Komplexy spojené s transkripcí DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktoru Obecné TFII komplexy, histon ... a proces transkripce - velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované vazebné skupiny - nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) transcription factors of eukaryotic cells 3 This protein compte* makes it easier for RNA polymerase to attach to the promoter and start transcribing a gene. 5 Methylat»on,the addition of a methyl group to the C nucleotides, prevents CTCF from attaching to the insulator, CTCF ' turning it off, allowing the (CCCTGJanding factor) enhancers to bi nd to the promoter TBP Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované vazebné skupiny Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) Zipper typ - Jun-Fos Helix-turn-helix - H1, TALEN Zinkový prst - genome editing, GAL4 Histon, HMG-box p-barrel p-hairpin/ribbon Smíšené a/p Průběh transkripce -> enhanceosom -> skládání komplexu - histony vážou DNA sekvenčně nespecificky - histonové podjednotky (H2A, H2B, H3, H4) obsahují svazky 3-4 šroubovic skládaných proti sobě (histon fold) - DNA se obtáčí kolem válcovitého oktameru (2x4 histony) - šroubovice se vážou na cukrfosfátovou kostru DNA 3AFA Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer - H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer - vazba na DNA H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer dimery H2A-H2B (H2A-váže H3) H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer dimery H2A-H2B (H2A-váže H3) Ír1 H3 H4 m., H2A ■ H2B 180° DNA H2A/H2B dimer DNA H2A/H2B váže dvě vlákna H3/H4 váže jedno vlákno, ale silněji (více objímá - větší kontaktní povrch) H3, DNA McGinty a Tan, Chem Rev, 2015 H3 H4 H2A H2B DNA info o komplexech/PPI (vizuální, typy vazeb) (PDBsum - detailní info) (krystal lidského nukleosomu - 3AFA) Goto PDB code: 3afa go Top page £ Prótei! DNA/RNA Metals^^ftw^ro^l % Pores 0 Links f Interface statistics Protein-Protein interfaces for 3afa Interfaces summary for 3afa JH3 PDB id 3afa > No. of No. of No. of No. of No. of interface Interface salt disulphide hydrogen non-bonded Chains residues area (A2) bridges bonds bonds contacts 43 42 2417:2524 - 18 246 12 13 592:576 - 47 ©K© 11 13 710:671 - 6 52 @R© 9 9 496:453 - 73 0HL 8 7 450:452 - 4 34 ©H<* 4 4 257:238 - 40 ©H© 47 52 2522:2530 1 19 296 &L L 47 52 2431:2494 - 262 ©K© 13 12 672:708 - 6 48 C,H© 7 7 437:426 - 33 CHC 3 4 128:136 - 16 3 1 52:73 - 7 ©X© 4 3 216:247 - 2 25 ©K© 50 46 2525:2593 - 271 mm 9 9 490:458 - 72 ;j Postscript «eni'j'i Key: Salt bridges Disulphide bonds Hydrogen bonds Non-bonded contacts Konce histonů - N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu - modifikace (např. acetylace) mohou oslabit interakce s DNA a rozvolnit nukleosom - mohou vázat jiné proteiny (např. bromodoména) Konce histonů - N- a C-konce histonů vybíhají z jádra nukleosomu a ovlivňují jeho vazbu - modifikace (napr. acetylace,) mohou oslabit/posílit interakce s DNA nukleosom - značky pro vazbu proteinů Modifikace histonů - např. acetylace lysinu (změna náboje) oslabí interakci s DNA a rozvolní vazbu oktameru (zpřístupní DNA pro TBP) - následně se TFIID váže na Ac-H4 (K8, K16) prostřednictvím bromodomény TAF1 proteinu (reader/writer/eraser) p m y a a sgrgkqggkarakaktrss ra glqfpvgrv- a h2a 1 5 9 13 15 *\ 0 k 119 a a j a a j a PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRK-5 12 1415 20 2324 m m i, a h2b 120 A a Am m m J m m J P m