Bakteriální transpozony Transpozon = sekvence DNA schopná transpozice, tj. přemístění z jednoho místa v genomu do jiného místa Transpozice = proces přemístění transpozonu Transponáza (transpozáza) = enzym zprostředkující transpozici IS = inzercní sekvence (IS-elementy) Tn = transpozony Poprvé byly IS popsány v r. 1967 u E. coli analýzou mutant s těmito vlastnostmi: 1. Mutace byly vysoce polární - každá se mapovala v prvním genu operonu, ale nebyly syntetizovány proteiny genů po směru transkripce. Polarita byla důsledkem přítomnosti transkripčně-terminační sekvence inzerčního elementu. 2. Tyto mutace nebylo možné revertovat analogy bází nebo frame-shift mutageny, takže podstatou mutací nemohly být substituce ani adice nebo delece bází. 3. Jestliže byly do kmenů s mutacemi přeneseny plazmidy, podobné polární mutace (i když v jiných genech) se na nich občas objevovaly. Např. Flac+ se stal lac-. 4. Fyzikální studium plazmidů ukázalo, že plazmid s mutací je delší díky inzerci elementu. Specifické rysy transpozice: • cílová místa nejsou homologická s místy donorovými • obvykle dochází k duplikaci přenášené sekvence, tj. transpozon zůstává i v původním donorovém místě • v místě inzerce se zdvojují ve stejném směru sekvence DNA - transpozon je na obou koncích ohraničen přímými repeticemi, což je důsledek mechanismu transpozice • po inzerci transpozonu do cílového místa dochází k inaktivaci genů, po excizi transpozonu se funkce obnovuje. Důkaz přítomnosti IS-sekvencí u E. coli (a) X prophage ■ ->■ Mr H------h H------r- Ex c i si on site gal operon IS! Excision site Vznik specificky transdukujících fágů (b) <-----^-----> <-----g«Í-----> +-------------------1-----1------HH------ + rsi X gal ---------------------------1------1--------^_-------- H------h H------(- gal IST Vznik heteroduplexů (c) gal H---------H I gal IS1 gal ISx ISx' Mapování neznámých IS v gal operonu heteroduplexní analýzou Znázornění přítomnosti transpozonů v EM - heteroduplexní analýza #S53f* Plasmid Tn5 Struktura IS sekvencí Transposase (402 amino acids) _____________________a____________________ 17bp 22^bp ¥M' -■■■ —WM IR IR 5/ Bacterial ~T~ ,. , chromosome IS10 BLacterial 1329 bp chromosome FIGURE 10-1 Structure of IS 10, a simple bacterial insertion sequence. IS 10 is a 1329-bp transposable element found in E. coli. The element consists of a gene that encodes a 402 amino acid protein, thought to be the transposase enzyme required for IS movement, flanked by short inverted repeats (IR). The IRs are blocks of similar (but not identical) sequence in opposite orientation to one another. The IRs are recognized by the transposase enzyme in the first steps of transposition and therefore define the ends of the sequence to be transposed. složených transpozonů Transposase not functional Functional IS10 transposase IS 10 left 1ST 0 right v TnlO 9300 bp FIGURE 10-2 Complex transposons are genes flanked by two IS elements. TnlO is a 9300-bp-long movable element that encodes genes for resistance to the antibiotic tetracycline (TetR). Each end contains an IS 10 insertion element (oriented in opposite directions). The right IS encodes a functional transposase that is required for movement of the transposon. The left IS 10 element has accumulated mutations so that it no longer encodes an active transposase protein. Between the IS elements are genes required for tetracycline resistance. The IS elements can transpose individually or in tandem; in the latter case they carry the intervening DNA with them. Struktura transpozonu Tn3 ■ Inverted repeat \ • - -■ Repressor and resolution protein ^ •"% mvei it? Transposase (TnpA) \ ff-Lactamase repeal Inverted W-r%%i Internal resolution region res / ■ ,i.- -.. 