Detekce autofagie pomocí průtokové cytometrie
Jana Moudrá
Ústav experimentální biologie,
Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Autofagie
• Katabolická dráha, která degraduje makromolekuly a organely uvnitř lyzozomů
• Mechanizmus k udržení buněčné homeostázy
• Adaptační mechanismus nutný k přežívání za nepříznivých
podmínek, extracelulárních (nedostatek živin, hypoxie, vysoká teplota) i intracelulárních (nahromadění poškozených nebo nadbytečných organel)
• Podílí se na různých fyziologických i patologických procesech
Typy autofagie
Makroautofagie - fúze autofagozomu s lyzozomem
Mikroautofagie - uzavření degradovaného materiálu vychlípením lyzozomální membrány
Autofagie zprostředkovaná chaperony - bílkoviny určené k rozkladu obsahují specifický motiv, který je směřuje do lyzozomů
http://casopis.vesmir.cz/clanek/autofagie-ve-vztahu-k-nemoci
Molekulární mechanismy autofagie
• Indukována po buněčném vyhladovění nebo po aplikaci rapamycinu Vznik, zrání a recyklace autofagozomů - regulace proteiny ATG, regulovány
Ser/Thr kinázou mTOR (mammalian target of rapamycin)
V případě, že zásoby živin jsou dostačující, signální dráha mTOR fosforyluje určité ATG proteiny, čímž inhibuje formaci fagoforu
Upraveno podle: http://www.naturexom.ezproxy.munixz/nrd/journal/v6/n4/fig_tab/nrd2272_F3.html
Detekce autofagie pomocí průtokové cytometrie
• Měří a analyzuje několik fyzikálních vlastností jednotlivých buněk současně
• Umožňuje hodnocení autofagické aktivity jak ve fixovaných, tak i v živých buňkách a organismech
Dokáže měřit velké množství vzorků
Většina detekčních metod se spoléhá na měření hladiny proteinů LC3 exprimovaných na autofagozomech
LC3 protein
LC3 nebo MAP1LC3 (Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3) patří
do genové rodiny Atg8 proteinů.
• LC3 konjuguje s fosfatidylethanolaminem, který je součástí fosfolipidové dvojvrstvy autofagozomu
• Degradace LC3 značeného fluorochromem (např. GFP-LC3)
v autolyzozomu může být využita k měření autofagické aktivity
->měření poklesu fluorescence průtokovou cytometrií
Starvation
B.
c o
59
b
o
Q-
Fluorescence Intensity
CD
c
CT O
_o
-C
U
Fluorescence Intensity
oo	GFP-LC3-I	J8	
•OO	GFP-LC3-II mCherry-GFP-LC3-I		Autolysosome
•OOt	mCherry-GFP-LC3-II	o	Autophagosome
			Lysosome
VyuzitiGFPk monitoroväni autofagicke aktivity
LC3-I - cytozolovä forma LC3-II - forma asociovanä s autofagozomem
Inkubace s inhibitory lyzozomovych proteäz (Chloroquine)
RFP (mCherry) - mene citlivy na pH
Fluorescence Intensity mCherry
Demishtein, A., Porat,Z., Elazar, Z., and Shvets, E. (2015). Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods 75. 87-95.
Zobrazovací průtoková cytometrie
Kombinace FC a fluorescenční mikroskopie s analýzou obrazu ImageStream - zobrazovací průtokový cytometr
• Umožňuje analyzovat velké množtví buněk (až 5000/s)
• Umožňuje statistické hodnocení na základě morfometrických parametrů BDI (bright detail intensity)
BDS (bright detail similarity)
Control
BafA
100      200      300      400 500
Area
	LC3                     p62 LC3/p62
	
m ... k-	
mm	LC3                     p62 LC3/p62 •          * •
	
	* *
Control
BF 0	GFP-LC3 GFP-LC3/BF
• ••lOunt	9
Bright Detail Similarity
Demishtein, A., Porat,Z., Elazar, Z., and Shvets, E. (2015). Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods 75. 87-95.
Přednosti dektekce autofagie pomocí průtokové cytometrie
• Možnost sledování autofagie v živých buňkách a organismech
• Analýza obrovského množství vzorků
• Adekvátní morfologická analýza pomocí zobrazovací průtokové cytometrie
• Negativa: Nutnost použití ektopicky exprimovaného proteinu
"=>Rostoucí počet detekčních metod autofagie pomocí průtokové cytometrie
Děkuji za pozornost