m AÍTKQTARKŠTGGKApÍkQLATKAARKSAEATGGVK-k 2 4 910 14 1 718 23 262728 36 79 S G M G k G G k G L G K C i a m IGGAKRHRKVLRDNIQGIT- 1 3 5 8 12 16 20 79 J L J N-terminal tails globular domains m methylation p phosphorylation a acetylation u ubiquitylation i Molecular Bioloov of the Cell Í© Garland Science 2008) h3 h4 (B) bromodomain subunit of TFIID Tě-— histone H4I - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB pokrývá sekvenci -102 až -47 basí upstream od TSS = tj. mezi nukleosomy (nukleosom-free oblast) - nukleosom downstream zakrývá TATA-box - všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují s CBP/p300 acetylásou a mediatorem - acetylace nukleosomu vede k jeho remodelaci/přemístění a uvolnění TATA-boxu (W Accessible GR / sekvence DNA může být binding site , , . zcela zakryta nukleosomem nebo může být přístupná nebo může být v oblasti mezi nukleosomy Přednáška o chromatinu (a) Inaccessible GR binding site Histone-DNA contact sites 5 bp DNA insert CBP/p300 Pol II Holoenzyme Agalioto et al, Cell, 2000 Panne, CO in SB, 2008 IFN-(3 enharteebsom TFIID H28/H2A Nardini et al., Transkripční faktory NF-Y (podjednotky B a C ) obsahují histon-fold a vážou se sekvenčně nespecificky na cukrfosfátovou kostru jako histony - DNA se v důsledku vazby ohýbá podobně jako v nukleosomech - NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) NF-YB/NF-YC , 2013 A1A2-linker ŕ.. I^VOOV if NF-YB NF-YApodjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) j£ o IP "Ö d) a to >d> C >o c d) > J* d) u iff Ü d) a W d) c >d) c >o c d) > d) poši « L1 |VB( A2|VA> Al «-linker (0 o iff Ü d) a w o c >d> c >o c d) > d) to U I VC I "I Nardini etal., Cell, 2013 NUCPLOT 3X i \M71 ] ai (VB) ST' J HtTB i [ LI Ai ! H«;7I 1 A142-i|»k*f fYA) ■TLjwH j Lji'M 1 '.ľ ; T Ľ I CCAAT-box Promoter Inactive Por&od Active TS5 NF-t-Ut) NF-Y f DNA torttplüi - nevytváří oktamer, ale NF-YA/YB/YC trimer - NF-Y se váže přes histon-fold a nahrazuje nukleosom - podobně jako ubiquitince histonu (H2B) i ubiquitinace NF-YB aktivuje transkripci Transcription T T MtMiůUD Nardini etal., Cell, 2013 TBP-associated factors = TAF (podjednotky TFIID komplexu mají histon-fold (HF), ale nevytváří oktamery) Core: Histon-fold doména se neváže na DNA (podílí se C-konec) Shao et ai, mcb, 2005 - TAF4, 6, 9 a 12 obsahují histon-fold a jsou ve dvou kopiích (nikoli v dimerech) v „core" části TFIID komplexu - TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému Bieniossek et al., Nature, 2013 spekulativní (viz Louder et al, Nátuře, 2016) Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) Další vazebné motivy (p-listy, hydrofobní AMK, malý žlábek) Zipper typ Helix-turn-helix Zinkový prst Histon, HMG-box (3-barrel (3-hairpin/ribbon Smíšené a/p histon HMG - HMGB (HMG-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L -1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace aromatických AMK způsobuje ohnutí DNA H1-like AT-hook region HMGA HMGB + * + + HMG-box Ilel22 - ohyb a rozvolnění párování dsDNA může napomáhat procesům replikace, transkripce a re ko m b i n ace/o p ra vy poškozené DNA - ohyb napomáhá přiblížení vzdálených míst nebo zpřístupňuje DNA pro transkripční faktory Štros, B BA, 2010 HMG-D (1E7J) Aromatické aminokyseliny se interkalují do MŽ a vytváří kink -1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace Phe (aromatický kruh) způsobuje ohnutí DNA Current Opinion in Genetics & Development - ohyb napomáhá rozvolnění struktury chromatinu tj. moduluje pozici nukleosomů - ohyb může pomáhat TBP a iniciaci transkripce - pomáhá zpřístupnit DNA pro transkripční regulátory AP-1 NF-kB Mr-Jiip IRF-li IRF.7R IFSF.