RESTRIKCE A MODIFIKACE FÁGOVÉ DNA Kmeny E. coli K a K(P1) + mají vzájemně odlišnou hostitelskou specifitu (K a P1) = obsahují odlišné RM-systémy po jednom cyklu Fágy po jednom růstovém cyklu na hostiteli získávají nové hostitelské spektrum. Nejedná se o mutaci - změna se týká celé populace a není dědičná – epigenetická záležitost. Experimentální důkaz přítomnosti a působení RM systémů Kmen E. coli obsahující RM systém EcoB Kmen E. coli obsahující RM systém EcoK nemodifikovaný fág Plaka vytvořená fágem, který se na kmeni B modifikoval Plaka vytvořená fágem, který se na kmeni K modifikoval RESTRIKČNĚ-MODIFIKAČNÍ (RM) SYSTÉMY Složkami standardního restrikčně-modifikačního (RM) systému jsou sekvenčně specifické enzymy: A. modifikační metyláza (metyltransferáza) B. restrikční endonukleáza Restrikci a modifikaci podléhá jen dsDNA: 1. Při infekci fágem 2. Při přenosech DNA transdukcí a konjugací, omezeně transformací (při umělé tr.) Monitrování příjmu exogenní DNA – „imunitní systém prokaryot“ N6mA C5mC N6mA Donor metylové skupiny: SAM (AdoMet) SYSTÉMY RESTRIKCE A METYLACE 1. Hsd systémy (host specificity of DNA) třídy (typy) I, II, III, IV restrikční a metylační aktivita 2. Systémy restrikce modifikované DNA Mar, Mrr (methylated-adenine), DpnI Mcr (methylated-cytosine) 3. Systémy metylující specifické sekvence DNA Dam (adenine-methylation) Dcm (cytosine-methylation) 95% 1-2 geny, 30 protein štěpí jen modifikovanou DNA GENY KÓDUJÍCÍ RM-SYSTÉMY JSOU NESENY NA RŮZNÝCH REPLIKONECH lokalizace genů na chromozomu, plazmidech, nebo profágách Mobilní element Příklad RM systému Plazmid paeR71 P. aeruginosa ecoRI E. coli ssoII Shigella sonnei bsp6I Bacillus sp. Bakteriofág/profág hindIII H. influenzae sau42I S. aureus ecoO1091 E. coli bsuMI B. subtilis Integrační komulativní element/genomický ostrov Sth368I Streptocvoccus thermophilus hsdMS S. aureus Transpozon Rle39BI Integron xbaI Xanthomonas campestris M.Vch0211 Vibrio cholera hphI Vibrio metschnikovii CAA68 Lactococcus lactis Přítomnost genů RM systémů na mobilních elementech PODJEDNOTKOVÉ SLOŽENÍ ENZYMOVÉHO KOMPLEXU TYPU I Multifunkční komplex S = rozpoznání cílové sekvence M = vazebné místo pro SAM a aktivní místo pro metylaci R = aktivní místo pro hydrolýzu ATP, pro translokaci DNA a pro štěpení Alosterický efektor umožňující rozpoznání cílové sekvence SAM se uvolňuje před štěpením INTERAKCE ENZYMŮ RM SYSTÉMU TYPU I S CÍLOVOU SEKVENCÍ NA DNA 1. Vyhledání rozpoznávací sekvence 2. Podle stavu sekvence (M, NM, H-M) dochází k a) uvolnění enzymu b) restrikci c) metylaci Interakce enzymového komplexu s rozpoznávacím místem ATP-dependentní translokace DNA - ke štěpení dochází po kolizi DNA řetězců v místě navázaného enzymu štěpení MODELY TRANSLOKACE DNA ZPROSTŘEDKOVANÉ ENZYMY RM SYSTÉMŮ TYPU I Smyčky pozorované v EM Pokud jsou místa nemodifikovaná, vytváří se rozpoznávací komplex, vázaný na rozpoznávací místo, a jím je DNA protahována (translokována) až k místu vzdálenému zhruba 1000 bp nebo více, kde pak proběhne štěpení. Navázaný restrikční enzym smyčka TRD = target recognition domain Geny hsdS mohou rekombinovat – představují dvě alely Struktura rozpoznávací podjednotky Pro RM systém typu I je nezbytná funkční hsdS její mutace vede k fenotypu r- m-. S- M-RMUTACE V GENECH RM SYSTÉMU r+/-/m- RM SYSTÉMY, U NICHŽ JE ŠTĚPENA cizorodá MODIFIKOVANÁ DNA (KMEN NETVOŘÍ METYLÁZU) E. coli K12 Mar = methyladenine restriction (GmeAC, GmeAG) Mrr = methyladenine recognition and restriction Mcr = methylcytosine restriction - modified cytosine restriction (GmeCG - C5, N4, HM-C5) štěpení sekvence v několika místech (štěpí též neglukozylovanou fágovou DNA) Diplocooccus (Streptococcus) pneumoniae: RM systém DpnI - štěpí GmACT (Caulobacter, Neisseria, Acholeplasma, Streptomyces) Kóduje místně specifickou metylázu Na úrovni populace Standardní RM systém Mechanismy, kterými plazmidy a fágy unikají restrikci 1. Neobvyklé modifikace DNA 2. Nízká frekvence cílových míst 3. Tvorba proteinů, které interferují s jednou nebo více aktivitami RM systému 4. DNA vstupující do buňky ve formě ssDNA (konjugativní plazmidy nebo některé fágy), neuniká restrikci, ale stává se k nim citlivá po syntéze druhého vlákna. Fág MU – funkce MOM: konverze adeninu na A-(1acetamido)adenin, který je necitlivý k EcoKI a EcoBI. Plazmidy: Ard (alleviation of restriction) - antirestrikční protein, zmírnění restrickce Fág lambda: Ral (restriction alleviation) - antirestrikční protein - zvýšení modifikační aktivity enzymů typuAI na NM DNA Fágy T3 a T7: (proteiny Ocr = overcoming restriction) inaktivace enzymů typu I (zábrana jejich vazby na DNA) Fág P1: Dar-proteiny (defense against restriction) ? rozklad SAM Příklady antirestrikčních mechanismů a) Eliminace restrikčních míst nebo jejich velká vzdálenost od sebe b) Fág je modifikován metylázami hostitelské buňky, případně takové metylázy vytváří sám c) Fág při infekci koinjikuje do buňky proteiny, které se vážou na cílové rozpoznávací sekvence RE a tím je chrání (maskují). d) Fág vytváří protein, který imituje cílovou sekvenci, váže RE a tím ho inhibuje. e) Fágový protein navozuje aktivitu metylázy a tím urychluje obranu před RE. Peptid Stp fága T4 může inhibovat restrikci změnou struktury komplexu restriktáza-metyláza. Pasivní a aktivní strategie fágů pro únik před působením RM systémů 1. "Loss" of restriction sites. Some phage have many fewer recognition sites for certain restriction endonucleases than you would predict by random chance. For example, the phages T3 and T7 lack the 5-bp EcoRII recognition site CC(A or T)GG. This is thought to arise by selection for phage with mutations that prevent cleavage by restriction endonucleases commonly encountered in their hosts 2. Modified bases. Some phage have modified bases that prevent recognition by restriction endonucleases. For example, phages T2 and T4 have hydroxylmethylcytosine instead of cytosine in their DNA. 3. Self-methylation. Some phage encode a methylase that can modify their DNA so that it is not cleaved by certain restriction endonucleases. For example, the E. coli phages T2, T4, and the Myxococcus phage Mx8 encode dAdenine methylases (dam). Certain plasmids also encode methylases that may provide protection against restriction endonucleases 4. Activation of a host methylase. Some phage encode a protein that stimulates the host's methylase to modify the phage DNA. For example, the Lambda Ral ("restriction alleviation") protein enhances methylation by the HsdM subunit of the EcoK and EcoB restriction systems]. Ral seems to act by stimulating the expression of the host hsdS and hsdM genes 5. Degradation of host S-adensylmethionine. Some host restriction systems only recognize modified DNA (e.g. the McrA and McrB systems in E. coli). Phage T3 encodes a S-adensylmethionine hydrolase activity that degrades the substrate required for methylation by host enzymes, thus avoiding modification of the phage DNA and subsequent cleavage by modification-dependent host endonucleases 6. Inhibition of host restriction endonucleases. Many conjugal plasmids produce antirestriction