Nekódující RNA u solidních nádorů: od biomarkerů terapeutickým cílům prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita Masarykův onkologický ústav Ústav biochemie a experimentální onkologie, 1. LF Univerzity Karlovy kódující geny představují méně než 2% sekvence lidského genomu vs. téměř 80% lidského genomu je aktivně přepisováno do struktury RNA Proč jsou nekódující RNA důležité? Sana et al, J Transl Med, 2012 Komplexnost organismů narůstá s genomovým obsahem nekódujících RNA. Nekódující RNA představují novou úroveň regulace genové exprese v biologických systémech. DNA mRNA protein nekódující RNA mikroRNA Sana et al, J Transl Med, 2012 Nové třídy nekódujících RNA mikroRNAs Historie 1993 Ambros, Ruvkun – objev miRNA -lin-4 1998 Fire, Mello – RNA interference 1999 Tuschl, Zamore, Bartel, Sharp -RNAi fragmenty 21-23 bp 2000-2001 Hannon -Ago2, Dicer 2002 Zamore RNAi (siRNA) a miRNA sdílejí funkční dráhu 2002 Calin a Croce miR-15,miR-16 u CLL 2004 Calin a Croce lokalizovali 50% genu pro miRNA do fragilních částí lidských chromozómů 2006 Croce miRNA mají deregulovanou expresi v nádorové tkáni … Cell, 1993 Nature, 1998 PNAS, 2006 2 1 3 2007 První publikace zaměřená na studium miRNA u nádorů od českých autorů Pátá v oblasti kolorektálního karcinomu (KRK) Dnes > 2000 publikací zaměřených na miRNA u KRK microRNA = 94974 1. microRNA and cancer = 44497 10.22.2019 10.27 Slaby, Svoboda et al., MikroRNA v onkologii, Galén, 2012 Úvod do molekulární medicíny 4/12 Strana 29 • miRNA jsou krátké nekódující RNA post-transkripčně regulující genovou expresi • maturovaná miRNA je dlouhá 20-25 nukleotidů • v databázi miRBase je anotováno 2549 lidských miRNA* • tyto miRNA mají potenciál regulovat více než polovinu lidského genomu • jedna miRNA může regulovat desítky až stovky cílových mRNA • miRNA často tvoří klastry nebo sekvenční rodiny (např. klastr miR-17, rodina let-7) *Sanger miRBase release 21.0, 2016 Úvod do biologie mikroRNA Olive et al, Genes Development, 2009 Lodish et al, Nature, 2008 Rodina mikroRNA let-7 Klastr miR-17-92 Strana 25 © Ondřej Slabý, 2009 Kanonická dráha biogeneze a biologické funkce mikroRNA 1. Transkripce genu pro miRNA pomocí RNA polymerázy II 2. pri-miRNA je zpracována ribonukleázami Drosha a Pasha 3. pre-miRNA je exportována z jádra do cytoplazmy pomocí proteinu Exportin 5 4. pre-miRNA je v cytoplazmě dále štěpena pomocí ribonukleázy Dicer Esquela-Kerscher A et Slack F, Nature Reviews Cancer,2008 Strana 26 5. Vedoucí řetězec z maturovaného duplexu miRNA je začleněn do multiproteinového komplexu miRISC, který se váže na cílovou mRNA. 6. V závislosti na stupni komplementarity proběhne utlumení translace nebo indukce degradace cílové mRNA microRNA: licensed to kill messenger Esquela-Kerscher A et Slack F, Nature Reviews Cancer,2008 Kanonická dráha biogeneze a biologické funkce mikroRNA Přibližně 50% znamých genů pro miRNA leží ve fragilních částech oblastech chromozómů, které jsou často zmnoženy nebo ztraceny v nádorových buňkách Calin et al., PNAS, 2004 Geny pro miR-15a a miR-16a leží v regionu 13q14, který je často deletován u CLL MikroRNA vstupují do nádorové biologie Caldas et al., Nature Medicine, 2005 Role mikroRNA v nádorové buňce ONKOGENNÍ MIKRORNA ↑miRNA SUPRESOROVÁ MIKRORNA ↓ miRNA ↓ nádorový supresor ↑ onkogen Lujambio, Nature 2012 Kong et al, Lancet Oncology 2012 MikroRNA fungující jako onkogeny a nádorové supresory Kasinsky, Slack, Nature Reviews Cancer, 2012 MikroRNA jako onkogeny nebo TS v závislosti na kontextu Využití mikroRNA v diagnostice a léčbě kolorektálního karcinomu CIKRULUJÍCÍ MIKRORNA JAKO DIAGNOSTICKÉ BIOMARKERY MODELOVÁ STUDIE 1 Sérové mikroRNA v diagnostice kolorektálního karcinomu MikroRNA jsou přítomny v různých typech tělních tekutin Kim et al, CMJ 2015 Or roku 2008 více než 800 citací Weber et al, Clinic Chem 2010, >375 citations