VÝZNAM MUTAGENEZE U BAKTERIÍ □ Vyhledání genu a stanovení jeho funkce □ praktické využití modifikovaných kmenů (biotechnologie) □ příprava vakcín □ Výhody mikroorganismů při mutagenezi ■ vysoká přirozená variabilita ■ haploidní génom (malá velikost) ■ velký počet potomstva za krátkou dobu ■ snadný přenos genů ■ snadná selekce □ Způsoby mutageneze ■ klasická mutageneze (chemomutageny, fyzikální faktory) ■ transpozonová mutageneze (biologické mutageny) ■ mutátorové kmeny (mutace v reparačních mechanizmech) ■ mutageneze in vitro NOMENKLATURA □ Genotyp: třípísmenový kód (zkratka) psaný kurzívou □ Gen je označen zkratkou trp/K, alely ŕrpAl ■ a) Standardní alely se označují znaménkem +, např. rrp+ ■ b) Mutantní alely se označují znaménkem -, např. trp- □ Fenotyp: Velké písmeno na začátku ne kruzívou, např. Trp, Standardní fenotyp se označí +, např. Trp+, mutantni -. Symbol není v^dy totožný s označením genotypu. Nagř. fenotyp Nif- muže mít podstatu v nifX- nebo nodX- (různé geny). □ Rezistence: r (R), s (S), uváděné jako exponenty (TetR) ■ delece = A ■ inzerce = : ■ plazmid, profág = E. co/i (RP4, c>80) TcR x TetR ZÁKLADNÍ TYPY MUTACÍ U BAKTÉRIÍ □ se změnou v morfologii kolonií □ se změnou citlivosti (k antibiotikům, toxickým látkám, záření, fágům aj.) □ v požadavcích na růstové faktory (auxotrofní) □ se změnou v produkci látek (např. pigmentů) □ supresorsenzitivní (citlivé k supresorům) □ supresorové (vedoucí ke vzniku supresorů) □ ovlivňující reparační a rekombinační schopnosti □ vedoucí ke vzniku mutátorových kmenů □ se změnou citlivosti k teplotě - vysoké nebo nízké (teplotně senzitivní) Mutace letální x kondicionálně (podmíněně) letální Typ mutace Podstata změny Detekce mutant Ztráta pohyblivosti Ztráta bičíku, nefunkční bičík Kompaktní kolonie namísto plochých Ztráta kapsuly Ztráta nebo modifikace povrchových kapsulárních struktur Malé drsné kolonie namísto velkých a hladkých kolonií Drsné kolonie Ztráta nebo změna lipopolysacharidové vnější vrstvy Nepravidelné granulami kolonie namísto hladkých lesklých kolonií Změna ve výživě Ztráta enzymu biosyntetické dráhy Neschopnost růstu na mediu postrádajícím daný růstový faktor Zkvašování cukrů Ztráta enzymu katabolické dráhy Nedochází ke změně barvy v mediu obsahujícím cukr a pH indikátor Rezistence k antibiotiku Zábrana vstupu do buňky, změna cílové molekuly (složky ribozomu), detoxikace antibiotika Růst na mediu obsahujícím inhibiční koncentraci antibiotika Rezistence k fágu Ztráta receptoru Růst v přítomnosti fága Citlivost k teplotě Změna struktury esenciálního proteinu Neschopnost růstu při zvýšené teplotě Citlivost k chladu Změna struktury esenciálního proteinu Neschopnost růstu při nízké teplotě Table 16. Genotypes of Frequently Used Bacterial Strains. Strain_Genotype_ ' ' - C600 (1) F-. tr»'-1, thrt, feuB6, fecYÍ. fonA21, _sl/pE44, \- _ C600HA (1) F-, frw-1, íňr-1, teuB6, tecYl. tonA21, _SupE44. X- MA150, [cneTnIO] - DH1 (2) F~ recAl, enoWl, oyrA96, íŕi/-1. hsdHM _(r„-. m.+ ). supEAA, re!A 1~. A"_ DH5a F- (p80d, /3CZAM15, encWI. recA1, hsdRl7 (f«~ m<+). strp E44, /ftM, d-, gyrA96, _A(feicZYA-arg/F), 11169' OHSqF' $80d. fecZAM15, endA1, recA1. r)sdRl7 (r<~, m,.