doc. Paleček Úvod, analýza komplexů
doc. Paleček Úvod, PPI, skládání komplexů
Dr. Muller Chaperony
Mgr. Adamus Ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom
doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy
doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy
Mgr. Balkoová replikace DNA
Dr. Šebesta Oprava DNA, homologní rekombinace
Dr. Blažek Cyclin/CDK komplexy v buněčném cyklu a transkripci
doc. Paleček Chromatinové komplexy
doc. Paleček Evoluce proteinových komplexů
doc. Paleček Zkouška - test
DNA-proteinové komplexy
Bi7015 - Chemické vlastnosti, struktura a interakce
nukleových kyselin (doc. Fojta)
DNA-proteinové komplexy
Komplexy spojené s transkripcí (až 5% genomu)
Komplexy spojené s duplikací genomu
Komplexy podílející se na opravě genomu
Chromatinové strukturní komplexy
http://npidb.belozersky.msu.ru/ 2500 struktur v PDB (v roce 2014)
G
E
N
O
M
DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů (enhanceosom)
Obecné TFII komplexy a proces transkripce
Komplexy spojené s transkripcí
Enhanceosom
koaktivátory/korepresory
(protein-proteinové interkce)
Tvarová a nábojová specifita DNA determinuje typy DNAvazebných
domén (oproti velké rozmanitosti protein-proteinových
interakčních domén)
- proteiny interagují s cukrfosfátovou
kostrou (fosfát) nebo přes žlábky s
bazemi (vod. vazba, tvar šroubovice)
- Interakce sekvenčně nespecifické
(kostra – histony; strukturně specifické
- HMG proteiny) nebo sekvenčně
specifické (kostra+žlábky –
kombinace: BglII (AGATCT) a BamHI
(GGATCC) kontaktují stejné báze a
„čtou“ zakřivení okolní DNA …)
„shape readout“
zakřivení kostry souvisí se sekvencí
B-DNA
„shape readout“
zakřivení kostry - souvisí se sekvencí a prostředím Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010
+ triplex,
kvadruplex …
Vazba DNA-protein může indukovat
změny
- vazba proteinu může indukovat změny ve struktuře DNA
- vazba DNA na protein často indukuje změny v jeho struktuře
- případně u nestrukturovaných proteinů strukturu indukuje (cJun/c-Fos
= šroubovice až po navázání dimeru na DNA)
1jj4 (… např. histony) 2kei, Lac represor
(Leu do malého žlábku)
Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010
Vazba proteinů s DNA prostřednictvím
solných můstků• fosfáty mohou interagovat s
Arg a Lys – solné
můstky/salt bridges
(pozitivní náboje Arg a Lys
vytváří vazbu s negativním
nábojem fosfátové skupiny)
• Elektrostatický náboj/povrch
naznačuje vazebné
schopnosti proteinu
Gajiwala & Burley, COiSB, 2000
Minor groove Minor grooveMajor groove Major groove
sekvenčně-specifický protein kontaktuje báze („direct“
readout) – skrze velký nebo malý žlábek – velký žlábek je
lépe přístupný – vodíkové vazby (donor vs akceptor elektronu)
DAA mADA
Jak odliší
protein různé
páry bazí?
“base readout”
Pozice donor vs
akceptor
+ metyl skupina
Metylace Ade
(C6NH2) u bakterií
změna!
