Metody používané k detekci polymorfismů Rozdělení polymorfismů Bodové Inzerčně-deleční ATGCGGTAACGTAGGCTTCAGG ATGCGGTAACATAGGCTTCAGG ATGCGGTAACGTAGGCTTCAGG ATGCGGTAAC-TAGGCTTCAGG ATGCGGTAACG-TAGGCTTCAGG ATGCGGTAACGGTAGGCTTCAGG Možno využít DNA čipy Není možné využít DNA čipy Detekce polymorfismů pomocí PCR A G T T Detekce bodových SNP pomocí mis-match primeru na 3´konci DNA polymerasa má často 3´ 5´ exonukleasovou aktivitu, která neumožňuje použití této metody, dostáváme nejednoznačné výsledky. Využití v HLA typizaci pomocí SSP-PCR AATGC A Detekce inzerčně/delečních polymorfismů (inzerce/delece větší než 2 báze) Analýza PCR produktů se provádí na agarosovém (> 5-10bp) nebo polyakrylamidovém gelu – možnost automatizace analýzy na Genetickém analyzátoru Detekce pomocí proužků (Strip assay) DNA izolace Amplifikace DenaturaceDNA Hybridizace Vazba konjugátu VyhodnoceníZbarvení Detekce pomocí lateral flow assay (LFA) 1. Izolace DNA 2. Amplifikace 3. Hybridizace se značenou sondou 4. Detekce pomocí LFA Detekce polymorfismů restrikční analýzou A G G A PCR RA Velmi často se snažíme používat co nejlevnější restrikční endonukleasu, např. Taq1 (5'-T^C G A-3'). Pokud sekvence v oblasti SNP nesouhlasí s danou restriktasou, je možno použít primer, který nám požadovanou sekvenci pro restrikci vytvoří. GGAAACGAGTTA GGAAACGTGTTA Taq1 - TCGA GGAATCG GGAATCG Taq1 Detekce polymorfismů pomocí Real-Time PCR Použití specifických fluorescenčních sond Hydrolizační sondy TaqMan Hybridizační sondy Molecular beacon, FRET Detekce polymorfismů pomocí Real-Time PCR Pravidla pro návrh sond: • polymorfismus by měl být umístěn přibližně uprostřed sondy • Tm sondy by měla být o deset stupňů vyšší, než Tm primerů • sonda by neměla vytvářet žádné stabilní struktury v rámci sebe • pro zvýšení stability duplexu sonda-DNA je možné použít modifikace bazí • MGB sondy • LNA sondy Detekce polymorfismů pomocí Real-Time PCR Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody SNaPshot Příprava templátu Amplifikace gDNA Odstranění dNTPs a primerů Purifikovaný templát Analyzovaný polymorfismus • možno detekovat až 12 SNPs najednou • metoda trvá 1 den Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody SNaPshot Příprava reakce: • templát • Primer • SNaPshot Multiplex • Reakční směs Provedení teplotních cyklů Odstranění volných ddNTP Denaturace templátu Nasednutí primeru Extenze primerů pomocí ddNTP Odstranění volných ddNTP a denaturace Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody SNaPshot Elektroforéza vzorků na kapilárovém sekvenátoru Analýza dat Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody GoldenGate • Genotypizace vybraných SNPs • Průměrná call rate > 99% • 96-1536 SNPs/vzorek • 16 nebo 96 vzorků najednou • Formát matrice nebo čipu Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody GoldenGate Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody Infinium • Celogenomové typizace SNPs • Možnost provádění CNV analýz (copy number variation) • Průměrná call rate > 99% • 1 072 820 SNPs/vzorek • 4 až 48 vzorků najednou Infinium HD BeadChips Samples per BeadChip Markers per Sample HumanOmni1-Quad 4 > 1 million* Human1M-Duo 2 > 1 million HumanOmniExpress 12 > 700,000 Human660W-Quad 4 > 658,000 HumanCytoSNP-12 12 ~ 300,000 Semi-Custom Human1M-Duo+, and HumanHap550-Quad+ 2 / 4 standard content and up to 60,800 customized SNPs per sample CNV analýza • Na čipu jsou naneseny SNPs v pravidelných rozestupech (např. co 3000 bp) • genom – 3 miliardy bp/ 3000 = 1mil. SNPs pokryje genom • Vypočítává se logR poměr = Rvzorek/Rreference • Za normálních okolností je R = 1 Detekce jednobodových polymorfismů pomocí metody Infinium Detekce jednobodových polymorfismů pomocí čipů Affymetrix Schéma syntézy čipu Detekce jednobodových polymorfismů pomocí čipů Affymetrix Schéma detekce