J. Hofmanová
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
Biofyzikální ústav AV ČR, Brno
hofmanova@ibp.cz
Základy - buněčné kultury, cytokinetika
http://www.ibp.cz/cs/oddeleni/cytokinetika/informace-o-oddeleni
těsná spolupráce s Odd. fyziologie a imunologie živočichů ÚEB, PřF MU
ODDĚLENÍ CYTOKINETIKY
VĚDECKÉ ZAMĚŘENÍ
Molekulární mechanismy zahrnuté v kontrole
buněčné proliferace, diferenciace, přežití/smrti
změny buněčného fenotypu a mezibuněčné
komunikace, které hrají úlohu ve vývoji nádorových
onemocnění a mohou být využity v protinádorové
terapii.
OKRUHY VÝZKUMU
Úloha lipidů a jejich metabolismu v rozvoji
nádorového onemocnění kolonu
Mechanismy působení dietetických mastných kyselin
(n-3 PUFAs, butyrát)
Působení protinádorových léčiv (platinové deriváty
v interakci s cytokinem TRAIL)
Role růstových faktorů v signalizaci nádorových
buněk prostaty (TGF beta, EMT, senescence), vliv
nádorového mikroprostředí
Molekulární a buněčné mechanismy toxicity
organických látek (PAHs, PCB, interakce
s dietetickými lipidy)
PŘENÁŠKY
A CVIČENÍ ZAJIŠŤOVANÉ ODD. CYTOKINETIKY
(Odd. fyziologie a imunologie živočichů, ÚEB, PřF MU)
Fyziologie buněčných systémů (Bi7070), prof. A.
Kozubík
Mechanismy karcinogeneze (Bi 8110),
prof. J. Hofmanová
Zdravotní rizika (Bi3871), prof. J. Hofmanová
Molekulární fyziologie živočichů (Bi651)
Mechanizmy buněčné smrti, význam, metody
– RNDr. Alena Hyršlová, Ph.D. (Bi8870)
Analytická cytometrie – Mgr. K. Souček, PhD.
(Bi9393)
Aplikovaná chemie a biochemie – Doc. Vondráček
(Bi5599)
TKÁŇOVÉ (BUNĚČNÉ) KULTURY IN VITRO
živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd.
Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání např. hlodavců
jako je myš, krysa, křeček nebo opic, člověka)
PRIMÁRNÍ KULTURY – buňky získané přímo z živočišných tkání,
kousek tkáně, nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění
nežádoucích částí, omezená doba kultivace, specifické požadavky
BUNĚČNÉ LINIE – adaptované na dlouhodobý růst in vitro
diploidní – karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly
izolovány většinou omezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený
tzv. “life-span”)
heteroploidní – karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá
kultivace. Udržují se tzv. pasážováním – určitý počet buněk se po
určité době přenese do čerstvého živného prostředí
ADHERENTNÍ kultury – rostou přichyceny k pevnému podkladu
(kultivační nádobky, mikronosiče)
SUSPENZNÍ kultury – nevyžadují podklad, rostou volně v médiu
The American Type Culture Collection
www.atcc.com
The European Collection of Cell Cultures
www.ecacc.org.uk
HLAVNÍ KOMERČNÍ DODAVATELÉ BUNĚČNÝCH LINIÍ
Organismus
Orgán a typ tkáně
Adherentní x neadherentní
Jaké medium a sérum
Způsob pasážování
Podrobnosti, literatura atd.
KULTIVACE BUNĚK
Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti – sterilní
Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků
buněk v termostatu s řízenou atmosférou – 37 °C, 95 % vlhkost, 5 % CO2.
Nutná přísná sterilita!!!! – sterilní roztoky, plastik. nádobky, sklo, pipety
atd., sterilizace autoklávem (120 °C), nebo horkým vzduchem (180 °C)
Práce ve sterilním laminárním boxu (typ BioHazard – laminární proudění
vzduchu, filtry – chrání i uživatele – práce s nebezpečnými viry apod.)
Základní médium je balancované chemické prostředí – zdroj pro energii
a biosyntézu.
Doplňky:
a) nedefinované složky – zvířecí séra (hovězí, telecí, fetální, koňské)
b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) – specializované
podle typu buněk
Živočišná séra
nejdražší součást média – ze zvířat z ekologicky málo poškozených
oblastí vhodné definované náhrady sér
Antibiotika a antimykotika
penicilin + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům)
ZPŮSOB KULTIVACE
Suspenzní buňky – po spočítání buněk se část supenze doplní čerstvým
kultivačním médiem
Adherentní (přisedlé) buňky – uvolnění od podkladu a rozvolnění shluků
enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média.
Některé buňky vyžadují tzv. „feeder layer“ – vrstvu buněk inaktivovaných
zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů
buněk
Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo
v miskách různé velikosti – otevřený systém v atmosféře 5 % CO2.
Velkokapacitní kultivace – na mikročásticích ve velkých kontejnerech –
automatická výměna média
Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 °C – mraznice,
tekutý dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné
kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) – většinou dimetylsulfoxid nebo
glycerol.
Zmrazování je pomalé (řízené po 1 °C), rozmrazování rychlé – ponoření
ampulí do lázně 37 °C.
KULTIVACE BUNĚK
Udržování kultury –
pasážování
určitý počet buněk
se po určité době
přenese do
čerstvého živného
prostředí
Adherentní
– odsátí média
– oplach EDTA/PBS
– Trypsin
Neadherentní
– část kultury se přenese
do nového média
VYUŽITÍ BUNĚČNÝCH KULTUR
Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci
a objasňování mechanismů účinků buněčných
regulátorů a genů, které určují individuální aspekty
chování buněk.
Tato technologie umožnila pokrok ve virologii,
somatické buněčné genetice, endokrinologii,
toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve
výzkumu karcinogeneze a stala se významným
nástrojem vývojové biologie, komplexní tkáňové
fyziologie a průmyslové výroby specifických
buněčných produktů.
Výhody
lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů
bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku
humorálních faktorů i celkového stavu organismu
lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat
jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách
homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje
studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů
chování těchto buněk
specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství
důležitých biologických látek (enzymy, hormony) – hybridomy
etické hledisko – systém omezuje využívání laboratorních zvířat
Nevýhody
umělý zjednodušený systém
poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo
Buňky nezralé (nediferencované nebo částečně diferencované)
buňky kmenové (toti- nebo pluripotentní)
buňky progenitorové
Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do
zralejších stádií.
Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro
některé tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky).
Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách.
Buňky zralé – diferencované
Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou
schopny se dále dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní
buňky apod.)
Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo
se z nich vytvářejí heteroploidní permanentní linie.
BUNĚČNÉ POPULACE IN VITRO
Imortalizované
z normální tkáně i nádorové linie
asynchronní
buňky se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu –
přirozený stav
synchronní
buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu – uměle navozené
různými chemickými látkami, homogenní populace, stejné
reakce
Využití zejména při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi
buněčného cyklu nebo v praxi v nádorové terapii (léčba
cytostatiky)
EPITELIÁLNÍ BUŇKY
z lidské tkáně kolonu
línie HT29, CaCO2, HCT116 – nádorové buňky , FHC – fetální
střevo, NCM460 – nenádorové.
Schopnost diferencovat in vitro po působení butyrátu
sodného (NaBt):
růst aktivity alkalické fosfatázy
morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu
výšení exprese adhezívních molekul – E-kadherinu
Vhodný model
pro studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy
epitelu střeva a mechanismů vzniku nádorů kolonu, působení
lipidových složek výživy a environmentálních polutantů
z lidské tkáně prostaty – nádorové i nenádorové linie
pro studium účinků cytokinů a nádorového mikroprostředí
Účinky butyrátu
SŘEVNÍ EPITEL – PŘECHOD ADENOM X KARCINOM
Buněčné línie
normální epitel
NCM460
fetální colon
FHC
adenom
AA/C1
RG/C2
adenocarcinom
HT-29
DLD-1
HCT-116
SW480
lymfatická
metastáza
SW-620
Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné
jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), línie nádorových buněk
hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty
plicní buňky: normální i transformované
Geneticky modifikované buněčné línie
Linie transfekované různými zkoumanými geny nebo je postrádající
(„knock-out“)
„Luciferase assay“
vnesený gen s luciferázou – intenzita světla odráží aktivaci příslušných
vnitrobuněčných receptorů
Pro detekci dioxinové aktivity (AhR), estrogenní aktivity ( ER) či aktivace
PPAR (peroxisome proliferator – activated receptors) studovaných látek
Intenzita světla měřena na luminometru.
VYBAVENÍ LABORATOŘE PRO KULTIVACE BUNĚK
Sterilní prostředí – speciální plastik, sklo, pipety (skleněné,
automatické – různé objemy)
autokláv, horkovzdušná sterilizace (130 °C)
Klimatizace, UV světlo
Destilační přístroj na superčistou vodu
Laminární box (Biohazard) – laminární proudění vzduchu, filtry –
sterilní prostředí pro práci, ochrana při práci
Inkubátor – 37 °C, 5 % CO2, 95 % vlhkost
Počítač částic (buněk)
Inverzní mikroskop
Centrifugy
ELISA reader
Cytocentrifuga
Fluorescenční mikroskop
Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměnné rotory)
Průtokový cytometr, sorter
Několik laserů, stanovení několika parametrů současně
u rozsáhlých buněčných populace, sortování populací
Fluostar – multifunkční přístroj – spektrofotometr, fluorimetr,
chemiluminometr
Zařízení pro molekulární biologii
Výkonná výpočetní technika
„Core facilities“ (Laboratoř molekulární biofyziky)
FACS Aria Sorp (BD) – vysokorychlostní buněčný sorter
Unikátní konfokální mikroskop Leica s vysokým rozlišením
MÉDIA
Řada druhů podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se
kompletní tekutá, koncentráty, prášková – skladování 40 °C.
Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 S a chemikálie nejvyšší
čistoty. Nutná sterilizace přes filtr 0,2 m.
Základní složky
Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin – zdroj energie a uhlíku
Aminokyseliny – zdroj energie a dusíku
Vitamíny – kofaktory pro enzymatické reakce
Lipidy – esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod.
Anorganické soli – zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor
Pufrační solné směsi – Earlův roztok (fyziolog. roztok s vysokým obsahem
NaHCO3) – kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5 % CO2
zabraňuje rozpadu a alkalizaci média.
Požadované pH většinou 7,2–7,4 – úprava HCl a NaOH
Otevřený systém – Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěrem
Optická kontrola – indikátor fenolová červeň
Organické pufrační systémy – HEPES 20mM
Nejčastěji používané fetální bovinní (telecí)
sérum (certifikát)
Metodologické přístupy
CYTOKINETIKA – chování buněk v čase
APOPTÓZA (anoikis)
APOPTÓZA
(poškozené buňky)
 kontinuálně se obnovující buněčné
populace
 řada zásadních fyziologických funkcí
 dynamická rovnováha mezi
přírůstkem buněk na bázi krypty
(proliferace) a úbytkem (apoptózaanoikis)
na povrchu
 regulace endogenními faktory
(hormony a cytokiny), ale rovněž
složkami diety přítomnými v lumen
střeva
Endogenní
regulátory
kmenové buňky
EPITEL TLUSTÉHO STŘEVA (KOLONU)
 druhým nejčastějším nádorem u mužů hned po nádoru plic a u žen po
nádoru prsu
 ČR – vysoká incidence, přední ve statistikách, alarmující růst
rozvoj nádorů kolonu - vlivy genetické
- vlivy zevního prostředí (genotoxická činidla
a negenotoxické promotory)
nerovnováha
proliferace
diferenciace
apoptóza
porušení homeostázy tkáně
karcinom
(kolorektální)
http://cellbio.utmb.edu/microanatomy/digestive/Intestine.htm
NÁDOR TLUSTÉHO STŘEVA
DETEKCE PROLIFERAČNÍ AKTIVITY BUNĚK
Růst buněk
počty buněk (Coulter Counter, Casy, Bürkerova komůrka) v časových
intervalech od vysetí určitého počtu buněk – růstové křivky
spektrofotometrické stanovení celkových proteinů – Amido black
doba zdvojení populace (doubling time),
generační doba (trvání buněčného cyklu)
Metabolicky aktivní část populace
izotopové metody - stanovení podílu populace syntetizující DNA – inkorporace
3H-tymidinu do DNA – detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo
scintilačně – detektor  záření
spektofotometrické metody – inkorporace bromdeoxyuridinu (BrdU) – detekce
pomocí navázáné protilátky – ELISA reader nebo průtoková cytometrie (FCM)
metoda redukce MTT na formazan – založeno na aktivitě mitochondrií
Stanovení mitotického indexu
mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných
preparátech
TESTY CYTOTOXICITY – KOLORIMETRICKÉ METODY
MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) test
Žluté MTT se mitochondriálními enzymy dýchacího řetězce redukuje na fialový
formazanový derivát, který zůstává uvnitř buněk ve formě nerozpustných
granulí. Po přidání detergentu (lauroylsíran sodný, SDS) a okyselení se
barvivo z buněk uvolní a rozpustí, takže vznikne roztok k fotometrickému
stanovení.