-), supE44, íň/-1, ď*, gyr A9G. _A(tecZYA-argF). U169_ HB101 (3) F", hsdS20 (r,- m,-), supE44. recA13, «914, _proA2. rpsL20 (str"), jfy/-5, m/f-5, £ĽpE44, Ar JM83 (4) ara, A(lac-proAB), rpsL, p£44, L{lac-pro)_ JM109 (4) endM, recM, syrA96, thi, nscŕR17 (r<~; m,+). reiki, sup E44, \- A(/ac-praAB). _[F', fraP36, proAB, tecPZAMIS]_ JM109 encWI, recAl, syrA96, íŕt/, /isdR17 (rr. rrv+). (DE3) (4) relAí, st/pE44, A(íac-proAB), [F', fraD36, _proAB, fecPZAMlS], A(DE3) JM110 (4) rpsL, thr, leu, thi, /acY, galK, gall, ara, tonA. tsx, dam, dem, supE44, A(/ac-proAB), _[F', ŕraP36,proAB, /acl°ZAM15)_ Strain Genotype KW251 F- supE44, galKŽ, gaľí22, meíB1, hsdR2, mcrB1, mcrA- argASV. Tn10, recP1014 NM522 (6) supE, thi, A(/ac-proAB), AhsdS (r-, m-)/, IF'. proAB. /aclsZAMl5J NM538 (7) supF, ŕisďR (rK~, m«+) N M 539 (7) supF, ňscŕR (r-. m+) (P2) RRt (3) F- ŕisdS20 {r,-, m,-). supE44, ara 14, proA2, rpsL2Q (str),.xy/-5, m/f-5, SupE44, \~ X1776 (3) F~, ŕonA53, dapDS, m/nA1, g/nV44, (sup E44), Afgaŕ-uwB) 40. X-. m/n82, rfb-2. gyrA25. íftyA142, oms-2, mefC65. omsA, (í/e-1), A(Ď/oH-asd) 29, cyc52, cycA1, hsdA2 Y1088 (8) A(/acUl69), supE, supF, hsdR (r-, m + ), metB, traft, tonA2\, proC::Th5 (pMC9) Y1089 (8) A(fecU169), proA+,A(lon), araD139. sŕrA, MA150 [chr::TM0], (pMC9) Y1090 (8) A(/acU169), proA+,A{lon), ara0139. Sír A, sup?, [D-pC22::Tn10J. (pMC9), (r,-, m«+) References: 1. Jendrisak, J., Young, R.A., and Engel. J. (1987) in: Guide to Molecular Cloning Techniques, Eds. Berger, S. and Kimmel, A., Academic Press. 359-371. 2. Hanahan, D. (1983) J. Mo!. Bioi. F126B166., 557-580. 3. Maniatis, T„ Fritsch, E.F., and Sambrook. J. (1982) in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 4. Yanisch-Perron, C, Viera. J., and Messing, J. (1985) Gene 33. 103-119. 5. Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet. 150, 53-58. 6. Cough, J. and Murray, N. (1983) J. Mol. Biol. 166, 1-19. 7. Frischauf. A., et al. (1983) J. Mot. Biol. 170, 827-842. a Huynh, I, Young, RA, and Davis, R. (1985) in;.DNA Cloning Volume 1, Eds. Glover, O., IRL Press Ltd, 56-110. Důležité genotypy: - auxotrofie - suprese - restrikce - lacZ - přítomnost plazmidů - přítomnost profágů - přítomnost Tn a IS - reparace - rekombinace - rezistence k fágům LE392 (5) Fi ŕrso'R574 (r,-. rrv+J, supE44, supF58 lacY1, or A(tec1ZY)6. £?a/K2. fja/T22. meiBI, _frpR55, X-_ Gene Phenotypic trail symbol Mnemonic affected Table 15. Descriptions of Common Host Mutations. Gene symbol Mnemonic Phenotypic trail affected araA Arabinose L-Arabinose isomerase araC Arabinose regulatory gene: activator and repressor protein dapO Diarniniopimelate Succinyi-diaminopimelate aminotransferase endA DNA specific endonuclease galK Galactose galactokinase gal\J Galactose Glucose-l-phosphate uridylyltransferase gyrA Gyrase subunit A, resistance or sensitivity to nalidixic acid X phages with a normal repressor (cl) gene are inhibited from the lytic cycle. The lysogeny frequency is greatly enhanced hisS Histidine Histidyl-tRNA synthetase lac\ Lactose regulator gene; repressor protein of lac operon lacY Lactose galactoside permease ladZ Lactose P-D-galactosidase leuA Leucine a-lsopropylmalate synthase teuB Leucine P-lsopropylmalate dehydrogenase metA Methionine homoserine transsuccinylase meß Methionine cystathionine a-synthase mtlA Mannitol Mannitol-specific enzyme II of phosphotransferase system P2(2) X phages containing the reef and gam genes of X are