Transformace kompetentních buněk E. coli
Příprava kompetentních buněk pro transformaci
Jako recipientních kmenů pro Honování cizorodé DNA se nejčastěji využívá kmenů E. coli, které byly mutacemi a metodami genového inženýrství upraveny tak, aby byly schopny s vysokou účinností přijímat externí DNA (většinou plazmidovou), umožňovaly její replikaci a udržovaly její původní strukturu (tj. nezpůsobovaly vystepování nakloňované DNA) a dovolovaly selekci rekombinantních plazmidů. Podrobná charakteristika těchto kmenů (zejména jejich genotyp) bývá uváděna v katalozích firem a praktických příručkách. Vlastní navození kompetence spočívá v pomnožení buněk příslušného kmene E. coli v tekutém živném mediu (např. LB bujónu) do exponenciální fáze růstu, převedení buněk do roztoku CaCb, v němž se buňky ponechají několik hodin, během nichž dojde k jejich vyhladovění a určitým změnám v buněčné stěně, umožňujícím přijmout externí DNA. Takto připravené buňky lze použít buď bezprostředně, nebo se převedou do roztoku CaCh s přídavkem glycerolu, v němž je možné buňky zamrazit na -70°C a použít později (takto připravené buňky lze uchovávat několik měsíců nebo i déle).
Organismy: Bakteriální kmenis. coli TOP10F'
Materiál: LB bujón, sterilní roztok 0,05 M CaCb, sterilní centrifugační zkumavky, kolorimetr s příslušenstvím, chlazená centrifuga, rotor 6x50 ml
Postup:
1. 20 ml LB bujónu v Erlenmayerově baňce naočkujeme 2 ml bujónové kultury (18 hod/37°C) a inkubujeme při 37°C na vodní třepací lázni do hustoty suspenze ODeoo=0,3.
2. Buněčnou kulturu vytemperujeme na 0°C v ledové vodní lázni a centrifugujeme 10 min/3000 ot při 4°C. Od této chvíle nesmí teplota překročit 4°C!
3. Sediment buněk resuspendujeme v polovině objemu ledového roztoku CaCb a ponecháme v lednici při 4°C přes noc.
4. Buňky zcentrifugujeme jako v bodě 2) a sediment resuspendujeme ve 2 ml (obecně v 1/10 výchozího objemu kultury) roztoku CaCb.
5. Takto připravené kompetentní buňky lze používat přibližně jeden týden. Pro dlouhodobé uchovávání se k buněčné suspenzi přidá 1/10 objemu sterilního glycerolu (4°C!) a suspenze se zmrazí na -70°C.
1
Transformace kompetentních buněk E. coli rekombinantní DNA Organismy: kompetentní buňky E. coli TOP10F'
DNA: vektor pBluescript SK-, vektor s inzertem pBluescript + hsp60 5.4
Materiál: ligační směs z úlohy 4, TE pufr, LB bujón, LB agar, ampicilin (roztok 100 mg/ml),
IPTG (roztok 0,1 M), X-gal (roztok 20 mg/ml v dimethylformamidu), Petriho misky, sterilní
hokejky
Postup:
1. Do mikrozkumavky se napipetuje 200 ul kompetentních buněk. (V případě, že se používají buňky zmrazené na -70°C, nechají se pozvolna rozmrznout při pokojové teplotě.)
2. Zkumavka se umístí do ledové lázně.
3. Přidá se DNA (obvykle se 1-5 ul ligační směsi smíchá s TE pufrem do celkového objemu 10 ul, který se pak přidá ke kompetentním buňkám). Jako kontrolu provádíme vždy transformaci s (i) vektorem bez inzertu, (ii) vektorem s inzertem a (iii) bez DNA (výsev samotných kompetentních buněk na selekční médium).
4. Lehce se promíchá a ponechá v ledové lázni 30 minut.
5. Buňky se podrobí tepelnému šoku ponořením zkumavky na 1 min do vodné lázně 42°C, nebo 3 min /37°C.
6. Zkumavka se přenese do ledové lázně a přidá se 1 ml LB bujónu.
7. Následuje inkubace 1 hod při 37°C na vodní třepací lázni (exprese genů umožňujících růst na selekčním médiu).
8. Buňky se zcentrifugují 3 min při 6000 ot/min.
9. Supernatant se sleje - většinou však zůstane ve zkumavce asi 100 ul supernatantu, ve kterém lze buňky resuspendovat.
10. Suspenze se vyseje pomocí bakteriologické hokejky na agarové plotny (LB agar, obsahující 100 ug ampicilinu /ml). Pokud se použijí plotny obsahující navíc X-gal (40 ug/ml) a IPTG (20 mM), lze přímo odlišit podle zbarvení kolonie obsahující rekombinantní nebo nerekombinantní plazmid.
11. Plotny se inkubují 24-48 hod při 37°C.
Poznámky:
1. Účinnost transformace kolísá v závislosti na použitém kmeni E. coli, na pracovním postupu při přípravě kompetentních buněk a na koncentraci DNA použité k transformaci. Platí, že nejvyšší účinnosti transformace se dosáhne při použití velmi nízkých koncentrací DNA, nepřesahujících 10 ng/jednu transformační směs (optimální kone. je pod 1 ng DNA).
2. Je vhodné sledovat nárůst kolonií na plotnách: někdy se stává, že v okolí transformantů se postupně objevují, dorůstají) drobné kolonie, které nejsou transformanty a nejsou tudíž rezistentní k ampicilinu: rostou v okolí rezistentních kolonií, které ampicilin rozkládají.
3. Vyrostlé kolonie je vhodné přepasážovat na čisté plotny a založit klony z jednotlivých nově vyrostlých kolonií.
2