proteins (called Ard) that specifically inhibit Type I restriction endonucleases. The Ard proteins have a motif that is very similar to a motif found in the HsdS subunit, thus it is possible that the Ard proteins prevent proper assembly of the restriction endonuclease complex by binding to the other Hsd subunits. Phage T3 produces a protein called Ocr which inhibits host methylases, resulting in resistance to modification-dependent restriction systems 7. DNA repair systems. Activity of certain phage genes may allow repair of the double-stranded breaks produced by restriction endonucleases. For example, the lambda Gam and Red proteins may repair the cleaved DNA by recombination with another copy of the phage DNA Ocr 0,3 Promotor genu ard Lokalizace genu ocr/0,3 na fágovém genomu Lokalizace genu ard na plazmidu Antirestrikční protein Glukozylace HMC zbytků DNA Tsudých fágů je účinnou ochranou před většinou RE – a navíc slouží k identifikaci fágové DNA, takže enzymy kódované fágy mohou selektivně degradovat hostitelský chromozom Strategie fága T4 pro překonání RM systémů a reakce E. coli Evoluce interakcí mezi T-sudými fágy a hostiteli a) Fág infikující normálního hostitele b) Fág infikuje E. coli s RM systémem, RE štěpí c) Genom fága obsahuje HMC, RE neštěpí d) Některé kmeny E. coli mají RM systém štěpící DNA s HMC e) Fág glykozyluje HMC (na glu-HMC) a jeho DNA není štěpena MDS (modif.depend. syst.) f) Některé kmeny E. coli mají RM systém (Gmr) štěpící glu-HMC, ne však neglukozylovanou g) Některé fágy (like-T4) mají gen kódující IPI, který ruší působení Gmr h) Některé kmeny E. coli mají modifikovaný Gmr (fúze GmrS-GmrD), který ruší působení IPI i) Některé mutanty fága T4 překonávají GmrS-GmrD a úspěšně infikují E. coli a Phage T4 infecting a phage-sensitive host. b Phage T4 infecting a phage-resistant E. coli cell containing a R–M system. The phage genome is cut at specific sites by the restriction enzyme. c.The genome of phage T4 contains hydroxymethylcytosine (HMC) and can also be methylated, thereby avoiding specific endonucleases. d Some bacteria have acquired modification-dependent systems that can exclusively cleave HMC-containing DNA, thus preventing infection by HMCcontaining phages. e Phage T4 acquired a resistance to MDSs through the glucosylation of HMC residues (glu–HMC). f A few E. coli strains have acquired a glucose-modified restriction (Gmr) system that targets and cleaves glu–HMC-modified phage T4 genomes, thereby blocking phage infection. This system is composed of two subunits (GmrS and GmrD) that specifically cut glu–HMC DNA but have no effect on unglucosylated DNA. g Some T4-like phages have a gene encoding internal protein I (IPI), a protein that hinders the Gmr system and allows these phages to successfully infect E. coli strains containing this system. h Some E. coli strains harbour a modified Gmr system in which a translational fusion of GmrS and GmrD is produced, rendering IPI ineffective. i Finally, phage T4 mutants can bypass the GmrS–GmrD fusion by a unknown mechanism, leading to a successful infection. a) Fág infikující normálního hostitele b) Fág infikuje E. coli s RM systémem c) Genom fága obsahuje HMC, RE neštěpí d) Některé kmeny E. coli mají RM systém štěpící DNA s HMC e) Fág glykozyluje HMC (na glu-HMC) a jeho DNA není štěpena MDS (modif.depend. syst.) f) Některé kmeny E. coli mají RM systém (Gmr) štěpící glu-HMC, ne však neglukozylovanou g) Některé fágy (like-T4) mají gen kódující IPI, který ruší působení Gmr h) Některé kmeny E. coli mají modifikovaný