growth inhibited by P2 lysogens proA Proline cc-glutamyl phosphate reductase prcB Proline a-glutamy! kinase recA Recombination general recombination, repair of radiation damage and induction of phage lambda recB and recC Recombination recombination and repair of radiation damage exonucleaseV subunit rede. Recombination locus of rac prophage exonuclease VIII red? Recombination recombination and repair of radiation damage relA Relaxed regulation of RNA synthesis-stringent factor, ATP:GTP 3' pyrophosphotransferase rpsL Ribosomal protein, small 30S ribosomal subunit protein S12 supB, supC, supG, supL, supM, supH and supO Suppressor suppressors of ochre (UAA) and amber (UAG) mutations supD. supE, Supressor and supF supressor of amber mutations thiA Thiamine Thiamine thiazole requirement tonA T-one outer membrane protein receptor for ferrichrome, colicin M, and phages T1.T5, and$80 torB T-one uptake? of chelated iron and cyanobalamin xylA Xylose D-xylose isomerase Miscellaneous F- host does not contain an episome f host contains episome with stated features x- bacteriophage lambda DNA is not integrated into genome of bacterial host References: 1. Hoyt, A.. (1982) Cell 31.565-569. 2. Kaiser, K. and Murray. N. in DNA Cloning Vol. 1, Eds. Glover. D..IRL Press Ltd. 1 -47. Table IIIA. Mutagens Used for Bacteria Mutagen Apparent in vivo specificity Additional advantages Disadvantages 2-AP (2-aminopurihe) 5-BU (5-bromouracil) NH2OH (hydroxylamine) Sodium bisulfite transitions A:T U G:C transitions A:T ^ G:C transitions A:T ±5 G:C specific transition G:C-A:T in some casesj a weak mutagen must depress I normal thymine incorporationj; weak mutagen in some cases ja weak mutagen weak mutagen Mutator gene (mutT) EMS (ethylmethane sulfonate) NG (nitrosoguarlidine) ICR 191 Nitrous acid UV (ultraviolet radiation) Mu-1 phage Spontaneous (no mutagen) specific transversion A:T-»C:G transitions and trans-versions transitions and trans-versions; induces small deletions at low rate frameshifts; small insertions and deletions transitions and probably transversions; deletions transitions and probably transversions; deletions; possibly stimulates insertions and chromosomal rearrangements insertions; some deletions transitions; transversions; insertions; deletions (frameshifts) no treatment required powerful mutagen very powerful mutagen powerful mutagen random induction of non-leaky, polar, non-reverting mutations wide spectrum of mutations; no complications due to secondary mutations genetic construction required I dangerous to handle dangerous to , handle; frequent secondary mutations compound difficult to obtain high amount of killing required! for good mutagenesis high amount o£ killing required for good mutageneiis; certain strains too sensitive low level of mutants; many siblings in each culture Stanovení počtu mutant v jednotlivých intervalech působení mutagenu Fig. 7.5 A dose-response curve after treatment by a mutagen. A suspension Of the cyanobacterium Synechocyslis PCC6714 was irradiated with UV light for increasing doses (i.e. increasing lengths of time). Aliquots were then plated on normal medium (measure of survival, curve A) and on the same medium complemented with pF-phenylalanine, a toxic analogue of phenylalanine, to determine the induction of