VÝZNAM MUTAGENEZE U BAKTERIÍ
 Vyhledání genu a stanovení jeho funkce
 praktické využití modifikovaných kmenů (biotechnologie)
 příprava vakcín
 Výhody mikroorganismů při mutagenezi
 vysoká přirozená variabilita
 haploidní genom (malá velikost)
 velký počet potomstva za krátkou dobu
 snadný přenos genů
 snadná selekce
 Způsoby mutageneze
 klasická mutageneze (chemomutageny, fyzikální faktory)
 transpozonová mutageneze (biologické mutageny)
 mutátorové kmeny (mutace v reparačních mechanizmech)
 mutageneze in vitro
 CRISPR/Cas
NOMENKLATURA
 Genotyp: třípísmenový kód (zkratka) psaný kurzívou
 Gen je označen zkratkou trpA, alely trpA1
 a) Standardní alely se označují znaménkem +, např. trp+
 b) Mutantní alely se označují znaménkem -, např. trp
Fenotyp: Velké písmeno na začátku ne kruzívou, např. Trp.
Standardní fenotyp se označí +, např. Trp+, mutantni -.
Symbol není vždy totožný s označením genotypu. Např.
fenotyp Nif- může mít podstatu v nifX- nebo nodX- (různé
geny).
 Rezistence: r (R), s (S), uváděné jako exponenty (TetR)
 delece = D
 inzerce = ::
 plazmid, profág = E. coli (RP4, f80)
D
TcR x TetR
ZÁKLADNÍ TYPY MUTACÍ U BAKTÉRIÍ
 se změnou v morfologii kolonií
 se změnou citlivosti (k antibiotikům, toxickým
látkám, záření, fágům aj.)
 v požadavcích na růstové faktory (auxotrofní)
 se změnou v produkci látek (např. pigmentů)
 supresorsenzitivní (citlivé k supresorům)
 supresorové (vedoucí ke vzniku supresorů)
 ovlivňující reparační a rekombinační schopnosti
 vedoucí ke vzniku mutátorových kmenů
 se změnou citlivosti k teplotě – vysoké nebo nízké
(teplotně senzitivní)
Mutace letální x kondicionálně (podmíněně) letální
Typ mutace Podstata změny Detekce mutant
Ztráta
pohyblivosti
Ztráta bičíku, nefunkční bičík Kompaktní kolonie namísto
plochých
Ztráta kapsuly Ztráta nebo modifikace
povrchových kapsulárních struktur
Malé drsné kolonie namísto
velkých a hladkých kolonií
Drsné kolonie Ztráta nebo změna
lipopolysacharidové vnější vrstvy
Nepravidelné granulární
kolonie namísto hladkých
lesklých kolonií
Změna ve výživě Ztráta enzymu biosyntetické dráhy Neschopnost růstu na mediu
postrádajícím daný růstový
faktor
Zkvašování cukrů Ztráta enzymu katabolické dráhy Nedochází ke změně barvy
v mediu obsahujícím cukr a
pH indikátor
Rezistence k
antibiotiku
Zábrana vstupu do buňky, změna
cílové molekuly (složky ribozomu),
detoxikace antibiotika
Růst na mediu obsahujícím
inhibiční koncentraci
antibiotika
Rezistence k fágu Ztráta receptoru Růst v přítomnosti fága
Citlivost k teplotě Změna struktury esenciálního
proteinu
Neschopnost růstu při
zvýšené teplotě
Citlivost k chladu Změna struktury esenciálního
proteinu
Neschopnost růstu při nízké
teplotě
Důležité
genotypy:
- auxotrofie
- suprese
- restrikce
- lacZ
- přítomnost plazmidů
- přítomnost profágů
- přítomnost Tn a IS
- reparace
- rekombinace
- rezistence k fágům
Závislost počtu mutant na dávce záření (koncentraci mutagenu)
POSTUPY PŘI IZOLACI MUTANT
 Skríning (vyhledání mutant na základě pozorovatelné změny fenotypu:
Růst na indikátorových mediích (utilizace cukrů – tvorba kyselin - změna pH
– změna barvy) – podobně jako při odlišování druhů nebo kmenů
 Obohacování (zvyšování počtu mutant)
 penicilinová metoda.
 inkorporace radioaktivního prekurzoru (radioaktivní sebevražda)
 5-BU + UV
 Selekce (růst za podmínek, při nichž roste jen mutanta, buňky
standardního typu nepřežívají nebo nerostou /pozitivní (přímá)selekce/,
nebo nerostou mutanty, ale buňky standardního typu ano /negativní
(nepřímá) selekce/ - např. rezistence/citlivost k vnějším faktorům
 Replikování (razítkování) (přenos kolonií na medium s odlišným
složením: chybění živin n. růstových faktorů (aminokyseliny, vitamíny,atd)
přítomnost inhibitorů růstu (antibiotika, bakteriofágy, +/- teplota aj)
IZOLACE MUTANT REZISTENTNÍCH K
ANTIBIOTIKU NA GRADIENTNÍCH PLOTNÁCH
antibiotikum
100%
0%
Izolace vícestupňových mutant koncentrační gradient
Auxotrofní mutanty
vyžadující některý z
růstových faktorů
108 102
105Počet
buněk
Postup při nepřímé selekci mutant razítkovou metodou
Prototrofy rostou a tudíž
hynou, auxotrofní mutanty
nerostou a přežívají
(negativní selekce)
auxanografie
Trp1-
Trp2-
Trp3-
Fenotypy
mutant
A- a // b
B- b // c
C- c // d
blokáda
přeměnyA- B- C-
enzymy
SCHEMATICKÉ ZNÁZORNĚNÍ POSTUPU PŘI STANOVENÍ
NÁSLEDNOSTI REAKCÍ PŘI BIOSYNTÉZE AMINOKYSELIN POMOCÍ
AUXOTROFNÍCH MUTANT
Prodleva v čase
před tím, než
je mutace
detekovatelná
Doba, která je
nutná k tomu,
aby mutace byla
na všech kopiích
chromozomu
1
2
3
Mutantní fenotyp se
projeví teprve poté, až je
produkt standardního
genu dostatečně
naředěn nebo vyplaven z
cytoplazmy
Ke zvýšení počtu
mutantních buněk
dochází po dalším
dělení
3
Dokončení replikace
VZNIK SEKTOROVÝCH KOLONIÍ JAKO
DŮSLEDEK SEGREGAČNÍHO LAGU
Izolace supresorsenzitivních mutant
Tyto mutanty mají nesmyslný kodon v některém z genů. Vyskytují se
v množství 1-1,5% mezi mutanty jakéhokoliv znaku. Detekují se tak, že
se do mutantů vnese transdukujícím fágem alela supresorového genu
(sup-) – lze vnést též na plazmidu.
Jestliže se kolonie mutant daného znaku (tj. různých mutant v tomto
znaku, nejen sus!) přerazítkují na selektivní plotny s fágem, který
obsahuje supresor, vyrostou jen ty, které nesou mutaci
podmíněnou vznikem nesmyslného kodonu, nikoliv ty, které mají
jiný defekt v příslušném genu.
Další typy supresorových mutací:
Sense-mutace (aa1 aa2)
Mutace ribozomových proteinů: snížená rozpoznání nebo polohování
kodonu na mRNA na ribozomu
Mutace v genu sup
(gen pro tRNA)
Důkaz: vnesení fága se sus, který
na tomto kmeni poroste
IZOLACE SUPRESORPOZITIVNÍCH MUTANT (Su+)
Důkaz: vnesení
fága se Su+,
reverze fenotypu
(supresorových)
(Su- Lac- Trp+)
mutace
reverze Vznik
supresorové
mutace (Su+)
PŘÍKLAD SUPRESOROVÉ MUTACE A JEJÍ DŮKAZ
KŘÍŽENÍM
supA =
mutantní alela
genu pro tRNA
schopná
suprimovat
TEORETICKÉ PŘEDPOKLADY FLUKTUAČNÍHO
TESTU (LURIA A DELBRÜCK 1943)
 Pravděpodobnost mutace je velmi nízká, ale stejná pro každou
buňku (10-6-10-10 buněk/generaci)
 Uvažujeme-li určitou kulturu, pocházejí z jedné buňky, pak na
konci kultivace bude počet mutant odrážet dobu, ve které mutace
vznikla (tj. ve které generaci). Vzhledem k nízké pravděpodobnosti
mutace lze předpokládat, že i počty mutant v jednotlivých klonech
budou rozděleny podle Poissonovy řady - to proto, že záleží na
generaci, ve které k mutaci došlo. Proto se budou významně lišit
počty mutant v jednotlivých kulturách a v kultuře, kde byly buňky
pěstovány dohromady.
 Při fyziologické adaptaci reagují buňky na přítomnost látky
v prostředí - to působí jako indukční agens, které indukuje
adaptivní odpověď (např. tvorbu enzymů apod). Počet reagujících
buněk z různých kultur (klonů) je zhruba stejný. Změna fenotypu se
nedědí, dědí se jen schopnost se adaptovat.
Změna znaku
StrS StrR
Mutace?
Adaptace?
Kontrola: důkaz citlivosti
výchozí kultury ke
streptomycinu
Stejný počet
buněk
Výpočet chi-kvadrátu a stanovení průkaznosti rozdílů
20x
Závislost konečného počtu mutant na době, v níž mutace proběhla
jedna mutace: celkem 8 kolonií dvě mutace: celkem 6 kolonií
Počty rezistentních bakterií z nerozdělené kultury a samostatných kultur
Alikvoty z nerozdělené kultury Samostatné kulturyAlikvoty z nerozdělené kultury Samostatné kultury
PROVEDENÍ FLUKTUAČNÍHO TESTU
 Má se rozhodnout, zda rezistence ke streptomycinu je
výsledkem adaptace nebo mutace (zda jsou mutanty přítomny v
kultuře před vystavením buněk selekčnímu agens nebo se
objevují až poté)
 1. Ověří se, zda je výchozí kultura citlivá k streptomycinu
 2. Řada zkumavek s mediem bez streptomycinu se naočkuje
malým a stejným množstvím buněk
 3. Stejné množství buněk se naočkuje do Erlenky
s objemem, který je součtem objemů v jednotlivých
zkumavkách
 4. Kultury se ponechají inkubovat 24 hod
 5. Kultury se vysejí ve stejném množství na plotny se
streptomycinem
 6. Vyhodnotí se počty kolonií na jednotlivých plotnách a
srovnají se
 7. Vypočte se c2 a stanoví se, zda existují průkazné rozdíly
v počtech kolonií na plotnách
 8. Průkazný rozdíl v počtu kolonií na plotnách z jednotlivých
kultur ve srovnání s počty na plotnách z jedné kultury
svědčí o tom, že rezistence ke streptomycinu vznikla
mutací.
REPARACE MUTAČNĚ POŠKOZENÉ DNA
 A. Přímé reparace
 1. fotoreaktivace
 2. dealkylace
 B. Nepřímé reaparace
 1. Excizní reparace
 bázová
 nukleotidová
 řízená metylací
 2. rekombinační /postreplikační/
 3. reaparace kroslinků
 C. Inducibilní reparace
 1. SOS-odpověď
 2. adaptivní odpovědi
 na alkylační poškození
 na environmentální stres
Genetický aparát
pro reparaci DNA
- velmi konzervativní
- asi 100 genů
- distinktní dráhy,
které se mohou
prolínat
AP-místo Chybná báze Tyminový dimer
TYPY REPAROVATELNÝCH POŠKOZENÍ NA DNA
Vznik AP míst =
nejčastější spontánní
mutace (depurinace je
100x častější než
depyrimidinace)
STÁDIA FOTOREAKTIVACE
DNA obsahující dimer
(dsDNA, ssDNA)
Vazba fotolyázy v místě
dimeru (6-7 bp)
Monomerizace dimeru za
přítomnosti světla (365-400 nm)
uvolnění fotolyázy
FADH2
Folát/deazaflavin
fotolýza
zachycení světla
Alkyltransferáza: 6O-Metylguanin-DNAmetyltransferáza
(6O-MGT= Ada-protein)
nemetylovaná forma metylovaná forma
Transkripční
aktivátor
Rozpoznání chybné báze
glykozylázou, vznik AP-místa
Vyštěpení
chybné báze
Resyntéza chybějícího úseku,
spojení mezery DNA-ligázou
Přerušení cukrfosfátových
vazeb
AP-endonukleázami
Odstranění dR
s chybějící bází
BÁZOVÁ EXCIZNÍ REPARACE
DNA-GLYKOZYLÁZY PŮSOBÍCÍ NA POŠKOZENÉ DNA
DNA obsahující poškození (T-T,
chybný pár bazí aj)
NUKLEOTIDOVÁ EXCIZNÍ REPARACE (SHORT PATCH REPAIR)
Vazba UvrA2B1
disociace UvrA
vytvořeni preincizního komplexu
vazba UvrC
vytvoření incizního komplexu štěpení
cukr-fosfátové kostry
vyštěpení krátkého oligonukleotidu o
délce 11-13 b
resyntéza chybějícího úseku DNA - jako
templát slouží řetězec bez poškození
spojení mezery DNA-ligázou
4-5b -x-- 8b
SOS
UvrABC
excinukleáza
DNA-polI
Metylace DNA místně-specifickými metylázami
Rodičovská molekula
Dceřiné molekuly DNA
krátce po replikaci
Plně metylované dceřiné
molekuly DNA
REPARACE ŘÍZENÁ METYLACÍ (REPARACE
NA DLOUHOU VZDÁLENOST)
A-C A-T
UvrD
DNA
polymeráza III
A
C
MutS rozpozná chybnou bázi a vytvoří
smyčku na DNA, na kterou se váže
MutL, což umožní navázání a aktivaci
MutH, která štěpí G v GATC - poté
DNA-helikáza odmotá jednořetězec a
ten je nahrazen reparační syntézou
POSTREPLIKAČNÍ
REKOMBINAČNÍ REPARACE
Vznik mezery při syntéze DNA
vazba proteinu RecA
navození homologního párování
neporušeného a porušeného řetězce
reparační syntéza DNA podle sesterského
řetězce
rekombinace homologních řetězců
poškození zůstává v jedné z molekul a je
opraveno později
40
Model replikativní reparace
Helikáza vytváří vidlici, ale syntéza DNA neprobíhá
Replikace opět probíhá za vzniku mezery na řetězci,
na němž je poškození
Proteiny RecFOR napomáhají navázat protein RecA na
řětězec s mezerou
RecA nukleoproteinový filament se váže na
sesterskou DNA
Mezera se zaplní
Proteiny RecABC nebo RecG rozloží rekombinovanou
strukturu
Proteiny PriABC a DnaT opět připojí PolIII, replikace
pokračuje
Produkt rozkladu, nesoucí poškození
DNA obsahující cross-link
Komplex UvrABC
(endonukleáza) rozštěpí cukrfosfátovou
kostru na jednom
řetězci po obou stranách
DNA-polymeráza I rozšíří
mezeru svou 5´-3´
exonukleázovou aktivitou
Za účasti RecA dojde k
výměně řetězců ze sesterského
duplexu (rekombinační
reparační náhrada)
Komplex UvrABC vyštěpí
oligonukleotid obsahující cross-
link
Mezera je zaplněna podobně
jako při nukleotidové excizní
reparaci (DNA-polI, DNAhelikáza,
DNA-ligáza)
REPARACE MEZIŘETĚZCOVÝCH SPOJENÍ
(CROSS-LINK)
Vyštěpený
dvouřetězcový
fragment
12 bp
9 b 3 b
SOS-ODPOVĚĎ
geny din = damage induced, SOS-genes (31 genů
u E. coli)
 1. Indukce SOS mutageneze
 2. Excizní reparace dlouhých úseků
 3. Zvýšená schopnost reparace ds zlomů
 4. Indukce profágů (lambda, P22, f80)
 5. Indukce tvorby kolicinů
 6. Zmírnění restrikce
 7. Inhibice buněčného dělení
SOS-odpověd u E. coli
Neindukovaný stav: represor LexA
se váže na operátory asi 30 SOSgenů
a reprimuje jejich expresi
Po indukci: ssDNA se váže na RecA
za tvorby nukleoproteinového
filamenta, které váže LexA a štěpí
ho, což vede k expresi SOS-genů
PRŮBĚH SOS-REPARACE
Slabá exprese všech genů
DNA bez poškození
Poškození
DNA
Silná exprese všech genů
O = operátor RecA
LexA
LexA = dimer, podrobující se autokatalytickému štěpení za účasti RecA* (koproteáza)
RecA*
helikální filament RecA-DNA
SOS-MUTAGENEZE (ERROR-PRONE = CHYBY
NAVOZUJÍCÍ) - POSLEDNÍ ZÁCHRANA
UmuD se působením
RecA mění na UmuD´,
reakce je však pomalejší
než štěpení LexA a proto
je přednostně
indukována standardní
SOS-odpověď - ke
štěpení UmuD dochází až
při vysoké hladině RecA
DNA-polIII vytváří
komplex s proteiny
UmuC, UmuD a RecA,
čímž dochází k inhibici
opravy čtení
umu = UV-indukovaná
mutageneze
Mutace fága lambda
Regulace SOS-mutageneze u E. coli
Před poškozením reprimuje LexA
transkripci SOS-genů včetně operonu
umuDC
Po mírném poškození DNA se RecA
váže na ssDNA za tvorby RecAnukleoproteinového
filamenta, které
se váže na LexA a ten je štěpen –
dochází k expresi všech SOS-genů
včetně umuDC (trimer UmuD2C)
Po vysokém poškození se nahromadí
RecA-np filamenta, která pak navodí
štěpení UmuD a vytvoří se UmuD´2C.
UmuC vázaný na UmuD´2 je
mutagenní polymeráza, která je
schopná replikovat místa s
poškozením za vzniku chyb (vkládá
náhodně nukleotidy).
TLS = translesion synthesis
SCHÉMA SOS MUTAGENEZE
Komplex UmuD´2C
působí jako mutagenní
polymeráza
UmuD UmuD´
Silné poškození DNA
RecA-ssDNA (RecA*)
DNA-polymeráza V
+
Další mutagenní polymerázy u bakterií
Polymeráza IV – produkt genu dinB u E. coli (jeden z SOS genů)
- Je příbuzná proteinu UmuC
- gen dinB je regulován represorem LexA
- při replikaci vytváří chyby i na nepoškozené DNA
- vytváří mutace v DNA infikujících fágů lambda
- untargeted mutagenesis (UTM) – důsledek působení mutagenních
DNA-polymeráz
Biologická funkce?? – umožňuje replikaci DNA poškozené jinými
typy poškození než těmi, která způsobuje UV
Ada-protein = alkytransferáza, Alk-proteiny = glykozylázy
REGULACE ADAPTIVNÍ ODPOVĚDI
K POŠKOZENÍ VYVOLANÉMU ALKYLACÍ
aktivátor
transkripce
aktivace
Ada
indukující
signál
Ada
CH3
Regulace adaptivní odpovědi na alkylaci DNA
V buňce bez poškození se nachází
jen několik molekul Ada proteinu. Po
poškození DNA alkylační látkou
přenáší Ada protein
(metyltransferáza) alkylové skupiny
z metylovaných fosfátů DNA na
aminokyseliny umístěné na N- konci
své vlastní molekuly, čímž se
konvertuje na transkripční aktivátor
(1), nebo přenáší alkylové skupiny z
metylovaných bází na
aminokyseliny na svém C-konci, což
vede k inaktivaci Ada-proteinu (2).
Ke vzniku (1) dochází jen při
silném poškození DNA, při
nízkém poškození jsou pouze
odnímány metylové skupiny z
bází a protein Ada se inaktivuje.
1 2
biochemické funkce alkB a aidB zbývá objasnit
Dvojí úloha proteinu Ada při reparaci alkylované DNA
Aktivace genů zodpovědných za reparaci
2) 1) 2)
 Vystavení E. coli netoxickým koncentracím peroxidu
vodíku vede ke zvýšení následné schopnosti
korigovat DNA poškození způsobované vyššími
dávkami této látky.
 Adaptace k oxidativnímu stresu je nezávislá jak na
alkylačním poškození, tak SOS odpovědi, a
nevyžaduje ada, lexA nebo recA proteiny.
 V přítomnosti peroxidu je indukováno nejméně 30
proteinů ze dvou regulonů. OxyR funguje jako
pozitivní regulátor devíti genů, z nichž čtyři byly
identifikovány: kataláza/peroxidáza,
glutationreduktáza, mangan superoxiddismutáza, a
NAD(P)H-dependentní alkylhydroperoxidreduktáza.
Adaptivní odpovědi na environmentální stres
Mutátorové kmeny u E. coli