^n 2 ÁTF-2]c-JunjlRF-3 A IRF-7B IRF-3C IRF-7D pšO Fe ;.,A::;.v 2' TTflBff ■p-p-—Ti- 7 "-— TTir'" PEDIV IFN-p enhanceosom TCJíAAC:1'CŮÍAÍlAÍ A A PKJIIL ieei HMGA-1 transkripce - HMGAla se váže na 4 místa a (ohýbá DNA) napomáhá sestavení enhanceosomu - není ale součástí finálního komplexu - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB, který se váže na nukleosom-free oblast - všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují se SÁGA (obsahuje acetyltransferásu a TFIID - sestavení komplexu iniciace transkripce) a CBP/p300 acetyltransferásami, které acetylují sousední nukleosomy - jejich remodeling/přemístění uvolní TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polymerasy II a iniciuje transkripci viz dále iniciace transkripce Pol II Holoenzyme Pol LI Holoenzyme SWl/SNF Pol II Holoenzyme Agalioto et al, Cell, 2000 Panně, CO in SB, 2008 TFflD Motivy DNA vazebných domén Zipper typ - Leucinový zip - Helix-loop-helix Helix-otáčka-helix - Winged helix Zinkový prst - ppa zinc-finger - Hormon-receptor - Loop-sheet-helix - Gal4 Histon, HMG-box p-hairpin/ribbon p- barrel Enzymy a-šroubovice 33, Integration host factor Í1ihf) p-listy - Inzerce Pro mezi baze a ohyb 31. Met repressor (1cma) DNA Motivy DNA vazebných domén Zipper typ - Leucinový zip - Helix-loop-helix Helix-otáčka-helix - Winged helix Zinkový prst - ppa zinc-finger - Hormon-receptor - Loop-sheet-helix - Gal4 Histon, HMG-box p-hairpin/ribbon p- barrel a-šroubovice p-listy OB-fold (oligonucleotide/oligosacharide binding) - 4-5 anti-paralelních (3-listů (P-barel) zakončeno a-šroubovicí (kompaktní) - vytváří úzkou jamku pro jednořetězcovou ssDNA (RNA, oligosacharidy) - váže 2-5 nukleotidů (báze, cukry i fosfáty) - SSB/RP-A a TRF proteiny (replikace, HR, telomery ... Dr. Šebesta) Více OB - RPA70 (A+B) vytváří prodlouženou lineární kapsu RPA CST ATRIP, RAD9, MRE11, p53 - Oprava DNA N DBD-ADBD-B DBD-C I RPA70 nespecifická vazba DBD-D^ [m r POT1-TPP1 RPA32 RPA14 - protein-proteinové interakce (integrita komplexu + interakce s dalšími proteiny/komplexy) - Dr. Spirek ob1 ob2 ob3 CTC1 (cdd 3 v kvasinkách) M. TTAGGGTTAG-specifická obi ob2 vazba STN1 CST komplex (RPA-like) - regulace telomer TEN1 (obsahují ssDNA) ; ? : POT1 TPP1 Telomerase - část komplexu SHELTERIN - chrání telomery (aby nebyly považovány za DSB, reguluje přístup telomerásy) Flynn a Zou, CR in BMB, 2010 R ľ A 32 N RPA32 RPA70 v{pYM dbd-d KJrp rfa70n\/ übd-a v dbd-b ! 110 181 290 301 422 436 616 pai4 121 a32c 17o - protein-proteinové interakce (integrita komplexu) - celý komplex ~30nt Centrální část RPA komplexu (1L10) a model celého komplexu Bochkareva et al, EMBO J, 2002 Flynn a Zou, CR in BMB, 2010 TATA-box vážící protein (TBP) - klíčový pro sestavení prej^iciačního komplexu (PIC) start of transcription TATA box 10 anti-paralelních (3-listů pokrývá MŽ Interkalují se postranní řetězce Phe (hydrofobní v.) vytváří ohyb (kink) a rozplétá dsDNA Konsensní sekvence: TATA( A/T) A(A/T) (A/G) TBP a TFIIA (ß-barrel - neovlivní DNA strukturu) 1NH2 - TFIIA (2 podjednotky) komplex interaguje s TBP a DNA a zajišťuje jeho správnou pozici - brání represorům v inhibici vazby TBP na TATA-box (ko-aktivátor některých sekvenčně specifických trans, faktorů) - (3-barrel váže DNA (neovlivňuje strukturu) Liljas a - TFIID (1MDa, TAFs) komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému (nukleace PIC) Bieniosseketai, Nature, 2013 Preinitiation complex -jádro komplexu (symetrické) tvoří TAF4, 5, 6, 9 a 12 - po připojení všech TATAbox^LtoftranscriPtion podjednotek TFIID komplexu včetně TBP vzniká funkční (asymetrický) holokomplex (PIC) - footprint analýza ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box) - TFIID (SÁGA) komplex s TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému (nukleace PIC) TATA box f start of transcription Pol II Holoenzyme TBP TFIID TFIIB (B) TAF1 , v , ,. , , , -rr-iir^ bromodomain subunit of TFIID - po připojeni všech podjednotek TFIID \ / komplexu včetně TBP vzniká funkční holokomplex - TAFs vážou transkripční faktory, epigenetické značky ... např.tafi _ se váže na Ac-H4 8~ 16 historie H4ta pro další postup transkripce je klíčový TFIIB - propojuje TFIID-TFIIAs RNApol II 0 50 100 150 200 250 300 - TFIIB (C-konec = CTD1 a CTD2) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (blízko TATA boxu) - TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje TFIID-TFIIA-DNA komplex na pol II (do jeho aktivního centra/cleft) - Zn-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem TFIIB Zinc ribbon B finger Linker CTD 1 CTD2 Upstream TFIIB nwA Dock Downstream Wat! TATA box start of transcription TBP TFIID TFIIB Template DNA Nori-tempíate DNA - B-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem, B-core/CTD1 s wall, B-linker s CC clamp - umístění TFIIB determinuje pozici počátku transkripce - pozice B-reader (v RNA tunelu) limituje iniciační krok (12nt RNA) - po dosažení 12nt RNA dochází k disociaci TFIIB (elongace...) TBP TFIIB core TFIIB linker TFIIB ribbon TFIIB reader Video ukázka RNA polymerásy B-reader strand Template RNA TFIIB B finger Linker CT D 1 CTD D74 D75 * ^ Towards RNA exit tunnel Front view Plaschke et al, Nature, 2016 tbp(bezTFiiD) + tfma + tfiib + RNApol ii https://www.mpibpc.mpg.de/15370105/initiation.mp4 + jpiiF + ypiiE Začátek/iniciace transkripce -TFIID (nukleace komplexů^ Figure 6-16 Molecular Biology of the Cell o ** a ™ v> C <0 IL «i_ 1 r. li o z E h2 > Ol >0 U.JJ ho lli I —j Q — 111 5 j z Ul O E u Z < Table 6-3 The General Transcription Factors Needed for Transcription Initiation by Eucaryotic RNA Polymerase II TFIID TBP subunit TAF subunits TFIIB TFIIF TFIIE TFIIH NUMBER OF SUBUNITS 1 13 3 2 9 ROLES IN TRANSITION INITIATION recognizes TATA box recognizes other DNA sequences near the transcription start point; regulates DNA-binding by TBP recognizes BRE element in promoters; accurately positions RNA polymerase at the start site of transcription stabilizes RNA polymerase interaction with TBP and TFIIB; helps attract TFIIE and TFIIH attracts and regulates TFIIH unwinds DNA at the transcription start point, phosphorylates SerS of the RNA polymerase CTD; releases RNA polymerase from the promoter TFIID is composed of TBP and ~11 additional subunits called TAFs (TBP-associated factors); CTD, C-terminal domain. Plus TFIIA - viz nova data Rekonstrukce celého PIC - biotin-DNA navázána na streptavidinové kuličky - na DNA nachytány in vitro sestavené komplexy - odštěpeno Sa/l a cryoEM - postupně rekonstituován celý PIC a -41 +1 ů He etal, Nature, 2013 +59 -Biotin BREU TATA BREd >TFIID(TBP)- INR TFIIA —► TFIIB Sail Pol ll/TFIIF—> TFII TATA box start of transcription (A) TBP TFIID (B) TFIIB TFII F other factors RNA polymerase II »»» (D) RNA pol II TFIIF +1 -41 BREu TATA