pF-phenylalanine resistant mutants. These are expressed as their concentration (/unit volume) in each sample (curve B) and in proportion of total viable cells in each sample (curve C). (After Astier et al, 1979) N, N0 = viable cells; M = mutants. POSTUPY PŘI IZOLACI MUTANT □ Skríning (vyhledání mutant na základě pozorovatelné zgněny fenotypu: Rust na indikátorových mediích (utilizace cukru - tvorba kyselm - změna pH - změna barvy) - podobně jako při odlišování druhů □ Obohacování (zvyšování počtu mutant) ■ penicilinová metoda. ■ inkorporace radioaktivního prekurzoru (radioaktivní sebevražda). □ Selekce (růst za podmínek, při nichž roste jen mutant, buňky standardního typu nepřežívaií nebo nerostou /pozitivní selekce/, nebo nerostou mutanty, ale buňky standardního typu přežívajío /negativní selekce/ - např. rezistence/citlivost k vnějším faktorům □ Replikování (přeonos kolonií na medium s odlišným složením: chybění živin n. růstových faktorů, přítomnost inhibitorů růstu (aminokyseliny, antibiotika, bakteriofágy, aj) IZOLACE MUTANT REZISTENTNÍCH K ANTIBIOTIKU NA GRADIENTNÍCH PLOTNÁCH Razítkování (Replikování) Mutants do not grow Počet buněk 108 105 1021 1 Plotny bez streptomycínu Prenos po moc f raiľika Plotny be2 streptomycínu Plotny Sr streptor.ijcínem Cista kulturs Str Obr, 293. Schéma postupu při nepřímé selekci mutant ú razítkovou metodou. Izolace auxotrofních mutant penicilínovou metodou auxanografie \SSř W ^ V=7 Oza'rená suspenze Buňky vyrostlé v kom- buněk proiolrofnrho pietni' pude se několik- kmene se kultivuje rát promují ve fyzíolo- v kompletní pudě ojckém roztoku. M hodin. Zředěné inokulum 2 minimální půdy promytých buněk se provede rozsev se naočkuje do mi- na plotnu 2 kom-nimálni půd^která pietni pudy. obsahuje 100 aí 300mj. penicilinu v"lml. V této půdě přežijí' jen auxotrofnímutanti. Prototrofy rostou a tudíž hynou, auxotrofní mutanty nerostou a přežívají (negativní selekce) Kompletní Minimální půda půda Tatáž kolonie se naočkuje . do kompletní i minimální pudy. Jestliže vyroste jen v kompletní pudl, znamená to, ze představuje klon auxotrofního mutanta Dalšími testy se zjistí, 23 přítomnosti které' aminokyseliny roste na minimální půdě. SCHEMATICKÉ ZNÁZORNĚNI POSTUPU PRI STANOVENI NÁSLEDNOSTI REAKCÍ PŘI BIOSYNTÉZE AMINOKYSELIN POMOCÍ AUXOTROFNÍCH MUTANT Fenotypy mutant antranilová yy- kyselina --®- enzymy ß- Indol Q- -—©- trypfofán — @ Standardní typ blokáda přeměny se nahromaďuje ©-:-© ra nahromaďuje ©--©-© se nahromaďuje Mutanti skupiny č-3 stimulují v růstu mutanty skupiny č.1a 2 .Toznamená,že mutant č.3 syntetizuje produkt, . který krustu vyžadují mutanti skupiny č.1 a 2. 2 toho je zrejmé,že u mutantú skupiny 5.1 a 2 je mutací zastaven některý ze stupňů biosyntézy tryptofanu, který pŕedcha'zf stupni, který je zastaven u mutantú skupiny Č.3. Tento test ukazuje, že mulanti skupiny č'1 jsou stimulovali mutanty skupiny č.2 a tito opět mutanty skupiny č.3. To znamená', že u mutantů skupiny č.1 jazastaven některý i prvních stupnú biosynteay tryptofánu , po kterém na'sleduja stupeň reprezentovaný mulanty skupiny č.2 a pak skupiny Č.3. Tento test dokazuje, že mulanti skupin č.2a 3 syntetizují meziprodukty tryptofánu potřebné krustu muiantů skupiny č.1. Mutant č.1 A- a Mutant i 2 B- b -H* c Mutant č-3 c- c H+ d Ue tedy uzavřít, že