MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification)


Úvod:

o        kvantitativní metoda umožňující detekci různých genových přestaveb, které nejčastěji
vznikají nerovnoměrným crossing-overem mezi repetetivními sekvencemi ležícími v intronových
oblastech genu

o        průkaz delecí a duplikací v řádech desítek až stovek kilobazí, které nejsou běžnými PCR
technikami zjistitelné



Princip:





































Úloha:

                      Stanovení přítomnosti přestaveb v genu pro LDL receptor


Úvod:

            LDLR gen: 19. chromozóm (p13.1 - p13.3), 45kb,18 exonů.

            Protein: LDL receptor – 839 aminokyselin.


            Mutace nebo přestavby v genu pro LDL receptor jsou příčinou familiární
hypercholesterolémie. Jedná se o autozomálně dominantní onemocnění charakterizované zvýšenými
koncentracemi celkového a LDL cholesterolu a předčasnou klinickou manifestací ischemické choroby
srdeční.


Úkol:

            Stanovení přítomnosti přestaveb v genu pro LDL receptor v předložených vzorcích.



Pracovní postup:

DNA denaturace a hybridizace SALSA MLPA sond (1.den odpoledne)

1.      Rozmrazit SALSA Probe-mix (černé víčko) a MLPA Buffer (žluté víčko). Nechat na ledu.

2.      Do eppendorfek rozpipetovat 5 ul DNA (ideálně kolem 50 – 75 ng/reakce)

3.      Vzorky do cykleru – program MLPA (vyhřívané víko), 98 °C/5 min, 25 °C/forever. Až se blok
vyhladí na 25 °C, počkat 30 sekund – vyndat eppendorfky, přiklopit víko, program nechat běžet dál

4.      Přidat (popř. si udělat) master mix (MM) a rozpipetovat po 3 ul:

+ 1,5 ul SALSA Probe-mix (černé víčko)

+ 1,5 ul MLPA Buffer (žluté víčko)

5.      Propipetovat, zakápnout olejem.

6.      Zpět do cykleru, přesunout na další krok – 95 °C/1 min, 60 °C/forever – cca 16 hodin (přes
noc

Ligační reakce (2.den ráno)

1.      Rozmrazit Ligase-65 Buffer A (průhledné víčko), Ligase-65 Buffer B (bílé víčko), Ligase-65
(zelené víčko), SALSA PCR Buffer (červené víčko), SALSA PCR – primers (hnědé víčko), SALSA Enzym
Dilution Buffer (modré víčko) a SALSA Polymerase (oranžové víčko) – podtržené na ledu!!

2.      Nachystat si Ligase-65 mix (max. 1 hodinu dopředu, uchovávat na ledu)

Pro jednu reakci: 3 ul Ligase-65 Buffer A (průhledné víčko)

                            3 ul Ligase-65 Buffer B (bílé víčko)

                            25 ul voda

                            1 ul Ligase-65 (zelené víčko)

3.      Program v cykleru přesunout na další krok (54 °C/forever – až se ochladí, počkat 30 s,
vyndat vzorky.

4.      Přidat 32 ul připraveného Ligase-65 mixu

5.      Vzorky vrátit do cykleru, přesunout na další kroky – 54 °C/15 min, 98 °C/5 min, 10
°C/forever.

PCR reakce:

1.      Nachystat si další dva MM:

PCR mix 1 – pro 1 reakci:      2 ul SALSA PCR Buffer (červené víčko)

                                               13 ul voda

PCR mix 2 (max. 1 hodinu dopředu, uchovávat na ledu, zabalit do alobalu!!!)

                   - pro 1 reakci:      1 ul SALSA PCR – primers (hnědé víčko)

                                               1 ul SALSA Enzyme Dilution Buffer (modré)

                                               2,75 ul voda

                                               0,25 ul SALSA Polymerase (oranžové víčko)

2.      PCR mix 1 rozpipetovat po 15 ul do nových eppendorfek, přidat do každé 5 ul produktu MLPA
ligační reakce (zbytek si ponechat a schovat do lednice)

3.      Vzorky vrátit do cykleru, program přesunout na další krok (60 °C/forever) – nechat prohřát
30s, otevřít víko cykleru a přímo v cykleru přidávat  5 ul PCR mixu 2, propipetovat a hned vracet
do cykleru

4.      Přesunout na další kroky – PCR reakce

5.      Kontrola produktů na elektroforéze (2% gel, nanášet 5 ul)

6.      Fotku k sekvenátoru, fragmentační analýza





Hodnocení výsledků:

Subjektivní hodnocení výsledků fragmentační analýzi. Hodnocení pomocí softwaru Coffalyser^® (MRC
Holland)