Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Oddělení fyziologie a imunologie živočichů jipro@sci.muni.cz TRANSFEKCE Izolace DNA TRANSFEKCE * Přenos cizorodé DNA pomocí vektorů * Vektory - molekuly DNA do nichž je včleněn gen zájmu * Nejčastěji se používají plazmidy - malé bakteriální kruhové molekuly DNA * SiRNA (in vitro i in vivo) 00192l http://2009.igem.org/wiki/images/1/17/HD09_p31.png TRANSFEKTANTI * Cílem je vnesení cizorodé DNA do jádra eukaryotických buněk * Transfektanti – buňky obsahující cizorodou DNA –Stabilní tranfektanti: cizorodá DNA se včlenila do buněčného genomu –Tranzientní transfektanti: cizorodá DNA není integrovaná do genomu, geny v plazmidu jsou přepisovány jen po omezenou dobu cca 24 až 96 hodin https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/ProteinExpressionAnalysis/Im ages/0714/sho-transfection.jpg https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/ProteinExpressionAnalysis/Im ages/0714/sho-transfection.jpg DŮLEŽITÉ PARAMETRY * Pro transfekci je vhodná 40 – 80 % konfluence buněk –Málo buněk – bb nejsou v kontaktu a rostou špatně –Mnoho buněk – kontaktní inhibice, zastavení v G0 vede k rezistenci k průniku DNA i jiných makromolekul * DNA proniká lépe do aktivně se dělících buněk než do G0 –V průběhu mitózy dochází k rozložení jaderné membrány, což umožní průnik DNA do jádra * U primárních kultur je kritické číslo pasáže * Snaha o co nejnižší pasáž i u stabilních linií (<50) * V sadě experimentů by se číslo pasáže nemělo příliš lišit –U imortalizovaných linií se mění charakteristika buněk v průběhu času a proto je možné že nereagují stejně i když se transfekce provádí při stejných podmínkách Confluency and Growth Phase Cells should be transfected at 40–80% confluency (cell type dependent) – Too few cells cause cell cultures to grow poorly without cell-to-cell contact – Too many cells result in contact inhibition, making cells resistant to uptake of DNA and other macromolecules Actively dividing cells take up DNA better than quiescent cells (breakdown and perforation of the nuclear membrane during mitosis enable nuclear delivery) Number of Passages for Primary Cells The number of passages should be low (<50) The number of passages for cells used in a variety of experiments should be consistent Cell characteristics can change over time with immortalized cell lines and cells may not respond to the same transfection conditions Cells may not respond to the same transfection conditions after repeated passages Stabilní transfektanti •Inkorporace plazmidové DNA nesoucí gen zájmu do genomu tak, aby nebyla umlčena, byla správně zařazená do čtecího rámce a rychle překládaná •Nutný selekční marker (rezistence k antibiotiku) – buď ve stejném plazmidu nebo transfekce dvou plazmidů zaráz (5:1 ve prospěch genu zájmu) • •Postup: 1.Elektroporace genu zájmu a selekčního markeru 2.48 h inkubace v médiu bez selekčního ATB 3.Pasážování naředěných buněk (1:100, 1:500) do média se selekčním ATB – výměna po 3 dnech (do 10 dnů by měly zahynout buňky bez inkorporovaného selekčního markeru) 4.Za 2 – 5 týdnů se objeví ostrůvky rezistentních buněk 5.Vypíchnutí těchto dobře rostoucích kolonií a jejich další kultivace v médiu s ATB 6.Naředit rezistentní buňky tak, aby byla 1 b. na 100 ul média a rozpipetovat je do 96 jamkové desky. Ujistit se, že není v jamce více jak jedna buňka. Pod tlakem ATB vybrat nejlépe rostoucí kolonii. 7. • • Výsledek obrázku pro stabile transfection protocol NEJČASTĚJŠÍ METODY TRANSFEKCE * Směs negativně nabitého Ca(H2PO4)2 a pozitivně nabitého CaCl2 tvoří precipitát, do kterého se naváže DNA * Kationické polymery DEAE-dextran, polyetylenimin (PEI) – negativně nabitá DNA se naváže na polykation a endocytózou se přenese do buněk * Liposomy (lipofectamin) – DNA je obalena lipidovou kapsulkou, která může fúzovat s membránou * Fugene – neznámé složení neliposomálního typu, etanol * Elektroporace – vytvoření pórů (Neon) • •Krevní buňky je možné transfekovat jen elektroporací •VÁPENATÉ IONTY http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf * Smíchání DNA s CaCl2 * Přidání směsi do roztoku Ca(H2PO4)2 * Tvorba precipitátu, který se přidá k bb * Pohlcení precipitátu endocytózou nebo fagocytózou PEI * Kationické polymery jsou hydrofilické, a proto jsou rozpustné ve vodě * Jsou schopné velmi efektivně kondenzovat DNA (záporný náboj) * Komplexy DNA/PEI musí být malé (< 100 nm) * Internalizace endocytózou * Akumulace v endosomecha a lyzosomech kolem jádra * Jen malé množství komplexů z těchto organel unikne a dostane se do jádra Cationic polymers