mutanti skupiny č.1 potřebují k růstu meziprodukt syntetizovaný mutanty skupiny č-2 a tito potřebují meziprodukt syntetizovaný mutanty skupiny č.3. FENOTYPOVÉ ZDRŽENÍ (receslvní mutace) STAV DNA V BUŇCE SEGREGAČNÍ LAG (dominantní mutace) Prodleva v čase před tím, než je mutace detekovatelná Mutace probíhá v částečně zreplikované DNA Mutantní fenoíyp se neprojevuje, jelikož cytoplazma ještě obsahuje produkt genu standardního typu Doba, která je nutná k tomu, aby mutace byla na všech kopiích chromozomu Projeví se mutantní fenotyp Completion of replication GENERACE První dělení buňky Buňky standardního typ Mutant phenotype.will appear as soon as wild type gene product is sufficiently diluted or gone from cytoplasm. Mutant cell number begins to Increase at next cell division. Druhé buněčné dělení Increase in mutant cell number occurs at next division. Buňky stadardního typu Mutantní buňky VZNIK SEKTOROVÝCH KOLONII JAKO DŮSLEDEK SEGREGAČNÍHO LAGU Počet chromozomů na buňku 1 2 4 Mislačně 2měněný chromozom Ncsekíorová Půlsekiorová Čtvrtsektorová kolonie kolonie kolonie Jaderná segregace a vznik sektorových kolonii. Izolace supresorsenzitivních mutant Tyto mutanty mají nesmyslný kodon v některém z genů. Vyskytují se v množství 1 -1,5% mezi mutanty jakéhokoliv znaku. Detekují se tak, že se do mutantů vnese transdukujícím fágem alela supresorového genu (sup-) - lze vnést též na plazmidu. Jestliže se kolonie mutant daného znaku (tj. různých mutant v tomto znaku, nejen sus!) přerazítkují na selektivní plotny s fágem, který obsahuje supresor vyrostou jen ty, které nesou mutaci podmíněnou vznikem nesmyslného kodonu, nikoliv ty, které mají jiný defekt v příslušném genu. IZOLACE SUPRESORPOZITIVNÍCH MUTANT (Su + ) (supresorových) dvojnásobný mutant Tato buňka obsahuje kodónu, amber v genech laca trp Důkaz: vnesení fága se Su+, reverze fenotypu jednostupňová reverze Mutace v genu sup (gen pro tRNA) Důkaz: vnesení fága se sus, který na tomto kmeni poroste Reverze kodónu UAG Su"Lac+Trp* V2nik nové supresorové a!efy v Su+ Lac+Trp' Buňka vlevo má amber mutaci v genech lac a trp, Vpravo jsou znázorněny dva typy reverfantů Lac+. Jeden se vytvořil vznikem nové supresorové aíely a druhy vznikl reverzf v kodónu amber. príklad supresorove mutace a její důkaz křížením mutace reverze Gen A je součástí trtjptofáriového operónu Mutace,reverze a supresorová mutace genu A sup A* Štandardní tqp _A*_ (tryptofan se tvoří) 1 A~ eupA* Mutant genu A (trupbfan se netvoří) IV \ sup A' sup A - Vznik Revertant (tryptofán se tvoří) Supresorovij" mutant {tnjptofán se Ivon) supresorove mutace (Su + ) li Důkaz supresorove mutace _ sup A* A" sup A" A+ Standardní tup Supresorový mutant sup sup Á+ „II______ supA = mutantní alela genu pro tRNA schopná suprimovat sup A" sup A* Vyšte pí se původní "-- mutant genu A TEORETICKÉ PREDPOKLADY FLUKTUAČNÍHO TESTU (LURIA A DELBRÜCK 1943) □ Pravděpodobnost mutace ie velmi nízká, ale stejná pro každou buňku (10~6-10 10 b/generaci) □ Uvažujeme-li určitou kulturu, pocházejí z jedné buňky, pak na konci kultivace bude počet mutant odrážet dobu, ve které mutace vznikla (tj. ve které generaci). Vzhledem k nízké pravděpodobnosti mutace lze předpokládat, že i počty mutant v jednotlivých klonech budou rozděleny podle Poissonovy řady - to proto, že záleží na