Gmr (fúze GmrS-GmrD), který ruší působení IPI i) Některé mutanty fága T4 překonávají GmrS-GmrD a úspěšně infikují E. coli Evoluce interakcí mezi T-sudými fágy a hostiteli 5-hydroxymetyl- cytosin The prr locus was originally described as coding a ribonuclease that is activated after phage T4 infection to cut within the anticodon of a specific tRNA, inactivating protein synthesis and thus blocking phage development. glykozylace hmC SYSTÉMY METYLACE DNA (E. COLI K12) 1. Systém Dam (dam-metyláza) metylace A v GATC (donor met = SAM) GATC - regulační funkce: počátek replikace, promotory, reparace, transpozice sekvence GATC je rozpoznávána 15% RE typu II, je přítomna u 50% všech 4N-RM-systémů, není však cílovou sekvencí pro restriktázy v žádném z druhů enterobaktérií. 2. DNA cytozin metylační - Dcm (E. coli K12) metylace cytozinu na C5 v sekvenci CC(A/T)GG (?funkce při reparaci na velmi krátké vzdálenosti) - V buňkách není přítomna RE rozpoznávající metylovanou sekvenci – nejedná se tudíž o standardní RM systém VÝSKYT RM SYSTÉMU U ENTEROBAKTERIÍ (3 DRUHY) 30% kmenů (z 1000 studovaných) obsahuje RM systém u 170 RM systémů bylo zjištěno jen 33 různých cílových sekvencí nebyly zjištěny RM systémy rozpoznávající 4 bpmísta (včetně GATC) – účast na regulacích VÝZNAM RESTRIKCE Ochrana integrity vlastní DNA obrana před bakteriofágy (typ II) …dočasné působení –epigenetické změny, na úrovni populace nutná obměna Systém napomáhající rekombinaci cizorodé DNA (typ I) štěpení DNA (náhodně) mimo rozpoznávací sekvenci umožní rekombinaci mnoha genů - analýza přenosu genů transdukcí a konjugací podporuje vliv RM systémů při vzniku mozaikových genomů (E. coli) ? „Selfish DNA“ molekulární paraziti bakterií. RM systémy typu II se udržují prostřednictvím plazmidů, které je kódují (usmrcení bezplazmidových buněk) RM systémy jako mechanismus postsegregačního zabíjení restriktáza metyláza "immigration control region" Gen hsdS může být nahrazen genem hsdS z jiného RM systému stejné třídy, nebo geny mohou vzájemně rekombinovat Odlišný obsah GC – indicie přenosu HGT VYUŽITÍ RM SYSTÉMŮ V EUKARYOTICKÝCH BUŇKÁCH Transgenní linie myších buněk exprimující geny RM systémů 1. přenos a exprese genu M.PaeR7 (Pseudomonas aeruginosa) - metyláza CTCGmeAG 2. přenos a exprese genu R.PaeR7 - endonukleáza (restriktáza) 3. infekce buněk HSV1 adenoviry - očekávaná rezistence buněk - vytvoření organizmu rezistentního k virům (nebo jen určitých tkání) Další možnost: studium vlivu metylace na genovou expresi Typ II: Lokusy CRISPR a proteiny Cas zasahují a sekvenčně-specificky štěpí vstupující DNA (fág, plazmid). Proces probíhá ve třech krocích: - Adaptace (imunizace): získání (začlenění) spacerů (mezerníků) - Biogeneze CRISPR RNA (crRNA), přepisované z oblasti, kde se nachází sestava opakujících se CRISPRů - Interference: štěpení vstupující DNA Působení CRISPR-Cas (3 hlavní typy, několik podtypů) Fungování systému CRISPR-Cas Přímá opakování lokusu CRISPR jsou oddělena krátkými úseky nerepetitivní DNA nazývanými spacery, které jsou získávány ze vstupující DNA (plazmid nebo fág) procesem zvaným adaptace. Během tohoto kroku je tato sekvence také duplikována. Lokus CRISPR je transkribován jako dlouhá primární pre-crRNA, která je upravena za tvorby sady krátkých crRNA (proces nazývaná biogeneze crRNA). Každá crRNA obsahuje segment opakující se sekvence a celý spacer,a ve spojení s proteiny Cas vytváří komplexy CRISPR-Cas. Tyto komplexy působí jako hlídka při sledování vstupu fága nebo plazmidu, který obsahuje DNA komplementární k