
A B
human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of
breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or
overexpression of its protein product.
Přenos cizích genů do rostlin pomocí Ti-plazmidu
Živné medium
s růstovými faktory
Transgenní
rostlina
přenášející
geny do
potomstva
Protoplast disky
Ti-vektor nesoucí cizí gen
T-DNA
Geny pro
katabolismus
opinů
Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens
Část plazmidu přenášená do
rostliny
Geny pro
přenos T-DNA
do rostlinných
buněk
Geny zodpovědné
za transformaci
rostlinných pletiv
Geny zodpovědné
za tvorbu opinů v
rostlinných buňkách
25 bp LB
25 bp RB = sekvence nezbytná
pro začlenění T-DNA do
genomu rostliny
Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem Agr. tumefaciens
Poraněná
rostlina
Infekce rostliny
bakterií s
Ti-plazmidem
Přenos T-DNA do
rostlinné buňky
Začlenění T-DNA do
jádra rostlinné buňky
opiny
Vytvoření
krčkového
nádoru
fytohormony1.
5.
4.
3.
2.
T-DNA
Využití genového inženýrství u rostlin
A. Potraviny a krmiva
Ovlivňování agronomických vlastností
Rezistence k herbicidům
Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.)
Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický
stres – zasolení půd)
Modifikace posklizňových vlastností
Prodloužení skladovatelnosti
Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým
chorobám
Vylepšování nutriční hodnoty a chuti
Využití genového inženýrství u rostlin
B. Produkce sekundárních metabolitů
Studium a přenos genů pro klíčové enzymy biosyntetichých
drah
Farmakologické přípravky
C. Technické plodiny
Produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití
Biodegradovatelné plasty
D. Fytoremediace
Transgenní rostliny
A. Rezistence k virům
Zavedení genu pro plášťový protein VTM do Ti-plazmidu, přenos do tabáku,
rajčat
Vakcína je multivalentní, působí na jiné virózy
B. Rezistence k hmyzím škůdcům
Vnesení genu pro endotoxin z Bacillus thuringiensis působícího na
hmyzí škůdce (BT-rostliny: kukuřice, tabák, brambor, aj.)
Nepřímý způsob – naklonování genu pro tvorbu toxinu do bakterií
kolonizujících rostliny (listy, kořeny) – např. Pseudomonas fluorescens
C. Rezistence k herbicidům
Např. glyfozátu (nejpoužívanější neselektivní herbicid) inhibuje
enzymy tvorby esenciálních aminokyselin
1. Vnesení genu pro tvorbu cílového enzymu (větší množství zajistí
odolnost rostlin)
2. Vnesení genu pro tvorbu pozměněného (méně citlivého) enzymu
3. Vnesení genu pro tvorbu enzymu, který inaktivuje herbicid
Transgenní rostliny
D. Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných
produktů využívaných průmyslově
Rajče FlavrSavr fy Calgene – transgen: antisense mRNA genu pro
polygalakturonidasu – prodloužená konzumní zralost
Rýže – vhodná pro alergiky
Řepka – olej ze semen obsahující zvýšený podíl kys. Laurové
(mýdla a detergenty)
Řepka – olej ze semen bohatý na myristát (kosmetika) nebo kys. eruková
(mazadla a výroba nylonu)
Arabidopsis a řepka – tvorba biodegradovatelných polymerů v chloroplastech
využitelných jako plasty (polyhydroxybutyrát, polymery podobné
polyesteru ve vláknech bavlníku)
E. Produkce vakcín rostlinami („jedlé vakcíny“)
Syrová zelenina obsahující antigen (vakcínu), který indukuje tvorbu
imunoglobulinů mukózního imunitního systému v zažívacím traktu
Povrchový antigen viru hepatitidy B
Podjednotka B toxinu cholery
Bt-rostliny
Rostliny rezistentní k hmyzím škůdcům
Promotor
Ligace
Binární vektor
Terminátor
Bacillus thuringiensis
Klonovaný gen pro toxin
Štěpení restrikčními enzymy
Fragment genu kódující
aminokyseliny 454-615
Přenos do Agrobacterium
Infekce rostlin
Regenerované transgenní rostliny
exprimující vysoké hladiny Bt toxinuNapadení
larvami hmyzu
List z rostliny, usmrcující
larvy, zůstává nepoškozen
List z kontrolní
rostliny je napaden
Syntetický gen pro toxin kódující
aminokyseliny 1-454
Transgenní BT-kukuřice
Obsahuje navíc dva až tři geny:
1.Gen(y) podmiňující odolnost rostlin proti hmyzím škůdcům
(bakteriální gen z Bacillus thuringiensis zodpovědný za
tvorbu deltatoxinu, který je jedovatý pro některé skupiny
hmyzu, ale zcela neškodný pro savce a člověka)
2.Gen pro odolnost vůči herbicidu Basta (jeden z nových
herbicidů, který má krátkou životnost a je šetrný
k prostředí). Gen pochází z bakterie Streptomyces.