generaci, ve které k mutaci došlo. Proto se budou významně lišit počty mutant v jednotlivých kulturách a v kultuře, kde byly buňky pěstovány dohromady. □ Při fyziologické adaptaci reagují buňky na přítomnost látky v prostředí - to působí jako indukční ag^ns, které indukuje adaptivní odpověď (n^př. tvorbu enzymyapod). Počet reagujících buněk z různých kultur (klonu) je zhruba stejný. Fluktuační test Mutace? Adaptace? Stejný počet buněk Zásobní kultura Str8 Bujónová kultura ředěno na 1.10^ buněk/ml 10ml 0,5 ml v každé zkumavce V3> <3/ 0,5 ml na každou plotnu se.strep-tomycinem Inkubace 24-36 hod, ' I . Obsah zkumavek vylit na .plotny se streptomycinem Kontrola: důkaz citlivosti výchozí kultury ke streptomycínu \ o*- Počet kolonií Agarová plotna na plotně bez se streptomy-streptomycinu činem Rozsev pro stanovení celkového počtu buněk Průkazné rozdíly v počtech kolonií na jednotlivých plotnách Přibližně stejné počty.kolonii Výpočet chi-kvadrátu a stanovení průkaznosti rozdílů Závislost konečného počtu mutant na době, v níž mutace proběhla Culture 1 Culture 2 Generation oooooooo ••••oo««oooooooo 1 mutace: celkem 8 kolonií 2 mutace: celkem 6 kolonií Počty rezistentních bakterií z nerozdělené kultury a samostatných kultur Alikvoty z nerozdělené kultury Samostatné kultury Aliquot no. No. of resistant bacteria Culture no. No. of resistant bacteria 1 14 1 1 2 15 2 0 3 13 3 3 4 21 4 0 5 15 5 0 6 14 6 5 7 26 7 0 8 16 8 5 9 20 9 0 10 13 10 6 11 107 12 0 13 0 14 0 15 1 16 0 17 0 18 64 19 0 20 35 PROVEDENI FLUKTUAČNÍHO TESTU □ Má se rozhodnout, zda rezistence ke streptomycínu je výsledkem adaptace nebo mutace (zda jsou mutanty přítomny v kultuře před vystavením buněk selekčnímu agens nebo se objevuji až poté) ■ 1. Ověří se, zda je výchozí kultura citlivá k streptomycínu ■ 2. Řada zkumavek s mediem bez streptomycínu se naočkuje malým a stejným množstvím buněk ■ 3. Stejné množství buněk se naočkuje do Erlenky s objemem, který je součtem objemu v jednotlivých zkumavkách ■ 4. Kultury se ponechají inkubovat 24 hod ■ 5. Kultury se vysejí ve stejném množství na plotny se streptomycinem ■ 6. Vyhodnotí se počty kolonií na jednotlivých plotnách a srovnají se ■ 7. Vypočte se %2 a stanoví se, zda existují průkazné rozdíly v poetech kolonií na plotnách ■ 8. Průkazný rozdíl v počtu kolonií na plotnách z jednotlivých kultur ve srovnání s počty na plotnách z jedné kultury svědčí o tom, že rezistence ke streptomycínu vznikla mutací. REPARACE MUTAČNĚ POŠKOZENÉ DNA □ A. Přímé reparace ■ 1. fotoreaktivace ■ 2. dealkylace □ B. Nepřímé reaparace ■ 1. Excizní reparace □ bázová □ nukleotidová □ řízená metylací ■ 2. rekombinační/postreplikační/ ■ 3. reaparace kroslinků □ C. Inducibilní reparace ■ 1. SOS-odpověď ■ 2. adaptivní odpovědi □ na alkylační poškození □ na environmentálni stres Genetický aparát pro reparaci DNA - velmi konzervativní - asi 100 genů - distinktní dráhy, které se mohou prolínat TYPY REPAROVATELNYCH POŠKOZENI NA DNA (a) A P-místo (b) Chybná báze (c) rr i m 11ixi111 Tyminový dimer 111111111 (d) rr n ■is * zlo n I ZLOH Fig. 8.1 Classification of repairable lesions, (a) Missing base; (b) incorrect base; (c) modified base (distorting the double helix); (d) single-strand break; (e) double-strand break; (f) interstrand cross-link. 5' t I I *Q-P=0 i 0 1 H,C 5' i I i "0-P=0 i O h' \? V \ c-c I I 0 H 1 i i I 3' H2C 1/-° C "C i \H H / ^ H \ i i / H C-C 0 H i 1 i 3' Vznik AP míst = nejčastější spontánní mutace (depurinace je lOOx častější než depyrimidinace) Fig. 8.2 Formation of an AP (apurinic/apyrimidinic) site. (a) Reactive double bonds Adjacent thymine residues >ugar-phosphate backbone UV light Pyrimidine residues linked between carbon atoms 5 and 6 of each ring 6 Jk<\ Ml (b) Reactive groups Pyrimidine residues linked between carbon atom 6 of thymine and carbon atom 4 of cytokine UV light Adjacent thymine (5') and cytosine (3') residues Distorted sugar-phosphate backbone STÁDIA FOTO REAKTIVACE TtT. ♦ TT DNA obsahující dimer (dsDNA, ssDNA) Vazba fotolyázy v místě dimeru (6-7 bp) Monomerizace dimeru za přítomnosti světla (365-400 nm) uvolnění fotolyázy fotolýza FADH2 Folát/deazaf lavin zachyceni svetla tgccttagat 3"* a c g g a a t c t a tyminový dimer O UV ozáření. 5' t g c c ag.íi á'cggÄÄtctä 3"* I I I O Fotolyáza se váže na tyminový dimer v DNA. fotolyáza je aktivována absorpcí modrého svetla Štěpeni vazeb dímerú. 3"^ t g (e c A p A t ACg\gÄÄŤ/ČŤÄ t 5' Uvolněni enzymu. 5' T r-. tgccttagat acggaäťčťä Alkyltransferäza: 60-Metylguanin-DNA-metyltransferäza (60-MGT= Ada-protein) nemetylovanä forma metylovanä forma Figur© 19-29 Direct reversal of DNA damage by an alkyltransferase. Methylation of a guanine residue by nitrosoguanidine (NG) is repaired by this novel process. The NG adds a methyl group (CH3) at various sites in the DNA, including an oxygen atom at position 6 of guanine {left). This disrupts the hydrogen bonding of guanine to a cytosine. The repair is accomplished by a methyl-acceptor protein, one of the enzymes known as alkyltransferases. A cysteine residue on the protein acts as the methyl acceptor: it binds the CH3 group, thereby restoring the guanine to its original state (right). (From P. Howard-Flanders, "Inducible Repair of DNA." Copyright © 1981 by Scientific American, Inc. All rights reserved.) BAZOVÁ EXCIZNI REPARACE ta) Vyšte pen í chybné báze (c) (d) DNA Glycosylate OH Class II C:G transversions Moderate 61 95 59 S6 G4 82 95 42 56 SS S9 87 G:C—>A:T and A:T-» G:C transitions; frameshifts G:C—>A:T and A:T-» G:C transitions; frameshifts G;C—»A:T and A:T-» G:C transitions; frameshifts G:C—*A:T and A:T—> G:C transitions; frameshifts All base substitutions; frameshifts G:C-» T:A transversions G:C-*T:A transversions A:T->TAG:C-*PA and A:T—»C:G transversions A:T-*T-.A, G:C-*T:A, and A:T-> C:G transversions G:C—>A:T and A:T-» G:C transitions; frameshifts G:C—» A;T transitions Frameshifts; deletions Strong Strong Strong Strong Very strong Moderate Moderate Moderate Weak/ moderate Moderate Weak/ moderate Weak Weak Weak/ moderate Prevents incorporation of A:8-oxodG mispairs by hydrolyzing 8-QxedGTP Lacks mefhyl-direeted mismatch repair system Lacks methyl-directed mismatch repair system Lacks methyl-directed mismatch repair system Lacks helicase II and the methyl-direeted mismatch repair system Altered e subunit of DNA polymerase III Lacks glycosylase that corrects G:A and 8-oxodG:. mispairs Fapy glycosylase (8-oxodG glycosylase) Lacks DNA adenine methylase Lacks uracil-DNA glycosylase Lacks superoxide dismutase, manganese Lacks positive regulator of oxidative damage genes Lacks DNA polymerase I