3 8 bp obrácená opakování Čtyři hlavní třídy transpozonu u G- bakterií . A Class I - B Class n C Class in D Class IV Structure of a representative example Tn5 Km Bl Sm b Tn3 • Phage Mu Tn7 mRNAs ■ a tnpA4 tnpR bla —» A B TpSmSp . ----------- DNA IRIC ■ <' —■> IS50 L IQR 4--------» IS50 R IR . -H------WW----------- res IR -t—► S-------„—§ SE Phage functions £*------ IR -------------K Tn7-R - Size of Tn 5.7kbp ■ 5kbp 39kbp 14kbp Size of target duplication 9bp 5bp None 5bp Markers0 Km, Sm, Bl Ap Phage functions Tp, Sm, Sp Transposition functions ISR: a = active transposase; b = transposase inhibitor ISL: inactive tnpA transposase trtpR resolvase Two proteins: A and B Five proteins necessary Comments Composite Tn, with two distal, nearly identical, ISs, of which the left one is inactive 1 IR39bp 1 Largest known transposon IR28bp Other well-studied elements Tn9 (Kl) Cm TnlO (IS10) Tc .■ -t Tnl Ap Tn501Hg . Tn21 Hg, Sm, Ap, Su TnlOOO (ys) IS101 (209 bp) Phage D108 . '■ IR, IC, inverted repeats; res, site of co-integrate resolution; SE, c, striped ends, a, See Table 3.5 (p. 76) for explanation of the symbols. IS u gramnegativních bakterií Designation Host DNA and copy number Size (in bp) Inverted repeat3 (inbp) Target duplication (in bp) Open reading frame (no.) 8 Special properties BI Enterobacterial chromosomes, phages and plasmids {5-8 copies per strain) 768 20/23 9 (8-11) Several Class I transposons are formed by inverted or direct repeats of 1S1 (Tn9, Tn2350, Tnl681) 1S2 E. coli chromosomes, plasmids (F) . 1327 32/41 5 2 Inverted repeats of Tn951 IS3 E. coli chromosomes {4-5 copies) Plasmid F (2 copies) 1258 39/39 3 3 Behaves as a mobile promoter IS4 Chromosomes of E. coli K12 (1 copy at a single location) 1426 16/18 11, 12 or 14 2 1 specific insertion site ■ IS5 E. coli Shigella Phages X, Mu 1195 15/16 4 3 The most abundant IS in E. coli; has a promoter activity by creation of a promoter ISIO TnlO 1329 17/22 9 1 TnlO inverted repeats IS15 E. colt Salmonella Several plasmids ■ Tnl525 direct repeats pokračovaní K21 lne PI plasmids 2100 Mobile promoter active only when in tandem • repeats IS26 Tn2680 820 14/24 8 2 Tn2680 direct repeats IS30 Phage PI E. coli 1221 23/26 2 3 Insertion site quite specific IS46 IncN plasmids 810 Mainly forms cointegrates IS50R Tn5 1534 8/9 9 2 Tn5 inverted repeats; only IS50R is active IS52 Pseudomonas savastanoi 1209 9/10 4 IS66 Agrobacterium plasmid pTiA66 2548 ■ IS102 Plasmid pSC102 1057 18 9 3 IS136 (IS426) Agrobacterium tumefaciens (pTC137) 1313 32/30 9 3 E200 Salmonella typhimurium (6-10 copies) Only found in Salmonella species IS222 - Pseudomonas aeruginosa chromosome and phage D3 1350 40 • [S476 Xantkomonas campe$tri$ 1225 13 4 IS4400 Bacteroiäes fragilis 1150 .. . - ,. ISRm2 Rhizobium meliloti 2700 24/25 8 a, The two figures refer to the sizes of the two inverted repeats, when these are not identical. IS a transpozony u G+ bakterií Size Terminal Target Element Hosts Phenotypea (kbp) repeats duplication Classb IS231 Bacillus tkuringiensis None 1.65 20 11 ISS1 Streptococcus lactis None 0.82 18 8 I (IS15) IS110 Streptomyces coelicolor None 1,55 10/15 ND IS257 Streptococcus lactis None I (IS15) IS861 Streptococcus I (IS50, IS3) Tn4001 Staphylococcus aureus Gm, Tm, Km 4.7 IS256 ND I Tn551 Staphylococcus aureus Em 5.3 40 5 II Tn917 Streptococcus faecalis Em 5.27 38 5 II Tn4430 Bacillus thuringiensis None 4.194 38 5 n Tn4451 Clostridium perfringens Cm 6.2 12 ND n Tn4556 S treptomyces fradiae Streptococcus faecalis Tc conjugative 6.62 16.4 Imperfect 0 u Tn916 v Nová třída V Tn918 Streptococcus faecalis conjugative 16 ND ND v • y ■ ■ ^ Tn919 \ Streptococcus sanguis conjugative 16 ND ND v - nemaj i IR Tnl545 \ Streptococcus pneumoniae Tc, Em, Km 25.3 Imperfect 0 v conjugative - netvoří TD Minicircl e \ Streptomyces coelicolor None 2.6 Imperfect 0 v Tn554 \ Staphylococcus aureus Em, Sp 6.69 0 0 v a, See Table 3.», p. 76 for explanation of symbols; Gm, gentamycin; ND, not determined; Tm, tobramycin. b, The IS in brackets indicates Gram-negative elements having homologies with those described. Konjugativni transpozony Element Hosts Size bp ISH1 ISH2 ISH25 ISH50 ISHS1 ISH51 Halobacterium halobium 1118 Halobactermm halobium 520 Halobacterium halobium 588 Halobacterium halobium 996 Halobacterium halobium 1700 Haloferax volcanii 1371 Inverted repeats Target duplication (bp) ORFs 8/9 19 8 10,11 or 20 1 3 none 23/29 