crRNA, a současně zajišťují imunitu proti těmto elementům. V případě rozpoznání fága nebo plazmidu nesoucího takovou komplementární cílovou sekvenci DNA tuto sekvenci specificky štěpí (proces označovaný jako interference). Nukleotidová sekvence spaceru musí být identická se sekvencí fágového genomu nebo plazmidu (tyto sekvence se označují jako protospacery), aby došlo k zablokování replikace těchto elementů. U systémů CRISPR-Cas typu I a II je pro začlenění spaceru a interferenci vyžadována sekvence s konzervativním motivem sousedící s protospacerem označovaná jako „protospacer-adjacent motif – PAM). Mechanismus působení systému CRISPR-Cas Obrana buněk proti cizorodé DNA prostřednictvím systému CRISPR-Cas Typické uspořádání CRISPR. Série opakujících se sekvencí přerušených zhruba stejně velkými mezerníky sn až s1 s odlišnými sekvencemi. Vedoucí sekvence (leader) obsahuje promotor (p), z něhož je CRISPR transkribován. Geny cas přidružené k CRISPR kódují produkty, které zprostředkují přijetí sekvencí (fága) a cíleně rozpoznávají sekvence prekurzoru mezerníku (protospaceru). Mezerníky (spacery) nejblíž vedoucí sekvence jsou ty, které byly přijaty jako poslední. 2. Prekurzor mezerníku (protospacer) (psn) z fága nebo plazmidu vyznačující se stejnou sekvencí jakou má některý z mezerníků (spacerů) (sn) v CRISPR. V sousedství prekurzoru mezerníku (protospaceru) se nachází sekvence PAM (protospaceradjacent motif), která identifikuje protospacer jako sekvenci, která má být CRISPRem přijata. B. Adaptivní fáze – vyčlenění sekvence prekurzoru mezerníku (protospaceru) Jeden nebo více Cas proteinů rozpozná sekvenci PAM na vstupující fágové DNA a začlení přilehlou sekvenci psn jako nový mezerník sn do CRISPRové oblasti, na její konec nejblíže vedoucí sekvence. Všechny ostatní CRISPRy se posunou doprava, přičemž ten poslední vpravo je odstraněn. Imunitní fáze: Zacílení vstupující protospacerové sekvence prekurzoru mezerníku na fágové DNA. Sestava CRISPRů je přepsána do jedné dlouhé molekuly RNA, která je štěpena v repetitivních sekvencích za vzniku molekul „guide“ CRISPR RNA, z nichž každá obsahuje sekvenci jednoho mezerníku. Když buňku infikuje stejný typ fága, dojde k párování crRNA obsahujcící sekvencí sn s identickou sekvencí prekurzoru mezerníku (protospaceru) psn ve vstupující fágové DNA a jeden nebo více Cas proteinů v ní štěpí protospacery, čímž fága inaktivují.Šíření CRISPR – transformace, transdukce a) Mutace ve fágových protospacerech nebo v sekvencích PAM navozují rezistenci k interferenci, neboť není splněn požadavek na komplementaritu mezi crRNA a cílovou DNA. b) Anti-CRISPR systém u lyzogenů Pseudomonas aeruginosa. Fágem kódovaný anti-CRISPR protein blokuje interferenci zabráněním vytvoření nebo působením komplexů CRISPR-Cas. ? Tento protein může být zabalen do kapsidy a pak koinjikován při následné infekci, nebo může být vytvářen bezprostředně po injekci DNA do buňky. c) Systém CRISPR-Cas u fágů Vibrio cholerae. Po vstupu fágové DNA do buňky jsou exprimovány virové crRNA a cílí na dosud necharakterizovaný antifágový systém V. cholerae. Tento systém je lokalizován v lokusu podobajícímu se fágem indukovatelnému chromozomovému ostrovu (PICI), označovanému jako PICI-like element (PLE). Spacery ve fágovém CRISPR lokusu jsou komplementární k sekvenci PLE, a působení mechanismu CRISPR je schopno specificky zacílit na tento genetický element a inaktivovat ho. Strategie fágů k překonání systémů CRISPR-Cas Geny pro R a M bývají blízko sebe, ale ne v transkripčních jednotkách Konzervativní motiv