differ from cationic lipids in that they do not contain a hydrophobic moiety and are completely soluble in water. Given their polymeric nature, cationic polymers can be synthesized in different lengths, with different geometry (linear versus branched). The most striking difference between cationic lipids and cationic polymers is the ability of the cationic polymers to more efficiently condense DNA. There are three general types of cationic polymers used in transfections: Linear (histone, spermine, and polylysine) Branched Spherical Cationic polymers include polyethyleneimine (PEI) and dendrimers www.nano-lifescience.com http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html LIPOFEKCE http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf Cationic Lipids: Liposomes/Lipoplexes Cationic lipids are amphiphilic molecules that have a positively charged polar head group linked, via an anchor, to an apolar hydrophobic domain generally comprising two alkyl chains Structural variations in the hydrophobic domain of cationic lipids include the length and the degree of non-saturation of the alkyl chains Electrostatic interactions between the positive charges of the cationic lipid head groups and the negatively charged phosphates of the DNA backbone are the main forces that allow DNA to spontaneously associate with cationic lipids Cationic Lipids: Liposomes/Lipoplexes Cationic lipids are amphiphilic molecules that have a positively charged polar head group linked, via an anchor, to an apolar hydrophobic domain generally comprising two alkyl chains Structural variations in the hydrophobic domain of cationic lipids include the length and the degree of non-saturation of the alkyl chains Electrostatic interactions between the positive charges of the cationic lipid head groups and the negatively charged phosphates of the DNA backbone are the main forces that allow DNA to spontaneously associate with cationic lipids * Kationické lipidy – liposomy/lipoplexy (Lipofectamin) * Jsou to amfifilické molekuly s kladně nabitou polární částí, která je spojena s nepolární hydrofobickou doménou * Elektrostatické interakce mezi kladnou částí a negativně nabitou DNA vede k tvorbě komplexů pohlcených endocytózou ELEKTROPORACE * Vystavení buněk elektrickému poli vede ke zvýšení permeabilizace membrány * Směs buněk a plazmidu v pufru se v kyvetě vloží do elektroporátoru * Podmínky –proud kV/cm –délka pulsu um-ms * http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf Electroporation exposes a cell to a high-intensity electric field that temporarily destabilizes the membrane. 2 During this time the membrane is highly permeable to exogenous molecules present in the surrounding media. 3 DNA then moves into the cell through these holes. 4 When the field is turned off, the pores in the membrane reseal, enclosing the DNA inside ELEKTROPORACE - NUKLEOFEKCE https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/prodImages/high/TransfectSystKit.JPG * Kombinace elektroporace a dalších činidel (Resuspension buffer R/T) pro zvýšení účinnosti transfekce • * Elektrickým pulzem se naruší i jaderná membrána a plazmid se dostane přímo do jádra buněk – vysoká efektivita https://www.youtube.com/watch?v=q-4X_eTtX8o MÉNĚ ČASTÉ METODY * Magnetické kuličky –Paramagnetické kuličky pokryté vektorovou DNA jsou pomocí magnetu vneseny do buněk * Balistické technologie (gene gun/bioballistic=biolistic) –Částečky zlata s navázaným genem se vstřelí do buněk * Mikroinjekce –Skleněnou pipetou je vnesen roztok s DNA propíchnutím membrány (mikromanipulátory) * Laserfekce/optoinjekce –Pomocí objektivou s vysokou aperturou je světlo zaostřeno na bod (cca 1 um v průměru) po setinu sekundy, čímž se naruší cytoplazmatická membrána * * Metody založené na použití virů (infekce) * PEI –+ cena/efektivita –- nutnost výměny média (toxicita) * Lipofectamine –+ efektivita –- nutnost výměny média, cena * NEON –+ efektivita, není nutno měnit médium, použití na krevní buňky –- cena * Fugene –+ efektivita, není nutno měnit médium –- cena – –Rozhodující je poměr efektivita : cena * * PLUSY A MÍNUSY Advantages of Lipids Deliver nucleic acids to cells in a culture dish with high efficiency Easy to use, minimal steps required; adaptable to high-throughput systems Using a highly active lipid will reduce the cost of lipid and nucleic acid, and achieve effective results Disadvantage of Lipids Not applicable to all cell types Advantages of Calcium Phosphate Inexpensive High efficiency (cell type dependent) Can be applied to a wide range of cell types Can be used