26/27 15/16 none none 8 3 2 Table 12-1 elements Properties of some E. coli insertion Element Number of copies Number of and location* base pairs IS 1 5-8 in chromosome 768 \$2 5 in chromosome; 1 in F 1327 IS3 5 in chromosome, 2 in F 1258 IS4 1 or 2 in chromosome 1426 IS5 ■ ■ ■ Unknown 1195 Tn 1000 (yS) 1 or more in chromosome; 5980 1 in F Struktura složených transpozonů Inverted repeat ISL IRi ISR IRo v_ IS1 -J Antibiotic resistance segment --*« "Y" IS1 J Direct repeat IS1 • ^-^ fS1 Table 12-2 Properties of selected composite type I transposons of £ colt _> Terminal Relative 1 . IS element directions Size in and size in of terminal Element Genes carried* base pairs base pairs IS Elements Tn5 kan 5818 IS50(1533) Inverted Tn9 cam 2638 IS 1 (768) Direct Tn70 tet 9300 IS 10 (1329) Inverted Tn204 cam, fus 2457 IS 1 (768) Direct Tr\903 kan 3094 IS903(1057) Inverted Jn1681 ent 2088 IS 1 (768) Inverted 'cam, chioramphenicol; ent, enterotoxin; fus, fusidic acid; kan, kanamycin; tet, tetracycline. Vznik přímých repetic v cílovém místě po začlenění transpozonu É-K'i'vSŕíyť' Host DNA Transpozon obsahující IR na koncích pH 23456789 L 123456789 1 ATGCA TACGT Target site >V^^ÍWM*iŕili-*fi^^-]^liťŕt.f3H,.lv-,.Hl n ■ wx^*+*ft/ur,vin km HWrt,--+,-[y: *i 987654321 987654321 K«"*? Host DNA ATGCA123456789 TACGT 123456789 Target Inverted repeat repeat Transposort 987654321 ATGCA 987654321 TACGT Inverted Target repeat repeat Region ot f insertion "^ Figure 21 -22 Duplication of a short sequence of nucleotides in the recipient DNA is associated with the insertion of a transposable element; the two copies bracket the inserted element. Here the duplication that attends the insertion of ISl is illustrated in a way that indicates how the duplication may come about. ISl insertion causes a nine-nucleotide duplication. If the two strands of the recipient DNA are cleaved (arrow) at staggered sites that are nine nucleotides apart, as shown in (a), followed by insertion of ISl between the resulting single-stranded ends, then the subsequent filling in of single strands on each side of the newly inserted element, indicated by red letters in (b), with the right complementary nucleotides could account for the duplicated sequences (boxes). (From S. N. Cohen and J. A. Shapiro, "Transposable Genetic Elements." Copyright © 1980 by Scientific American, Inc. All rights reserved.) Model nereplikativni (konzervativní) transpozice (A) Donor \ * I i Působení transponázy Recipient (B) Donor i Recipient ,o, o™ ///////// ///////// Recipient DR T Důkaz konzervativní transpozice TnlO TnlO-LacZ+ Heteroduplex Z+ Denature Reanneal and Different base pairs TnlO-LacZ- Homoduplex Z+ Vytváření směsi heteroduplexů a homoduplexů z transpozonů TnlO, které nesou alely genu lacZ lišící se toliko 3 bázemi. TnlO je přítomen v transdukujících fágách lambda. z~ Konzervativní transpozice Individual cell Replikativní transpozice (a) First division First division First division (b) Figure 21-20 Consequences of conservative and replicative transposition, (a) The heteroduplex of homoduplex nature of DNA (see Figure 21-19) is transposed into a target gene. If the starting DNA is heteroduplex, then the resulting DNA will still be heteroduplex only in a conservative, or non-replicative, pathway, (b) Because the heteroduplex results in a transposed cell that maintains the heteroduplex nature of the DNA during conservative transposition, colonies will arise that are part Z* and part 2~. However, in a replicative pathway, transposition results in individual cells that are either all Z+ or all Z ~, and all the colonies will either be Z+ or Z~. Model transpozice prostřednictvím tvorby kointegrátu ■f Cointegrate I TnpR or other protein Model replikativní transpozice / --" , Donor plasmid Ä containing -/ transposon ^N Recipient plasmid ~N containing target * / sequence (solid orange bar) 1. Vytvoření zlomů na DNA transponázou, replikace transpozonu a vznik kointegrátu Growing fork 111 Growing fork -cm IV ""*- Donor plasmid restored ■ Recipient plasmid •1 containing transposon / and duplicated target sequence 2. Rozklad kointegrátu: a) homologní rekombinací v recA+ b) místně specifickou rekombinací působením resolvázy Mechanismus replikativní transpozice Bacterial / L chromosome Rozklad kointegrátu zprostředkovaný místně-specifickým enzymem kódovaným transpozonem (resolváza u Tn3) nebo rekombinačním aparátem hostitelské buňky (RecA) Plasmid B Figuro 21-1 Transposition of the transposon Tn3, which carries a gene conferring resistance to the antibiotic ampicillin (AmpT<). It is shown as originally being part of plasmid A, which also includes a gene for resistance to kanamycin (Kanp"). A plasmid B, which confers resistance to tetracycline (TetR), acquires a copy of the transposon. The new plasmid B confers resistance to ampicillin and tetracycline. (From S. N. Cohen and J. A. Shapiro, "Transposable Genetic Elements." Copyright © 1980 by Scientific American, Inc. All rights reserved.) Delece pozorované v místě začlenění IS1 v lokusu gal E. coli Deletions Direction of replication A —t- B -+- C A —f— B —4- c —I— (b) Fig. 5.5 Excision of a transposable element during replication of host DNA. Excision takes place by formation of a stem-and-loop structure, during the transient single-strand form of the DNA at the replication fork. Excision is shown in one strand only (although it may occur in both strands), involving the whole element (precise excision, a) or part of it (imperfect excision, b). Vznik delecí a inverzí po transpozici Transposon Replication origin Resolution Resolution Inversion c Nonfunctional, owing to lack of replication Functional deletion Figure 12-17. Model for production of genetic deletions and inversions. The transposon DNA is inserted into the target sequence in orientation, lor II. The circle could be a Plasmid or the chromosome. Resolution by a site-specific strand exchange at sites indicated by double-headed arrows or by exchange in homologous sequences yields a deletion from I and an inversion from II. Key: □, A Target sites Fig. 5.7 DNA rearrangements involving transposon replication in the same replicon. (a) Rearrangements may result from a rec-dependent recombination between the two copies of the same transposon in the same replicon. This may happen whatever the process which brought the two transposon copies into the replicon. (b) Rearrangments may result from the formation of an intra-replicon co-integrate. Inverzní transpozice ■— j*--. \N s i \ L |B _____^ / "^ / __ ^_, __ __ _, Spacing = 17bp Vznik kompletního promotoru kombinací promotorových sekvencí -35 a-10 IS21-R ACGT -10 IS21-L ---------->■ -<--------------------------------------->■ -35 ACGT -10 -35 ACGT JA -10 aph A rz TGCA <---------->- Spacing = 18bp TGCA -<------------->- Spacing = 17bp Fig. 5.4 Role of insertion sequences as mobile promoters, (a) IS3 as a mobile promoter for argE in £. coli (i). IS3 can insert upstream oiargE. A deletion, as indicated, removes the -35 part of the argE promoter (ii). Transcription of argE is still performed, but starts from a promoter site inside IS3. (b) IS21 as a mobile -35 promoter region, (i) Insertion of one copy of IS21 in plasmid RP4. Its -35 region can complete the -10 region of aphA (Kmr), allowing its transcription. (Standard spacing between the two regions for the £. coli u factor of RNA polymerase: 16-18 base pairs). The IS21 is not transcribed, (ii) Two tandem direct copies of IS21 into plasmid R6845. Formation of a complete and functional promoter using the -35 region of IS21-R and the -10 region of IS21-L allows transcription of IS21. Transcription oiaphA is still possible. rtoru Vznik funkčního promotoru inzercí dvou IS21 (R a L) Charakteristické rysy transpozice - frekvence transpozice 10~4 až 107cílový replikon - specifita začlenění je pro různé elementy různá, liší se pro různé replikony (chromozom x plazmidy) - mutace v genu pro transponázu ovlivňuje specifitu místa začlenění - transpozice vyžaduje neporušenost koncových IR - u Tn3 je známa imunita k transpozici podmíněná přítomností sekvencemi IR Frekvence transpozice - transponaza je v buňkách přítomna ve velmi nízkých koncentracích (0,15 molekuly na buňku) - aktivita transponázy se obtížně detekuje - preference působení transponázy v cis: působí přednostně na DNA, z níž byla transkribována - po uvolnění z DNA dochází k rychlému rozkladu transponázy Regulace transpozice TnlO ■ ■ : ■ Two promoters in opposite orientation lie near the outside boundary of IS10R. The strong promoter Pour sponsors transcription that may continue into the flanking host DNA. The weaker promoter P)N starts transcription of an RNA With a coding region that extends the length of ES1 OR and represents a 47,000 dalton protein. The "OUT" and "IN" transcripts have a 40-base overlap. TRANSPONAZA Several mechanisms restrain the frequency ofTn 10 transposition, by affecting either the synthesis or function of Itransposase protein. Transposition of an individual transposon is restricted by methylation to occur only after replication. In multicopy situations, cžs-preference restricts the choice of target, and OUT/IN RNA pairing inhibits synthesis of transposase. Pairing with excess OUT RNA prevents translation of IN RNA M 1 i ■ Transposase k»4RVvh acts in ds on DNA template Schopnost TnlO se transponovat je vázána na replikační cyklus a stav metylace regulačních sekvencí • Místo v IR Promotor Pin Genom bakteriofága Mu (dsDNA, 37 kb) C-konec c « _ t- a. a. m c 1 c i ° — CS i- *£ a 5 SVH cAB / C lys attL 0 epresor c reguluje negativně expresi genů A a B kódující ransponazu S-konec Olo h»ad and tall functions genes D-W < > LVH inv. seg. Mi DNA 10 .15 .20 25 .30 aítR .35 .kb A protein se váže ke koncům genomu Mu, což stimuluje B protein. Vazba probíhá na 22 bp sekvencích. Vzniklý komplex = transpososom. Na 3 koncích vznikají zlomy, stejně je zlomena DNA v hostitelském chromozomu. Replikace fága Mu a jeho mutagenní působení (a) + i? _/vWv^ — — — — /í/nA^. ^ r^ Key: ~ ~ Zľ ™ Original Mu DNA; ZZZZ~—replicated Mu DNA; ZZZZZZ: host DNA; original target DNA; replicated target DNA; 4 or t single-stranded nick a) vznik ss zlomů na koncích profága Mu a v cílovém místě b) volný konec profága Mu se spojí s řetězcem cílového místa c) doplnění jednořetězců replikací d) spojení jednoretezcových zlomů vede k duplikaci Mu Po infekci buněk se fág začlení do genomu zřejmě konzervativní transpozicí, během lytického cyklu se množí replikativní transpozicí. V obou případech jsou místa začleňování profága zcela náhodná Úloha transpozonů při evoluci R-plazmidů - každý transpozon může být přenášen nezávisle Průběh přenosu konjugativních transpozonů Replication j Integration --------sr É\ *" W& ji...'::m Transpozon začleněný do chromozomu se vyčlení a vytvoří kružnicový intermediát. Do recipientní buňky se přenáší kopie jednoho z řetězců prostřednictvím multiproteinového párovacího aparátu spojujícího obě buňky. Přené sená j ednořetězcová kopie se změní na dvouřetězcovou formu, která se začlení do chromozomu recipientní buňky Donor Recipient Model excize a integrace konjugativních transpozonů Tn916 a CTnDOT xxxxxx YYYYYY Excision Jn916 J CTnDOT QQQQQQ RRRRRR Resolution ^ YľYYYY New Target | CQQQQ'J Integration Resolution BBBBBB QQQQQÍ RRRRRR oř QQQQQQ :-.:■' RKRR AAAAAA í^GTAACTTŤGCl r Excision //'""""xS (CTnDOT J Resolution ([JJ 'xxxxx ,YYYYY New Target i ----------1:............3- oř 9 Integration Resolution *—] sera Spojovací chromozómové sekvence (XXX/YYY nebo QQQ/RRR jsou původně vzájemně komplementární). Šipky naznačují místa vzniku posunutých zlomů před excizí nebo před integrací Mobilizace genetických elementů konjugativními transpozony (působení in trans) Mobilization of co-resident Plasmids in trans -v Excision and mobilization of MTns Donor Recipient Mobilizovatelný rezidentní plazmid nese geny kódující proteiny vytvářející zlom v jeho DNA, CTn zajišťuje vytvoření multiproteinového párovacího aparátu CTn navozuje excizi rezidentního mobilizovatelného transpozonu (MTn) -CTn poskytuje proteiny pro excizi a cirkularizaci a pro přenos ss-formy MTn do recipienta, kde se MTn již samostatně integruje do chromozomu