Sekvenace DNA Vývoj sekvenačních technik za posledních 40 let Maxam-Gilbertova sekvenační metoda (1977) Princip metody - specifická chemická degradace purinových a pyrimidinových bazí • puriny jsou modifikovány pomocí dimethylsulfátu • pyrimidiny pomocí hydrazinu • následně je pomocí 1M piperidinu při 90oC štěpena cukr-fosfátová kostra v místě příslušné modifikované báze Místo štěpení piperidinem Atak hydrazinem Atak dimethylsulfátem Modifikova ná báze Specifická modifikace G Methylace guaninu pomocí dimethylsulfátu při pH 8.0 - guanin se stává náchylný k odstranění při alkalickém pH. A + G Přidání piperidinu v kyselině mravenčí při pH 2.0 vede k odtranění purinových bazí C + T Přidání hydrazinu vede k otevření pyrimidinového kruhu a jeho odtranění z DNA C Při vysoké iontové síle (1.5 M NaCl) reaguje s hydrazinem jenom cytosin Maxam-Gilbertova sekvenační metoda Maxam-Gilbertova sekvenační metoda Schéma sekvenace: DNA Označení konců pomocí radioaktivní značky Alkalická fosfatasa/polynukletid kinasa Terminální transferasa Štěpení restrikčním enzymem Denaturace (detekovatelný je pouze značený fragment) Odstranění Rozdělení vzorků do čtyř chemických reakcí, které vedou ke specifickému štěpení Maxam-Gilbertova sekvenační metoda • Fragmenty jsou separovány na přibližně 6% polyakrylamidovém gelu G A C C + + G T • Touto metodou jsme schopni sekvenonat přibližně 250-300 bp dlouhé fragmenty • Musíme pracovat s velkým množstvím DNA • Velká pracnost metody (několik purifikačních kroků), nemožnost plné automatizace, práce s mutagenními chemikáliemi • Používá se stále pro “footprinting“ Sekvenační metoda dle Sangera (1980) • Syntéza DNA in-vitro za použití “terminátorů“ – dideoxynukleotidů zabraňujících po svém začlenění do DNA její další elongaci. Deoxyribosa Dideoxyribosa • Vyžaduje použití iniciálního primeru, DNA polymerasy a směs dNTPs se značenými ddNTPs • Nasyntetizované řetězce jsou poté separovány pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy • Možnost plně automatizované seprace za použití fluorescenčně značených ddNTPs Sekvenační metoda dle Sangera (1980) Automatická analýza a vyhodnocení • kapilární elektroforéza spojená s fluorescenční detekcí produktů (BigDye barevný set) • Genetic analyzer 3000 series (ABI) • Megabase (GE Healthcare) Ruční sekvenace Automatická sekvenace Throughput/Performance by Run Module XLRseq: 768 samples per day (690 Kbases) LongSeq: 1152 samples/day (980 Kbases) StdSeq: 2304 samples/day (1550 Kbases) FastSeq: 2304 samples/day (1600 Kbases) RapidSeq: 3840 samples per day (2100 Kbases) Sekvenační metoda dle Sangera Human Genome Project (HGP) - započat v roce 1990 za účasti DOE and NIH - sekvenace prováděna pomocí BACs - prvotní plán počítal s dobou trvání 15 let - nakonec sekvenace téměř dokončena již v roce 2000 - výsledná sekvenční mapa publikována 14. dubna 2003, 99.99% přesnost (National Human Genome Research Institute) - celkové náklady projektu 3 miliardy dolarů - v roce 2000 prezident Bill Clinton ujistil o nepatentovatelnosti lidské DNA https://https://www.genome.gov/25019885/online-education-kit-how-to-sequence-a-human-genome// Celera Genomics Project - založena vědcem Craig Venterem a v roce 1998 započala sekvenační projekt - celkové náklady 300 mil. dolarů byly hrazeny plně s privátních zdrojů - poprvé použita metoda „whole genome shotgun sequencing“ - k analýze sekvenačních dat použit přístup vyvinutý Gene Myersem - tento přístup však vyžadoval extrémní výpočtové požadavky - finální výpočet prováděn na 7000 procesorech k získání 1000 násobné rychlosti oproti Pentium počítačům - tento inovativní přístup dovolil dokončit sekvenaci již za 9 měsíců Pyrosekvenování (1990) • umožňuje rychlou sekvenaci krátkých úseků DNA - sekvenace 30 až 50 bazí trvá přibližně 30 až 45 minut. • Jedná se o bio-luminometrické sekvenování DNA založené na detekci anorganického pyrofosfátu (PPi) uvolněného během inkorporace nukleotidů. Pyrosekvenování Metoda pyrosekvenování je použitá v některých sekvenátorech “druhé generace“ (Roche) Průchodnost 1 