BREd TFIID(TBP) —> TFIIA INR -TFIIB d He etal, Náture, 2013 +59 ■Biotin Sali /TFIIF—► TFIIE—► - TFIIF (navázaný na pol II) stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WH D z RAP30 podjednotky váže přímo DNA: BREdownstream) - váže TFIIE a pomáhá tak stabilizaci komplexu 400 Dimerizace WHD Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 's TFIIE 120 +1 -41 INR BREu TATA BREd + TFIID(TBP) —» TFIIA —* TFIIB Sail /TFIIF—► TFIIE-» He etal, Nature, 2013 -Biotin -TFIIF váže TFMEa pomáhá tak stabilizaci komplexu -tandem 4x WHD uzamyká DNA v RNApol II prohlubni Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 lešení/scaffold --XPD -B o:in XPB helikása - XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER) lidský PIC komplex He et al, Nature, 2013 - TFIIH (10podjednotek, 450KDa), podkomplex CDK7-cyclin H-MAT1 fosforyluje pol II (Rpb1) - XPB v kontaktu s DNA rozvíjí dvoušroubovici BREu TATA BREd -* TFIID(TBP) Kompletní PIC Í S TFIID komplexem Louderetal, Nátuře, 2016 začátek transkripce - faktory TABLE 1 Components of the human general transcription machinery Factor Protein composition Function TFIIA TFIIB T F11F TFIIH p35(«), p19(/3),andp12(7) J3M_ TFIID TBP + TAFs (TAF1-TAF14) TFIIE p56 («) and p34 (ß) RAP30 and RAP74 Dr. Šebesta P89/XPB, p80/XPD, p62, p52, p44, p40/CDK7, p38/Cyclin H, p34, p32/MAT1, and p8/TFB5 Dr. Blažek polil RPB1-RPB12 (A) (B) Antirepressor; stabilizes TBP-TATA complex; coactivator Start site selection; stabilize TBP-TATA complex; pol ll/TFIIF recruitment Core promoter-binding factor Coactivator Protein kinase Ubiquitin-activating/conjugating activity Histone acetyltransferase Recruits TFIIH Facilitates formation of an initiation-compentent pol ii Involved in promoter clearance Binds pol II and facilitates pol II recruitment to the promoter Recruits TFIIE and TFIIH Functions with TFIIB and pol II in start site selection Facilitates pol II promoter escape Enhances the efficiency of pol II elongation ATPase activity for transcription initiation and promoter clearance Helicase activity for promoter opening Transcription-coupled nucleotide excision repair (™ Kinase activity for phosphorylating pol ii CTD E3 ubiquitin ligase activity Transcription initiation, elongation, termination Recruitment of mRNA capping enzymes TATA box [ start of transcription TBP TFIID TFIIB (C) TFIIH C\D TFIIF other factors RNA polymerase II (D) UTP.ATP I HELICASE ACTIVITY CTP, GTP AND CTD PHOSPHORYLATION DISASSEMBLY OF MOST GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS RNA TRANSCRIPTION Transcription-coupled recruitment of splicing and 3' end processing factors CTD phosphorylation, glycosylation, and ubiquitination RPB1 CTD (heptapeptide YSPTSPS repeat) fosforylace Thomas et ai., cribmb, 2006 - mechanismus aktivace transkripce zahrnuje vazbu transkripčních aktivátorů, mediátoru (vytvoření transkripční smyčky) ... uvolnění chromatinové struktury ... JRpb4/7 activator protein enhancer (binding site for activator protein) mediator RNA pol II TFIIH Gibbons etal, PNAS, 2012 TATA box l start of BINDING OF transcription GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS, RNA POLYMERASE, MEDIATOR,CHROMATIN REMODELING COMPLEXES, AND HISTONE ACETYLASES chromatin remodeling complex histone-modifying enzyme TRANSCRIPTION BEGINS capping factors RNA polymerase Příště Dr. Blažek: Úloha Cdk kinás v regulaci transkripce a buněčného cyklu 5' end ofmRNA RNA splicing proteins 3' end processing proteins