3. Gen pro odolnost k antibiotiku ampicilinu (selekční marker použitý pro
selekci transgenních rostlin (buněk) při jejich přípravě). Gen pochází
z bakterie.
Místo rezistence k antibiotikům jiné selekční systémy
Cíle studia přenosu genů do živočišných
buněk
1. Studium funkce genů a způsobu jejich regulace
2. Příprava transgenních organismů
studium fungování genů v rámci celého organismu
příprava živočichů s cíleně upravenými geny
modely pro studium genetických chorob
příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi,
vytváření cizorodých proteinů
hledání možností pro genovou terapii
Způsoby přenosu cizích genů do savčích buněk
DNA klonovaná
ve vektoru nebo
infekce virovým
vektorem
Sledování exprese
mRNA v žabích
oocytech
Projádro
transfekce DNA
(Ca-korecipitace,
elektroporace)
Buňky ve
tkáňových
kulturách
embryonální
kmenové
buňky
infekce
rekombinantním
retrovirem
náhrada
jader
Transgenní zvíře
(+/- mozaikové)
Začlenění DNA
homologní
rekombinací
Selekce a
přenos do
blastocyst
mikroinjekce
DNA
vývoj embrya
v náhradní matce
blastocysta
infekce
rekombinantním
retrovirem
mikroinjekce
DNA
Příprava transgenních savců
Vytváření transgenních myší mikroinjekcí cizího genu do
oplozeného vajíčka
DNA SV40, tkHSV,
lidský inzulin,
B-globin,
interferon
Důkaz transgenu, např. PCR,
in situ hybridizací
Úspěšnost uchycení 10-30%
exprese
umlčení
Až 40% potomstva obsahuje
transgen začleněný
náhodně, obvykle
tandemově ve více kopiích
v jednom chromozomu
Manipulace s embryonálními kmenovými
buňkami
Terapeutické
klonování,
náhrada tkání
a orgánů
Vnesení genů
Vrstva fibroblastů,
LIF
Transfekce,
elektroporace,
retrovirová infekce
Příklady transgenních živočichů
Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro
růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů
Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují
toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv)
Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky)
Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a
farmakologii)
Ovce s vylepšenou srstí
Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny
studium lidských genetických poruch:
neurodegerativní, imunitní, hormonální choroby,
vliv faktorů na organismus faktorů (např. léků, mutagenů)
studium poruch paměti
Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty)
orgány s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka
Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních
(animal farming: zvířata jako bioreaktory)
Myš nesoucí gen pro lidský růstový hormon
Zvířata jako bioreaktory: „animal farming“
Příklady látek vytvářených v transgenních
zvířatech
Antikoagulans krveLidský protein Cprase
Léčba cystické fibrózyRegulátor CFTRovce, myš
Léčba nanismuLidský růstový hormonkoza
Náhražka krve při transfúzihemoglobinprase
Navození srážení krveFaktor pro srážení krve VIII, IXovce
Rozpouštění krevních sraženinTkáňový aktivátor plazminogenukoza
Léčba rozedmy plicAlfa-1-antitrypsinovce
VyužitíLátkaZvíře
koza – protein pavoučího vlákna v mléce, atp.
kráva – lysozym nebo lysostafin v mléce
Klonování savců doplněné o genetickou modifikaci
Možné způsoby léčby genetických onemocnění
1. Úprava diety - karenční terapie (galaktosemie,
fenylketonurie)
2. Substituční terapie (hemofilie, diabetes, nanismus)
3. Genová terapie (kauzální léčba)
vnesení funkčního genu (funkční alely)
do genomu
cílená záměna poškozeného genu homologní
rekombinací
cílené usmrcování geneticky pozměněných buněk
cílená inhibice exprese genů zodpovědných
za genetickou poruchu
Genové terapie
Léčba genetických chorob
dědičných
nádorových
Podle typu buněk, do nichž jsou geny vneseny:
A. genová terapie zárodečných buněk
B. genová terapie somatických buněk
Podle způsobu přenosu genů:
A. genová terapie in vitro (ex vivo)
B. genová terapie in vivo
1/500LDL-receptorPředčasné arteriosklerotické změny cév.Familiární
hypercholesterolemie
1/3 500α1-antitrypsinPlicní emfyzém, (rozedma plic).Deficience na
α1-antitrypsin
1/2 500transmembrá-nový
regulátor CF
Porucha v transportu Na-, zahlenění
dýchacích cest, embolie.
Cystická fibróza, CF
1/106
1/3 000
mužů
?
1/106 mužů
1/12 000
1/106
Četnost
Příklady lidských chorob podmíněných monogenně a připadajících v úvahu pro genovou
terapii v současnosti
hypoxantingua-
ninfosforibozyl-
transferáza
Usazování kyseliny močové v kloubech a
ledvinách, poruchy CNS.
Leschův-Nyhanův
syndrom
dystrofinSvalová ochablost.Duchennova svalová
dystrofie
glukocerebro-
zidáza
Nádory sleziny, zvětšení jater, žluté zbarvení
(pigmentace) kůže.