miliarda bazí za den Doba analýza 10.0 hodin Délka čtení 400 Počet čtení/analýzu 1 000.000 Správnost >99.0% správnost jednoho čtení na 400 bazích Potřebné množství DNA Méně než 100 ng DNA Multiplexování Až 192 vzorků/běh http://454.com/products-solutions/multimedia-presentations.asp Pyrosekvenování Průchodnost 35 bazí/běh Doba analýza 10 hodin sekvenování 2 hodiny zpracování dat Délka čtení 400 bazí Přesnost 99% přesnost při 400 bazí Počet čtená/běh 100,000 shotgun, 70,000 amplikon Vzorky gDNA, amplikony, cDNA GS Junior System Sekvenátor II generace – Solexa Tvorba klastrů Sekvenace Párování Analýza dat Sekvenátor II generace –MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, NovaSeq Sekvenátor II generace Příprava DNA knihovny Vzorek DNA – fragmentace (Covaris, fragmentáza) Začištění konců (DNA polymeráza) Ligace adapterů (ligáza) Výběr fragmentů dle velkosti (SPRI) Amplifikace fragmentů Sekvenace (Illumina, IonTorrent) Sekvenátor II generace Sekvenátor II generace Sekvenace amplikonů Sekvenátor II generace Sekvenace probíhá v klastrech Sekvenátor II generace 1. Krok – hybridizace templátu na průtočnou celu 2. Krok – Můstková PCR Sekvenátor II generace 2. Krok – Můstková PCR Sekvenátor II generace 2. Krok – Můstková PCR Sekvenátor II generace Sekvenátor II generace 2. Krok – Můstková PCR 2. Krok – Můstková PCR Sekvenátor II generace 3. Krok – Linearizace Sekvenátor II generace 4. Krok – Odštěpení reverzního vlákna Sekvenátor II generace 5. Krok – Blokace volného 5‘ konce Sekvenátor II generace 6. Krok: Čtení – hybridizace sek. primeru Sekvenátor II generace Chemie reverzibilních terminátorů Sekvenátor II generace Sekvenace pomocí syntézy (SBS) Sekvenátor II generace Sekvenátor II generace Sekvenátor II generace 7. Krok – Pair-End sekvenace Sekvenátor II generace 7. Krok – Pair-End sekvenace Sekvenátor II generace 7. Krok – Pair-End sekvenace Sekvenátor II generace 7. Krok – Pair-End sekvenace Sekvenátor II generace Čtení indexů Sekvenátor II generace Single index čtení Sekvenátor II generace Dual index čtení (iSeq, MiniSeq, NextSeq,HiSeq) Sekvenátor II generace Sekvenátor II generace – SOLiD Sekvenátor II generace – SOLiD SOLiD – základní parametry čtení • Pro detekci polymorfismů nutno opakovat minimálně 20x • Pro detekci somatických mutací 30x Kvalita Přesnost Robustnost Sekvenátor II generace – SOLiD Vytvoření tzv. Sekvenační knihovny Sekvenátor II generace – SOLiD Namnožení Sekvenační knihovny (em-PCR) Sekvenátor II generace – SOLiD Sekvenace pomocí ligační reakce Sekvenátor II generace – Ion Torrent Ion 314™ Chip v2: 30–100 Mb sekvenčních dat s dobou čtení 2–4 hodiny Ion 316™ Chip v2: 300 Mb–1.0 Gb sekvenčních dat s dobou čtení 3–5 hodin Ion 318™ Chip v2: 600 Mb–2.0 Gb sekvenčních dat s dobou čtení 4–7 hodin Sekvenátor II generace – Ion Torrent Postup práce Aplikace (Sekvenace) Cílená Exomu Transkriptomu Genomu Kvantifikace NGS knihovny Elektroforetické metody • Fragment Analyzer (Adv. Anal.) • TapeStation (Agilent) • BioAnalyzer (Agilent) Fluorimetrické metody • Qubit (Thermo Scientific) Real-Time PCR • KapaBiosystem • NEB Sequel System PacBio RS II Sekvenátor III generace – PacBio Sekvenátor III generace – PacBio • Sekvenace založena na Single Molecule, Real-Time (SMRT®) technologii • Vyžívá tzv. Zero-Mode Waveguides (ZMWs) umožňujcící osvícení pouze spodní části jamky, ve které je dole imobilizována DNA polymeráza • Hlavní výhoda je možnost dlouhého čtění (až 20 kb) • Další výhoda je možnost přímé detekce methylovaných bazí (epigenom) Sekvenátor III generace – PacBio Příprava knihovny https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI Sekvenátor III generace Oxford Nanopores • Základem technologie jsou nanopóry (nanodíry) • Na začátku sekvenace je NK navázána na nanopór tvořený proteinem • Poté je rozpletena a prochází přes nanopór, což generuje změnu proudu • Na základě pozorovanéí zmšny jsou odečítání v reálním čase jednotlivé báze • Umožňuje sekvenaci velmi dlouhých úšeku (desítky až stovky kilobází) • Nevýhodou je vyšší chybovost, správnost >90%