for transient and stable transfection Disadvantages of Calcium Phosphate Reagent consistency is critical for reproducibility Small pH changes (±0.1) can compromise transformation efficiency Size and quality of the precipitate are crucial to the success of transfection Calcium phosphate precipitation does not work in RPMI, due to the high concentration of phosphate within the medium Advantages of Electroporation Nonchemical method that doesn’t seem to alter the biological structure or function of the target cells Easy to perform High efficiency Can be applied to a wide range of cell types Disadvantage of Electroporation Cell mortality (if using suboptimal conditions) MOŽNOSTI VYUŽITÍ TRANSFEKCE •Transfekcí je možné ovlivnit * Molekulární mechanizmy zahrnuté v kontrole buněčné proliferace, diferenciace, přežití/smrti * změnu buněčného fenotypu a mezibuněčné komunikace * Uvedené procesy hrají úlohu ve vývoji nádorových onemocnění a mohou být potencionálně využity v protinádorové terapii. • •Transfekcí můžeme vnést do buněk také * Reportérový plazmid (bGAL, LUC, CAT…) * Expresní plazmid (konjugát proteinu a fluorescenčního proteinu – GFP, YFP, mCherry…) * SiRNA (cílený knock-out genů) Experiment * Transfekce buněk různými transfekčními činidly: –PEI –Lipofectamin –Fugene –Nukleofekce Neonem – – * Vektor: konstrukt s GFP (koncentrace 1,1 ug/ul) • * Hodnocení účinnosti –Odhad pomocí fluorescenčního mikroskopu –Kvantifikace pomocí průtokového cytometru • Vektor pMaxGFP (AMAXA) * GFP izolovaný z planktonového korýše Pontellina Plumata Promotor z cytomegaloviru Protein zájmu polyA konec z SV40 viru Gen pro rezistenci Počátek replikace Postup experimentu * Transfekce provedena 24 předem * * Odhad účinnosti transfekce pomocí fluorescenčního mikroskopu • * Uvolnění bb z povrchu misek – trypsin/EDTA 5 min/37°C * * Suspenze buněk hodnocena kvantitativně pomocí průtokového cytometru Accuri, kanál FL1 * * Srovnání výsledků • * ODHAD ÚČINNOSTI TRANSFEKCE GFP F:\vyuka 2017\cvika\A\1 fugene.jpg 1. FUGENE 2. NEON F:\vyuka 2017\cvika\A\2 neon.jpg 3. PEI F:\vyuka 2017\cvika\A\3 PEI.jpg 4. Lipofectamine F:\vyuka 2017\cvika\A\4.lipofectamin.jpg KVANTITATIVNÍ VYHODNOCENÍ ÚČINNOSTI • Měření zelené fluorescence GFP proteinu (kanál F1) průtokovým cytometrem Accuri C6 File:HD09 GFP positive HeLa Jet.png SHRNUTÍ ANd9GcQ8EuJf29f8HmS098egyIsR6VAaN3d8W_Kuca5vrxtlko6cf9ZM http://imgur.com/gallery/MaR3ubp • video návod on line https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4.video ke stažení https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4 IZOLACE DNA POMOCÍ KOLONKOVÉHO KITU \\ha-bay.ics.muni.cz\homes prihlasovaci jmeno je> UCN\uco (VCETNE UCN\) * Plazmidy (i jinou nízkomolekulární DNA) je možné množit pomocí kompetentních bakterií a následně izolovat pomocí kolonkových kitů (mini-, midi- a maxiprep) * * Heat shock kompetentních bakterií E. Coli plazmidem zájmu * Růst bakterií na selekční půdě (antibiotikum) * Izolace rezistentní kolonie a její namnožení v selekčním LB médiu * Izolace nízkomolekulární DNA pomocí kolonkového kitu: * Lyzace bakteriálního peletu a RNA * Precipitace proteinů a genomové DNA * Přenos supernatantu na kolonu a vazba plazmidu na pryskyřičných kuliček (promytí) * Eluce plazmidové DNA a její přečištění – * * * STRUČNÝ POSTUP IZOLACE DNA KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE •Vyšší rozlišovací schopnost daná detekcí •světla pouze z ohniskové roviny confocal1figure2 http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html Princip fluorescence • Ozáření fluorochromu zářením příslušné vlnové délky vede k excitaci molekul na orbital s vyšší energií a návrat do původní energetické roviny je doprovázen vyzářením energie ve formě fotonů. • Vyzářené (emitované) světlo má vždy delší vlnovou délku než exitační paprsek (Stokesův posun). Skenovací (rastrovací) konfokální mikroskop http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html confocal1figure1 Rotující (Nipkowův) disk http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html Rozdíl mezi fluorescenční a konfokální mikroskopií Příprava vzorku > Objective Immersion Coverslip Slide Mounting media n=1.33 n=1.515 n=1.33 n=1.515 n=1.515 n=1.473 n=1 Výhody konfokální mikroskopie * Zabrání zkreslení (rozmazání) obrazu vlivem paprsků přicházejících z roviny nad a pod rovinou ostrosti * Umožňuje zhotovení 3D obrazů (kromě x a y používá osu z) z více rovin ostrosti * Použití Nipkowova disku zrychluje snímání až na 60 snímků za sekundu * Vhodné pro zkoumání topologie organel * Krátkodobý osvit snižuje blednutí vzorku