AAD ADA
CH3
AAD
ADAm
Vazba proteinů s DNA
prostřednictvím vodíkových vazeb
• Velký žlábek má velikost
odpovídající rozměrům šroubovice
a má
exponované H-vazebné
skupiny
• Ade zbytky C-6(NH2) a N-7
mohou tvořit specifické
vodíkové vazby s Gln a Asn
• Gua může tvořit specifické
vodíkové vazby s Arg
Silná vazba, sekvenčně specifická - afinita nM – M
Slabá vazba, strukturně specifická - afinita M – mM
Rohs et al, Annu Rev Bioch, 2010
- více jak 70 SCOP superrodin (strukturních motivů)
- dle sekundárních struktur – -šroubovice (17), -listy (7),
smíšené  motivy (48)
přes aromatické AMK
(base stacking)
+ triplex, kvadruplex …
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ
– Leucinový zip
– Helix-loop-helix
• Helix-otáčka-helix
– HTH
– Winged helix
– TALE
• Zinkový prst
–  zinc-finger
– Hormon-receptor
– Loop-sheet-helix
– Gal4
• Histon, HMG-box
• -sheet motivy
-šroubovice
-listy
Luscombe et al, Genome Biology, 2000
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ (dle způsobu dimerizace)
– Leucinový zip (tzv. bZIP = basic)
(transkr. fakt. yGCN4, c-Jun/c-Fos=AP-1)
• 2 α-šroubovice
• coiled-coil (>30AMK, Leu, C-term)
• bazická část (N-terminus, navazuje na CC)
• bazická šroubovice vázána do VŽ
Interakce bazických AMK: Arg(232+240)=PO4, Arg(243)=Gua
Konsensus sekvence: TGACTCA
GCN4 – regulace genů pro syntézu AMK PDB: 1YSA
1YSA
1YSA
Jonesaspol.,NAR,2003
NUCPLOT
Konsensus sekvence: TGACTCA
GCN4
Efferl&Wagner,NRC,2003
Wikipedie
AP-1
Efferl&Wagner,NRC,2003
Wikipedie
AP-1
Kombinace – různá specifita/afinita
homo/hetero
heterodimery
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ (dle způsobu dimerizace)
– Leucinový zip (tzv. bZIP = basic –
transcr. fact. yGCN4, c-Jun/c-Fos)
• 2 α-helixy (2 x 60 AMK)
• coiled-coil (30AMK, Leu, C-term)
• basická část (N-terminus, navazuje na CC)
• bazická šroubovice vázána do VŽ
– Helix-loop-helix (c-Myc/Max, MyoD)
• CC a bazické části jsou odděleny smyčkou
• bazická šroubovice vázána do VŽ
• smyčka poskytuje větší flexibilitu pro vazbu
šroubovice-smyčka-šroubovice
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ
– Leucinový zip
– Helix-loop-helix
• Helix-otáčka-helix
– HTH
– Winged helix
– TALE
• Zinkový prst
–  zinc-finger
– Hormon-receptor
– Loop-sheet-helix
– Gal4
-šroubovice
• Obsahuje ~ 20 AMK ve dvou
šroubovicích vzájemně kolmých
-helix pro vazbu na DNA
(„recognition“) - -obrátka –
druhá šroubovice
Sekvenčně-specifická vazba
prostřednictvím „recognition“
šroubovice a velkého žlábku
nejčastější motiv u prokaryot homodimery
vážou palindrom.
sekvence
HTH motiv se obvykle vyskytuje
ve svazku 3-6 šroubovic
(stabilizovaných hydrofobním
jádrem)
motiv může být buď součástí
hlavního proteinu (Cro) nebo z
něj může pouze vybíhat (LacI)
Helix-turn-helix motiv (HTH)
Luscombe et al, Genome Biology, 2000
Helix-turn-helix motivy (spojené listy nebo šroubovicemi) –
odstup HTH (34Å) odpovídá jedné otáčce B-DNA
Sekvenčně se různé HTH příliš nepodobají
1. variabilita v rozpoznávaných sekvencích DNA
2. variabilita v pozici „recognition“ šroubovice ve velkém
žlábku (paralelně k rovině bazí nebo delší šroubovice jsou
paralelně k cukr-fosfátové kostře)
Liljas a spol.
6CRO 1LMB
„Winged“ helix (okřídlená šroubovice)
Gajiwala & Burley, COiSB, 2000
Luscombe et al, Genome Biology, 2000
- „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a -listy,
které poskytují další kontakty s DNA (smíšený  typ)
Méně často křídlo ve VŽ a cukr-fosfátová kostra se šroubovicí (hRFX1)
HTH
wing
Interakce bazí se šroubovicí (H3) a křídla s cukr-fosfátovou kostrou
Méně často křídlo ve VŽ a cukr-fosfátová kostra se šroubovicí (hRFX1)
PDB:1BC8
- „winged“ HTH v mnoha specifických
transkripčních faktorech, ale také v „general“
TFII faktorech (strukturní úloha)
Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012TAF1 (TFIID)
Histon H1/H5 interaguje s DNA vybíhající z
nukleosomů (kompaktnější struktura) – WHD
doména může vytvářet více kontaktů (H3
šroubovice-MŽ, wing-cukrfosfátová kostra,
protein-protein int.)
