Jméno:                                                 Datum:

PROTOKOL TRANSFEKCE

A. TRANSFEKCE POMOCÍ PEI, LIPOFECTAMINU a FUGENE

Postup 2 dny předem: Uvolníme buňky HEK293 pomocí TRYPSIN/EDTA (viz níže), vysejeme je na 2 ml
misky tak, aby druhý den dosáhly cca 50 % konfluence.



Postup den předem: Smícháme transfekční činidlo - PEI/Lipofectamin/Fugene - s DMEM (65 ul) mediem
bez séra a dalších suplementů, zvortexujeme, centrifugujeme a necháme 10 min stát v RT. Mezitím si
nachystáme DNA s DMEM (65 ul, opět bez suplementů) do jednotlivých zkumavek. Přidáme směs
transfekčního činidla s DMEM k DNA. Důkladně zvortexujeme a necháme dalších 10 min stát v RT, aby
činidlo a DNA vytvořilo komplexy. Pak celou dávku přidáme k nachystané buněčné kultuře (2 ml). Po 4
hodinách, kdy se komplexy dostávají do buněk, se vymění médium za čerstvé (PEI, Lipofectamin).
Kultivace 24 hodin v 37°C/5% CO[2] v inkubátoru.


                                                                PEI pH7,0

                                                                                                                    LIPOFECTAMIN

                                                                                                                                   FUGENE

                                              Medium

                                                                                                              130 ul

                                                                                                                       130 ul

                                                                                                                                   130 ul

                                        Transfekční činidlo

                                                                                                              7,5 ul

                                                                                                                       7,5 ul

                                                                                                                                   7,5 ul

                                          DNA (pMax GFP)

                                                                                                              2,5 ug

                                                                                                                       2,5 ug

                                                                                                                                   2,5 ug

                                   Poměr transfekční činidlo:DNA

                                                                                                                3:1

                                                                                                                         3:1

                                                                                                                                     3:1

SS plazmidu pmax GFP (amaxa): 1,1 ug/ul

Spočítej kolik ul plazmidu bylo přidáno do reakce:


            B. NUKLEOFEKCE POMOCÍ PŘÍSTROJE NEON

Postup den předem: Uvolníme buňky pomocí TRYPSIN/EDTA (viz níže). Buňky spočítáme a opláchneme
v PBS. 1x10^6 buněk resuspendujeme v 100 ul „Resuspension buffer R“. Před vlastní elektroporací si
připravíme misku s růstovým médiem a FBS, do které elektroporované buňky finálně přeneseme (2 ml).
Naplníme elektroporační trubici 3 ml „Electrolytic buffer E“. Nastavíme vhodnou kombinaci pro
eletroporaci (1150 V/
20 ms/1pulz). Přeneseme 2,5 ug DNA do sterilní zkumavky a přidáme k ní buněčnou suspenzi   a jemně
zamícháme. Nasajeme suspenzi buněk a DNA do elektroporační jehly. Vložíme elektroporační pipetu do
elektroporátoru a necháme proběhnout elektroporaci. Následně buňky „vypustíme“ do předehřátého
media bez antibiotik. Kultivace 24 hodin v 37°C/5% CO[2] v inkubátoru.


Postup aktuálně:

1. Pomocí fluorescenčního mikroskopu odhadni účinnost transfekce vzorků (v  %):

                                             1. FUGENE

                                                                                                    2. NEON

                                                                                                           3. PEI

                                                                                                             4. LIPOFECTAMIN







2. Uvolnění buněk pomocí TRYPSIN/EDTA: Do připravené zkumavky přenes 750 ul media z kultury. Zbytek
přenes do odpadu. Opláchni misku 2 ml PBS, přidej 500 ul TRYPSIN/
EDTA, inkubuj 3-5´ v 37 °C, přenes uvolněné buňky do zkumavky s mediem, důkladně rozsuspenduj.


3. Pomocí průtokového cytometru Accuri C6 urči procento GFP pozitivních buněk.


4.  Ze všech výsledků doplň tabulku a urči pořadí efektivity transfekce:

Transfekční činidlo

                        Odhad  %

                        GFP+ buněk

                                                                             % GFP+ buněk

                                                                               (accuri)

                                                                                                Pořadí efektivity

1.      Fugene




2.      Neon nukleofekce




3.      PEI




4.      Lipofectamin





Výsledky:



2


1 fug




4


3





 4


3


Závěr: