Technologické aspekty vývoje genových terapií Slabý Ondřej Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita Ústav patologie, Fakultní nemocnice Brno Masarykův onkologický ústav, Brno Co je to genová terapie? • The insertion of usually genetically altered genes into cells especially to replace defective genes in the treatment of genetic disorders or to provide a specialized diseasefighting function - Merriam-Webster Dictionary • Experimental treatment of a genetic disorder by replacing, supplementing, or manipulating the expression of abnormal genes with normally functioning genes - National Center for Biotechnology • It is an approach to treating disease by either modifying the expressions of an individual's genes or correction of abnormal genes - American Society of Gene and Cell Therapy • Gene therapy is the use of DNA as a pharmaceutical agent to treat disease - Wikipedia Genová terapie monogenních podmíněných chorob je léčebný postup při němž je do genomu pacienta vložena sekvence DNA přičemž tato sekvence kóduje nějaký chybějící nebo nefungující protein. Genová terapie je nástroj moderní terapie založený na cílené modifikaci (či interakci?) s buněčnou DNA/RNA za účelem aktivace nebo inaktivace konkrétního genu. ??? 1990 PRVNÍ GT ADA-SCID Milníky a píky genové terapie Základní typy genové terapie Genová terapie somatických buněk vs. Genová terapie zárodečných buněk (celosvětové moratorium) Genová terapie EX VIVO vs. IN VIVO Tři základní principy genové terapie Anguela XM, Annual Review of Medicine, 2019 ? He said that his group used the gene-edi^ng tool CRISPR/Cas9 to disable the CCR5 gene in the fer^lized eggs that produced the babies, called “Lulu” and “Nana” (not their real names). CCR5 produces a protein that allows the most common version of the HIV virus to enter cells. Some people naturally have muta^ons in the gene that help protect them from HIV infec^on. Such “gene surgery” has already proven safe in adults with HIV, He said in the video. HIV infec^on is s^ll a deadly disease and in the developing world, “discrimina^on increases the devasta^on,” He said. Gene edi^ng could spare such children from their parents’ fate, He claims. Metody dopravení DNA do tkáně Pomocí -virových vektorů -nevirově Metody dopravení DNA do tkáně – virové vektory RETROVIRY -jsou schopny atakovat pouze dělící se buňky (neprochází kompaktní jadernou membránou) - napadají především T-lymfocyty - pouze ex-vivo terapie a náhodná integrace do hos^telského genomu - riziko inzerční mutageneze - maximální velikost transgenu do 7.5 kbp - retroviry nezpůsobují lyzi buňky LENTIVIRY mohou nahradit klasické retroviry, jelikož jsou schopny infikovat a integrovat svůj genom do nedělících buněk např. neurony, makrofágy, hematopoe]cké kmenové buňky a buňky svalů a jater delece v LTR, není schopen produkovat infekční čás^ce, ale schopen integrace ADENOVIRY dsDNA viry napadají všechny typy buněk virová DNA se neintegruje do genomu hos]tele exprese je silná ale pouze dočasná (max. měsíc) způsobují silnou imunitní odpověď (exprese wild-type proteinů virové čás^ce) nová generace adenovektorů neobsahující přirozené geny nejsou vhodné pro léčbu nádorových buněk, protože ty na ně nemají receptory Většina lidí má pro^látky, 90% vektorů je degradováno během prvních 24 hodin od podání ADENO-ASOCIOVANÉ VIRY (AAV) dsDNA viry Většina odovozena od serotypu 2 (AAV2) nikdy nespojovány s lidskými nemocemi napadají všechny typy buněk virová DNA se integruje do genomu hos^tele na specifickém místě (u člověka na konci 19tého chromozomu) Není riziko inzerční mutageneze exprese je ale slabá a vektory mají malou kapacitu 4kb nezpůsobují silnou imunitní odpověď Kdy je doporučeno dlouhodobé sledování záleží na použitém vektoru Vector Pros Cons Long-Term Follow-Up Recommended? Adenovirus ► Capable of holding large amounts of DNA ► Non-integrating, less risk of mutations ► Only the cells that are directly modified will express the gene of interest – long-term expression is unlikely ► Can induce immune response No* Adeno-associated virus (AAV) ► Not known to cause human diseases, so very little risk of immune response ► Integrates at specific site so limited risk of mutations ► Can only hold a small amount of DNA ► Transient expression Product specific (2-5 years of follow-up) Retroviruses (e.g. lentivirus, gammaretrovirus) ► Long-term expression of the gene due to DNA integration ► Can infect both dividing and non-dividing cells ► Non-specific insertion site can cause high risk of mutations ► Potential for activation of proto-oncogenes and risk of malignancies Yes Nonviral Vectors (e.g. plasmids, RNA) ► Capable of holding large amounts of DNA ► No immune response ► Less efficient at modifying cells No *Specific circumstances that indicate persistent expression of the transgene, in the absence of integration or genome editing, may require LTFU observations to mitigate long term risks to subjects. Jaké vlastnosti by měl mít ideální vektor • Bezpečný (bez vedlejších účinku, neimunogenní) • Cílený na příslušné buňky • Snadno získatelný (produkce, purifikace apod.) • Stabilní • Efektivní v doručení DNA • Snadno aplikovatelný • Schopný chránit genetickou informaci, kterou nese • Nesmí obsahovat –sekvence homologní s funkčními geny, jiné čtecí rámce, informace pro produkci toxického produktu apod. X Workflow při vývoji genové terapie Workflow