Gaucherova choroba
faktor VIII, faktor IXPorucha v srážlivosti krve, krvácivost.Hemofilie A + B
fenylalaninhy-
droxyláza
Fyzická a psychická retardace.Fenylketonurie
adenozinde-
amináza
Defektní T-lymfocyty, porucha v tvorbě
protilátek, narušení imunitního systému.
Deficience adenozindeaminázy
(ADA)
Produkt defektního
genu
Hlavní symptomyNemoc
Genová terapie in vitro
Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro
zavádění genů do organismu
1. Snadné získání buněk z těla
2. Snadná kultivace v kulturách in vitro
3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů
4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se
musí pomnožovat přetrvávat po dostatečně dlouhou
dobu
Kmenové buňky kostní dřeně
Kožní fibroblasty
Hepatocyty
Myelocyty
Schéma postupu při genové terapii deficience
na adenozindeaminázu
Schéma genové terapie melanomu
TIL = tumor infiltrující lymfocyty; TNFα = tumor nekrotizující faktor
Viry jako vektory
nejpoužívanější v GT, velmi dobře infikují lidské buňky. Asi 70% pokusů s GT
Onkoretroviry: transgen začleňují do chromozomu do dělících se buněk výhoda
při léčbě nádorů (např. nádory mozku). Riziko inzerční inaktivace
endogenů
Adenoviry: infikují nedělící se buňky, DNA zůstává jako epizom v jádře.
Jsou bezpečné, ale exprese je krátkodobá. Problém je imunogenicita.
Uplatnění tam, kde je nutná vysoká exprese během krátké doby, např při
léčbě rakoviny pro zabití buněk.
Adenoasociované viry AAVs: Nepatogenní, schopné infekce jen
s využitím adenovirů jako pomocných virů k replikaci. Integrují DNA do
chromozomu na specifické místo, umožňující dlouhodobou expresi bez
rizika inzerční mutageneze.
Lentiviry: HIV (retrovirus) – infikují nedělící se buňky. Do chromozomu se
integrují náhodně - dlouhodobá exprese. Nutnost odstranění virových genů
a zachování schopnosti infikovat nedělící se buňky.
Herpes simplex viry: Mají tropii pro CNS, v latentní infekci jsou
epizomální, tj. dlouhodobě exprimují transgen a šíří jej do okolní synaptické
sítě. Hlavní úloha: přenos genů do neuronů pro léčbu nervových chorob
(Parkinsonova ch.) a tumory CNS.
Zábrana exprese genů navozená protismyslovou RNA
Příklady léčby nádorů pomocí genové terapie
Použitá strategie genové terapie
Genová terapie nádorů
1. Dodání genu: obnova funkce nádorových supresorových
genů
2. Inaktivace genu: zábrana exprese aktivovaného onkogenu
3. Genetická manipulace: vyvolání apoptózy nádorových
buněk
4. Modifikace nádorové buňky tak, aby byla více antigenní
a byla zničena imunitním systémem
5. Modifikace dendritických buněk ke zvýšení nádorověspecifické
imunitní odpovědi
6. Použití geneticky upravených onkolytických virů selektivně
usmrcujících nádorové buňky
7. Genetická modifikace nádorových buněk zajišťující
konverzi netoxického prekurzoru na toxický produkt
Genová terapie in vivo
Do nádoru jsou injikovány buňky, do
nichž byl in vitro vnesen retrovirový
vektor, který obsahuje gen pro
tymidinkinázu (TK). Vektor se
uvolňuje a infikuje okolní nádorové
buňky, v nichž se pak vytváří TK
(retrovirus je schopen infikovat jen
dělící se buňky!). Do těla pacienta
je intravenózně podána netoxická
látka gancyklovir (gcv), která je TK
konvertována na toxický
gancyklovir-trifosfát usmrcující
nádorové buňky.
Inject brain tumour with
engineered retrovirus
containing TK gene
A few cells
are modified
Treat with
ganciclovir
Modified cells and
„bystanders“ killed. Healthy
cells away from the tumour
are not affected
Gene therapy for brain tumours. The tumour is directly injected with a retrovirus
containing the mouse thymidine kinase (TK) gene and a few cells take up the
vector, shown in blue. These cells convert the prodrug ganciclovir into an active
form and are killed (grey cells). Because of the bystander effect surrounding
cells are also killed.
X-SCID – těžká kombinovaná imunodeficience vázaná na X
chromozom: mutace genu kódujícího γ c-řetězec receptoru pro interleukin
2, která zabraňuje normálnímu vývoji T-lymfocytů a „killer“ buňkám
(náchylnost k infekcím, bez transplantace kostní dřeně smrt do 1 roku
života)
Odběr kostní dřeně
Kultivace buněk in vitro, infekce
retrovirovým vektorem s genem γ c,
pomnožení buněk
Vrácení buněk do těla pacienta
10 pacientů vyléčeno 2 pacienti onemocněli leukémií
v důsledku aktivace onkogenu
retrovirem
Příklad úspěšné léčby chorob genovou terapií