Stanovení viability – vitální barvení trypanovou modří nebo eosinem,
propidium jodid (flow cytometrie) – mrtvé buňky nejsou schopny vyloučit
barvivo a zůstávají obarvené – % živých buněk – viabilita
Dávkové závislosti přežití buněk (detekce IC50)
POČTY BUNĚK
Coulter Counter
Mezi elektrodou uvnitř trubice
a zevní elektrodou protéká
elektrický proud
Buňka procházející mezi elektrodami
přeruší tok proudu a vede k změně
napětí
Změna napětí je úměrná objemu
částice
Změna napětí musí mít určitou
prahovou hodnotu, aby byla
započítána
Suspenze buněk v elektrolytu je
nasávána do trubice s malým
otvorem
CASY
Základní princip stejný jako u Coulter Counter
Navíc analýza
– Viability buněk
– Objemu buněk
– Agregátů
– Debris – „rozbitých buněk“
Růstové křivky (počty buněk v čase)
Koncentrační (dávkové) závislosti
xCELLigence System (Roche)
Real-Time CellAnalyzer
Speciální destičky s mikroelektrodami –
zaznamenávají se změny impedance
Měří tzv. cell index (CI) v reálném čase
(odráží změny v růstu, adhezi, morfologii buněk)
Cell index po působení mastných kyselin
(DHA, NaBt) a jejich kombinace
Linie FHC (lidské fetální střevo)
Linie HCT-116
(adenokarcinom střeva)
DETEKCE BUNĚČNÉ SMRTI
apoptózy/nekrózy/autofagie
Morfologicky – světelný mikroskop
Fluorescenční mikroskop
Průtoková (flow) cytometrie
(TUNEL- barvení konců fragmentů DNA, AnnexinV,
subG0/G1 populace)
Stanovení specifických markerů (proteinů, mRNA)
těchto procesů (western blotting, RT-PCR)
STANOVENÍ APOPTÓZY
více metod principiálně odlišných
Aktivace kaspáz
Kondenzace buňky a organel
Kondenzace chromatinu
Ztráta asymetrie buněčné membrány
Zachování integrity buněčné membrány
Tvorba „bodies“ a jejich fagocytóza okolními
buňkami
Stanovení apoptózy na různých úrovních
procesu… (aktivace kaspáz, uvolnění
cytochromu c, štěpení cílových proteinů, DNA)
MORFOLOGICKÁ DETEKCE APOPTÓZY
barvení DAPI
Během apoptózy – fragmentace
DNA ~ 200 PB
DAPI (4',6-diamidino-2phenylindole)
prochází
neporušenou cytoplazmatickou
membránou
DAPI se vmezeřuje do DNA –
typické „rosety“ pod fluorescenčním
mikroskopem – apoptická tělíska
Absorpční maximum ~358 nm
(ultrafialová)
Emisní maximum ~461 nm (modrá)
http://springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s13277-010-0036-6-3
http://cytoquant.com/mediac/450_0/media/8cda7dca66452e40ffff84f0ac144225.JPG
DIFERENCIACE
Rozrůznění buněk do odlišných typů (při vývoji,
v dospělosti v některých tkáních – krevní, epiteliální)
Při diferenciaci
se mění morfologie buněk
stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické
fosfatázy)
stoupá exprese specifických povrchových antigenů
(CD11b, CD14)
vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových
radikálů (měření redukce NBT nebo
chemiluminiscenčně)
STANOVENÍ DIFERENCIACE BUNĚK
Z ADENOKARCINOMU KOLONU (LINIE HT-29)
Buňky diferencují po působení butyrátu sodného (NaBt, 2–5 mM, 72 h).