při vývoji genové terapie 1 – klonování plasmidů v bakteriálním systému Workflow při vývoji genové terapie – příklad AAV 2 – příprava AAV vektoru v balících buňkách X Workflow při výrobě přípravku genové terapie Workflow při vývoji genové terapie 1 - příprava plasmidů v bakteriálním systému Workflow při výrobě přípravku ex vivo genové terapie Příprava CAR T-lymfocytů Příprava T lymfocytů s chimerickým antigenním receptorem (CAR) - Ex vivo genová terapie Why Are Cell and Gene Therapies Challenging? Monoclonal an]bodies Ex vivo gene therapy (e.g. CAR-T) • Starting materials well categorized • Starting material has high variability • Single or limited number of GMP-compliant sources for API • Multiple sources of starting material (apheresis centres) • Single lot = 1000s of patients; make-to-stock is possible • Single lot = 1 patient; therapy manufactured in real time • Product is not personalised • Needle-to-needle traceability required – patient must receive therapy manufactured from his/her own cells • Long and large clinical trials – long term safety/efficacy data; time to build global experience and plan commercial supply chains • Short and small clinical trials – limited data means long term safety studies may be required; less time to plan and develop commercial supply chain • Simpler reimbursement models based on massive amount of commercialization experience • High cost, potentially curative therapies (Kymriah $475k; Yescarta $375k). Reimbursement models potentially more complex and based on outcomes • Shorter term follow-up if treatment is successful • Long term follow-up, even if treatment is successful or curative • Can be scaled up without scaling out • Scale-up only achieved by scaling out, increasing supply chain complexity Shahryari A et al., Front Genet, 2019 Přehled schválených přípravků genové terapie Gencidine - první schválená genová terapie na světe (v Číně) – Ad vektor Glybera - Genová terapie deficitu lipoproteinové lipázy (AAV) první schválenou genovou terapií v Evropě v roce 2012 byl alipogene tiparvovec • uveden na trh pod názvem Glybera • AAV serotyp 1 (tropismus ke svalové buňce) nesoucí kopii lidské lipoprotein lipasy • deficience lipoprotein lipasy se vyskytuje u 1 člověka z 1-2 miliónů • cena pro jednoho pacienta byla původně 1.6 miliónů dolarů • v r. 2015 snížena na 1 milión dolarů • lék byl použit jedinkrát v Německu v září 2015 • společnost uniQure oznámila, že nebude prodlužovat licenci v Evropě až vyprší na podzim 2017 https://www.technologyreview.com/s/601165/the-worldsmost-expensive-medicine-is-a-bust/amp/ Strimvelis • lék na ADA-SCID – výskyt v Evropě zhruba 15 případů ročně, 12 v USA • ex vivo genová terapie hematopoe^ckých kmenových buněk (HSC pomocí retrovirového vektoru s lidskou ADA • cena byla stanovena na 594 000 € (dvojnásobek roční ceny enzymoterapie) • schválen EK v květnu 2016 V současnosti jsou tři přípravky genové terapie schváleny FDA August 2017 May 2018October 2017 FDA approves first gene therapy (CAR-T therapy), Kymriah© (^sagenlecleucel), for treatment of children and young adults with relapsed or refractory B-cell acute lymphoblas^c leukemia and for adults with relapsed or refractory diffuse large B-Cell FDA approves another CAR-T therapy, Yescarta© (axicabtagene ciloleucel), to treat relapsed or refractory large B-cell lymphoma administered with a one time IV infusion. FDA approves Luxturna© (vore^gene neparvovec-rzyl) to treat RPE65 muta^on-associated re^nal dystrophy, an inherited form of vision loss that may result in blindness administered by Subre^nal injec^on (one ^me per eye). * Kymriah’s cost is indication-specific. Note, price listed includes only the acquisition cost of the medication. Before receiving medication, patient must receive 3 days of conditioning chemotherapy. Product must be infused in the hospital setting and patient typically remains inpatient for a minimum of 7 days, all of which will increase total cost of care. FDA approves Kymriah © for second indication, treatment of relapsed or refractory large B-cell lymphoma or leukemia administered with a one time IV infusion. December 2017 Cost es^mate for treatment is $373,000 - $475,000* Cost estimate for treatment is $373,000* Cost es^mate is $475,000 per eye Cost estimate is $373,000 - $475,000 37% 29% 26% 2% 5% 1% > 1,770 Global Gene Therapy Trials Suppor]ng >700 Gene Therapy Candidates Phase I Phase I/II Phase II Phase II/III Phase III Phase IV Přípravky genové terapie schválené nebo s očekávaným schválením FDA v roce 2019 May 2019 - approved Late 2019Mid/late 2019 Zolgensma (AVXS-101) Spinal muscular atrophy (SMA) Type 1 One-time IV infusion US prevalence 500 people Expected cost $1-4 million Toca-511 Recurrent high grade glioblastoma One-^me administra^on followed by ER 5- fluorocys^ne. US prevalence 8,000 people Cost TBD Lisocabtagene Large B-cell lymphoma One-^me IV infusion US prevalence 1-3 per 10,000 Cost TBD Valoctocogene roxaparvovec Hemophilia A One-^me IV infusion. US prevalence 1 per 12,000 people Cost TBD Len]Globin Transfusion dependent beta- thalassemia One-^me IV infusion US prevalence 1,000 people Cost TBD Source: Informa Pharma Intelligence, May 2018 The number of gene-therapy developers has ballooned from 69 (2014) to 255 in 2018 - Alliance for Regenerative Medicine (ARM) 1990 PRVNÍ GT ADA-SCID Genová terapie dnes Děkuji za pozornost