MikroRNA jsou přítomny v různých typech tělních tekutin Redova, Slaby, Future Oncology 2013 Uvolňování mikroRNA do cirkulace a jejich formy Falcone et al, JECCR, 2015 MikroRNA v exosomech jako komunikační kanál v rámci nádorového mikroprostředí Gilad et al., 2008 Stabilita cirkulujících mikroRNA Pritchard et al, Cancer Prev Res, 2012 Plazmatické a sérové profily mikroRNA jsou kontaminovány mikroRNA pocházejícími z krevních buněk Serum/plasma samples of RCC, CRC, GC Serum of healthy donors Hospital A Serum of healthy donors Hospital B and C Rozdílná logistika a zpracování vzorků ovlivňuje hladiny mikroRNA DIFFERENCES IN SERUM PREPARATION !!!!! miR=X 424 pacientů s kolorektálním karcinomem (KRK) 276 kontrolních osob Vychytilova et al. Carcinogenesis, 2016 MODELOVÁ STUDIE 1 54 miRNA s rozdílnými hladinami v krevním séru pacientů s KRK (P<0.01) Sérové mikroRNA jako biomarkery pro časnou diagnostiku a stanovení prognózy pacientů s kolorektálním karcinomem EXPLORATIVNÍ FÁZE Sekvenování nové generace (Illumina) 144 pacientu s KRK, 96 kontrol TRÉNINKOVÁ FÁZE RT-qPCR, vývoj DXscore 80 pacientu s KRK, 80 kontrol VALIDAČNÍ FÁZE RT-qPCR, validace DXscore 200 pacientu s KRK, 100 kontrol Vychytilova et al. Carcinogenesis, 2016 DXscore = -3.96 - 8.20*miR-27a-3p + 54.89*miR-23a-3p + 71.75*miR-142-5p + 78.13*miR-376c-3p 80 případů, 80 kontrol 200 případů, 100 kontrol AUC = 0,92 Senzitivita 89% Specificita 81% AUC = 0,87 Senzitivita 81% Specificita 81% Sérové mikroRNA jako biomarkery pro časnou diagnostiku a stanovení prognózy pacientů s kolorektálním karcinomem AUC = 0,92 Senzitivita 88% Specificita 81% Vychytilova et al. Carcinogenesis, 2016 použitím kombinace CEA/CA19-9/DXscore bylo 162 ze 168 případů správně identifikováno jako pacient s KRK Sérové mikroRNA jako biomarkery pro časnou diagnostiku a stanovení prognózy pacientů s kolorektálním karcinomem HR 95%Cl P P (log-rank test) Klinické stádium 2,76 2,12 3,59 < 0.0001 < 0.0001DXscore:: HIGHrisk 2,30 1,44 3,66 < 0,0004 Vychytilova et al. Carcinogenesis, 2016 DXscore vykazuje také prognostickou funkci nezávislou na klinickém stádiu! patentová žádost, vývoj diagnostické soupravy ve spolupráci se společností Biovendor Sérové mikroRNA jako biomarkery pro časnou diagnostiku a stanovení prognózy pacientů s kolorektálním karcinomem Improvement of DxScore – 3 miRNAs + 1 PIWI-interacting RNAs (piRNA) piR-X Newly discovered piR-X enabled improvement of DxScore analytical performance for detection of early stages CRC -> AUC=0,87 to 0,92 Sens. from 81 to 84% Spec. from 81 to 83% 200 CRC cases and 100 controls 90 TNM stage 1 and 2 CRC cases and 100 controls European Patent application EP17181646 1Q/2019 Multicentric prospective trial to prove clinical utility of Dxscore in early detection and monitoring of hereditary CRC patients VYUŽITÍ MIKRORNA V DIAGNOSTICE A LÉČBĚ KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU MIKRORNA JAKO TKÁŇOVÉ BIOMARKERY MODELOVÁ STUDIE 2 Tkáňové mikroRNA jako prediktivní biomarkery odpovědi na léčbu protilátkami proti EGFR u metastatického kolorektálního karcinomu MikroRNA jako tkáňové biomarkery v onkologii Slaby, Svoboda (Eds.) MikroRNA v onkologii, Galén, 2012 Metastatický kolorektální karcinom Nemutovaný KRAS/NRAS (40-50%) Dobrá odpověď na anti-EGFR terapii (40%) Špatná odpověď na anti-EGFR terapii (60%) Mutovaný KRAS nebo NRAS (50-60%) Mlcochova et al., Oncotarget, 2016 ↑ miR-31-5p MIKRORNA JAKO PREDIKTORY ODPOVĚDI NA LÉČBU PROTILÁTKAMI PROTI RECEPTORU EGFR U METASTATICKÉHO KOLOREKTÁLNÍHO KARCIMOMU Ve spolupráci se skupinou prof. Negriniho z univerzity ve Ferraře. MikroRNA jako prediktivní biomarkery u kolorektálního karcinomu MODELOVÁ STUDIE 2 miR-31-5p – nízká hladina ---vysoká hladina * TTP, time to progression (čas do progrese) Mlcochova et al., Oncotarget, 2016 Nízká (66%) vs. vysoká hladina (34%) TTP* - 45 vs. 