Morfologické změny, adheze, zvýšená exprese E-kadherinu,
polymerizace F-aktinu
Zvýšení aktivity alkalické fosfatázy
Metoda fluorimetrického stanovení – přístroj Fluostar (spektrofotometr,
fluorimetr, chemiluminometr).
Spektrofotometrie = stanovování vlastností vzorku, např. koncentrace
určité látky v roztoku, na základě pohlcování světla v různých vlnových
délkách spektra.
APOPTÓZA
% buněk s apoptickou morfologií
(počítá se cca 200 buněk/vzorek)
DIFERENCIACE
Aktivita ALP vyjádřená v %
kontroly (=100%)
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE
Jedna z hlavních používaných
metodologií
Měření řady buněčných parametrů
v krátkém čase u 10 tis. buněk
FACSVerse
FACSAria – vysokorychlostní sorter
rozdělí buňky dle požadovaných
parametrů
Fluorescenční barvy s vazbou
na DNA nebo monoklonální
protilátky
Excitace laserem
Měření intenzity fluorescence
Buněčný cyklus Exprese povrchových CD antigenů
Exprese a produkce vnitrobuněčných molekul
Intenzita fluorescence
Mitosis S-phase
Apoptosis
G0G1
G2
Differentiation Senescence
BUNĚČNÝ CYKLUS
DETEKCE POČTU BUNĚK V JEDNOTLIVÝCH
FÁZÍCH BUNĚČNÉHO CYKLU
Flow cytometrie – procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi (propidium iodid)
Stanovení délky fází buněčného cyklu – autoradiografické metody, BrDU
Biochemické metody - LIPIDOMICKÉ ANALÝZY
(spolupráce s VÚVeL)
obsah a spektrum jednotlivých typů mastných kyselin (MK) v celkových
buněčných lipidech
GC-MS (gas chromatography – mass spectrometry)
hmotnostní profily v jednotlivých skupinách lipidů:
fosfolipidy - PC, PS, PI, PE, SM, neutrální lipidy (cholesterol a jeho
estery)
LC-MS-MS (high – performance liquid chromatography
– tandem mass spectrometry)
srovnání lipidomu nádorových a nenádorových buněk
změny lipidomu po působení dietetických lipidů a jiných faktorů
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
DOPORUČENÁ LITERATURA:
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Eds. A. Doyle,
J. B. Griffiths, D. G. Newell, Wiley&Sons Inc., London 1995 (Vol. 1 and 2)
Culture of human tumor cells, Eds. R. Pfagner, R.I. Freshney, Wiley-Liss,
Wiley&Sons Inc., Hoboken, New Jersey, 2004
Current Protocols in Cytometry, Ed. J. P. Robinson et al., Wiley&Sons
Inc., New York 1997
T. Eckschlager a kol.: Průtoková cytometrie v klinické praxi
The Handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies,
10th edition, R. P. Haugland, Invitrogen Corp. 2005
R. A: Bradshaw, E. A. Dennis: Handbook of Cell Signaling (Vol. 1, 2, 3),
Elsevier Science, Academic Press 2004
Short Protocols in Molecular Biology (Vol. 1, 2) John Wiley &Sons, 2002
K. M. Debatin, S. Fulda: Apoptosis and Cancer Therapy (Vol. 1, 2),
WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim, 2006
Methods of Enzymology, DNA Microarrays Part A and B, Vol. 410 and 411,
Eds. J.N. Abelson, M.I. Simon, Elsevier Inc. 2006