PDB:5NL0
PthXo1
23 repetic obtáčí DNA ve VŽ
Mak et al, Science, 2012TALEN technologie
Transcription activator-like effectors (TALE)
Patogenní bakterie injikují do rostlinných buněk
ovlivňují transkripci rostlinných promotorů
Interaguje otáčka/turn spíše než šroubovice PDB: 3V6T
Tandemové repetice (34)
AMK v pozicích 12 a 13
určují specifitu (repeatvariable
diresidue) –
hlavní:
HD, NG, NI, NN,
NS, HG, N*
Mak et al, Science, 2012
Interaguje otáčka/turn
spíše než šroubovice
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ
– Leucinový zip
– Helix-loop-helix
• Helix-otáčka-helix
– HTH
– Winged helix
– TALE
• Zinkový prst
–  zinc-finger
– Hormon-receptor
– Loop-sheet-helix
– Gal4
-šroubovice
Zinc-finger/Zinkový prst
- cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních listech
a -šroubovici
- smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ koordinovaný
4xCys nebo 2xCys + 2xHis
(tetraedrická struktura)
C2H2 motiv:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His
PDB grafika
Zinc-finger/Zinkový prst
- cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních listech
a -šroubovici
- smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ koordinovaný
4xCys nebo 2xCys + 2xHis
(tetraedrická struktura)
C2H2 motiv:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His
- 3x v Zif268, PDB=1zaa
- -šroubovice se váže do VŽ – v
tandemu obtáčí VŽ
- AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK
=> sekvenční specifita
- AMK na pozici 0 – 6; variancemi AMK v těchto pozicích lze
dosáhnout různé sekvenční specifity
 -šroubovice váže 2, 3 nebo 4 sousední páry bazí
- nejčastější jsou kontakty
Gua-Arg
- Gua se může vázat i na His,
Lys, Ser
- Ser se může vázat na T či A
Zif268
- Dobře charakterizované DNA-proteinové kontakty –je známá
specifita ZFs pro všech 64 možných kombinací 3 sousedních bp
- Lze pro specifickou sekvenci DNA poskládat ZFs – nová
technologie „zinc nuclease“ pro genové manipulace
http://zf.princeton.edu
PersikovaSingh,NAR,2014
„genome editing“
- Dobře charakterizované DNA-proteinové kontakty –je známá
specifita ZFs pro všech 64 možných kombinací 3 sousedních bp
- Lze pro specifickou sekvenci DNA poskládat ZFs – nová
technologie „zinc nuclease“ pro genové manipulace
Transcription activator-like
Perez-Pineraaspol.,COiCB,2012
šroubovice ve VŽ
64 variant pro všechny triplety
otáčka ve VŽ
2 AMK na 1 bázi
- CTCF obsahuje 11 zinkových prstů – k vazbě na DNA používá
v různých org. různé kombinace ZF
Ohlsson a spol., TiG, 2001
CTCF
- CTCF (zkratka z CCCTC factor)
- izolátor/insulator brání transkripci
- váže se mezi transkripční aktivátory a
obecné transkripční faktory
Izolátory chrání vzájemnou nezávislost sousedních domén,
nedochází k vzájemnému rušení (B).
CTCF
- CTCF interaguje s
kohesinem a podílí se
na utváření vyšších
chromatinových struktur
Hormon receptor family
Jaderné receptory – steroidní hormony, thyroidní hormony a
retinoidy – navázání ligandu stimuluje translokaci receptoru z
cytoplasmy do jádra a vazbu na HRE (hormon response
element - regulaci transkripce)
- α-šroubovice-smyčka(loop)-αšroubovice
(kolmé)
- 4 Cys koordinují Zn
- 1. helix ve velkém žlábku a
smyčka s druhým helixem
kontaktují cukr-fosfátovou
kostru
- doména dimerizuje (přes
smyčku)
třída I (homodimery, cytoplasma) a třída II (heterodimery,
jádro) – vazba ligandu moduluje nejdříve uvolnění faktoru a
poté vazbu ko-aktivátorů (dalších transkripčních faktorů nebo
chromatinových remodelátorů)
wikipedia
Loop-sheet-helix
- smyčky vycházející mimo
hlavní core doménu – vyčnívá
-list a α-šroubovice
- 3 Cys a 1His koordinují Zn
- helix ve velkém žlábku a
smyčka v malém žlábku
- Aktivace transkripce skrze
kyselou TA doménu
- core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý
pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené
DNA (nádorový supresor)
TFIID,TFIIH - transkripce
MDM2/MDM4 - ubi
Loop-sheet-helix
- Konsensus sekvence
PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy
(v promotorech p21, PUMA)
- 95% “nádorových” mutací je v
„core“ doméně (R273H)
- Regulace/aktivace modifkací
C-koncové domény
Protein se váže jako tetramer
(C-koncová doména)
- core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý
pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy a opravy poškozené
DNA (nádorový supresor)
p53 tetramer – DNA, PDB: 3KMD
Gal4
- 2 α-šroubovice
- 6 Cys koordinuje 2 Zn (2 Cys
sdílené 2 Zn)
- 1. šroubovice ve velkém
žlábku a smyčka k 2.
šroubovici kontaktuje cukrfosfátovou
kostrou
- Dimerizuje přes krátký CC
segment
Marmortstein et al.: Nature, 1992
- transkripční faktor reguluje v kvasinkách metabolismus
galaktosy (kvasinkový dvou-hybridní systém)
Gal4
PDB: 1D66
Motivy DNA vazebných domén
• Zipper typ
– Leucinový zip
– Helix-loop-helix
• Helix-otáčka-helix
– HTH
– Winged helix
– TALE
• Zinkový prst
–  zinc-finger
– Hormon-receptor
– Loop-sheet-helix
– Gal4
Kombinace motivů (šroubovice, Zn …)
… nejčastěji VŽ a šroubovice
Kombinace více proteinů …
IFN- enhanceosom
Efferl & Wagner, NRC, 2003
Wikipedie
IFN- enhanceosom
integrace různých signálů
IFN- enhanceosomAP-1 NF-B
Panne et al, Cell, 2008
Panne, CO in SB, 2008
- jeden z nejlépe popsaných enhancerů u vyšších eukaryot – induk. viry
- sekvence -102 až -47 básí upstream od počátku transkripce
- TF pokrývají 72% povrchu DNA (těsné sbalení DB-domén) – málo PPI
- nicméně vazba 8 proteinů je koordinovaná (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-kB)
transkripce
c-Jun
ATF-2
AP-1 Activator Protein = b-ZIP (basic leucine zipper)
IFN- enhanceosomAP-1 NF-B
Panne et al, Cell, 2008
Panne, CO in SB, 2008
- koordinovaná vazba 8 proteinů (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-B)
- AP-1 slabě interaguje s IRF proteinem, ale IRF proteiny mezi sebou
nemají žádný kontakt
- šroubovice IRF-3 ve VŽ ohýbá DNA, což stimuluje vazbu dalšího IRF
- ohyby se po ½ otočce kompenzují, takže DNA je v tomto úseku ROVNÁ
transkripce
IRF – interferon regulation factor = šroubovice ve velkém žlábku
a smyčka (His) kontaktuje base v malém žlábku (var WHD)
IFN- enhanceosomAP-1 NF-B
Panne et al, Cell, 2008
Panne, CO in SB, 2008
- koordinovaná vazba 8 proteinů (AP-1, IRF-3, IRF-7, NF-B)
- p50/REL-A dimerizují (-listy) - p50 slabě interaguje s IRF-7
- vazba do VŽ …
transkripce
NF-B
IFN- enhanceosom
http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=122
AP-1 leucin zipper, IRF – šroubovice a smyčka (směs), NFkB – komplexní motiv
červené tečky – molekuly vody
- TF pokrývají 72% povrchu DNA (těsné sbalení DB-domén)
IFN- enhanceosom
CBP/p300
- TF obsahují aktivační doménu – na AD
se važe mediator komplex –
integruje/propojí TF (phase separation –
ohniska) – zprostředkuje vazbu s RNA
polymerasou - iniciaci transkripce
- enhanceosom interaguje („přitáhne“)
koaktivátory (CBP/p300 histon acetylasa),
modifikuje chromatinovou strukturu …
příště
mediator
Schoborgetal,CMLS,2014
Souhrn:
- vazba většiny TF pomocí šroubovice ve
velkém žlábku (leucinový zip, HTH, zinkfinger
…)
- transkripční komplexy (enhanceosom ...)
Příště:
- Histon, HMG-box
- -sheet motivy
- enhanceosom ... a počátek transkripce