14 týdnů HR 4.8, p < 0.001 miR-31-5p – nízká hladina ---vysoká hladina CETUXIMAB PANITUMUMAB Nízká (42%) vs. vysoká hladina (58%) TTP – 20 vs. 29 týdnů HR 0.6, p = 0.261 Srovnatelné s TTP pozorovaným u pacientů s mutovaným RAS X MikroRNA jako prediktivní biomarkery u kolorektálního karcinomu Nezávislá validace 96 pacientů léčených cetuximabem 30 pacientů léčených panitumumabem Klinická studie RASMIR Racionální indikace anti-EGFR terapie v první linii léčby pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem a nemutovaným onkogenem KRAS/NRAS na základě molekulárního prediktoru miR-31-5p Akademická klinická studie Masarykův onkologický ústav (Q3/2018) Spolupracujeme na vývoji CE IVD diagnostické soupravy se společností Generi Biotech MikroRNA jako prediktivní biomarkery u kolorektálního karcinomu metastatický kolorektální karcinom nemutovaný KRAS/NRAS režim FOLFOX + vyšetření miR-31-5p + CETUXIMAB + BEVACIZUMAB + PANITUMUMAB VYSOKÁ NÍZKÁ VYUŽITÍ MIKRORNA V DIAGNOSTICE A LÉČBĚ KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU MIKRORNA JAKO TERAPEUTICKÉ CÍLE MODELOVÁ STUDIE 3 Charakterizace miR-215 jako terapeutického cíle u kolorektálního karcinomu Merhautova, Demlova, Slaby, Frontiers in Pharmacology, 2016 Iorio et al., EMBO Mol Med, 2012 Supresorová miRNA Substituční terapie Merhautova, et al., Physiol. Res., 2016 MikroRNA jako terapeutické cíle u kolorektálního karcinomu 33 MiR-215 expression levels are decreased in colorectal cancer tumor tissue tumor tissue × non-tumor colonic tissue (paired samples) 25 miRNAs, P < 0.0001 miR-215 Faltejskova et al.,J Cell Mol Med 2012 MODEL STUDY 3 MiR-215 IS A POTENTIAL THERAPEUTIC TARGET IN CRC Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 MiR-215 as therapeutic target in colorectal cancer Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 MiR-215 is involved in regulation of CRC cell proliferation ↑ miR-215 ↓ miR-215 ↓ miR-215 ↑ miR-215 ↓ miR-215 ↑ miR-215 ↑ miR-215↓ miR-215 Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 ↑ miR-215↑ miR-215 ↑ miR-215 ↑ miR-215 ↑ miR-215 MiR-215 induces G2-arrest and increases apoptotic rate in CRC cells MiR-215 attenuates migration of CRC cells in vitro Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 MiR-215 inhibits tumor growth in vivo HCT-116 MiR-215 inhibits tumor growth in vivo MiR-215 inhibits tumor metastatic spread in vivo EREGHOXB9 PROLIFERATION APOPTOSIS CELL CYCLE WHAT ARE miR-215 TARGET mRNAs??? What is the mechanism of miR-215 anti-cancer functioning? MIGRATION P < 0,001 P < 0,001 Luciferase assay 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 H2,5D mock 48h H2,5D miR-215 48h HOXB9 Relativeluciferaseactivity 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 mock 215 EREG Relativeluciferaseactivity Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 Are EREG and HOXB9 targeted by miR-215? MiR-215 is a tumor suppressor involved in colorectal cancer pathogenesis and potential therapeutic target for replacement microRNA therapy. HOXB9 (TF) EREG (ligand) EGFR (receptor) hyperactivated in colorectal cancer PROLIFERATION, SURIVAL,INVASION ↓ miR-215 Vychytilova et al, Oncogenesis, 2017 Is miR-215 tumor suppressive miRNA in colorectal cancer? EMT Development of innovative polymeric delivery system for miR-215 mimic in collaboration with Institute of Macromolecular Chemistry Czech Academy of Science (dr. Laga) Two types of polymeric systems are currently tested in vivo MikroRNA jako terapeutické cíle Miravirsen, anti-miR-122 MODELOVÁ STUDIE 1 DXscore založené na sérových miRNA umožňují časnou a neinvazivní detekci kolorektálního karcinomu a může tak zvýšit počet pacientů diagnostikovaných v dobře léčitelných časných stádiích onemocnění MODELOVÁ STUDIE 2 Tkáňová mikroRNA miR-31-5p umožňuje predikovat léčebnou odpověď na cílenou léčbu proti receptoru EGFR a může tak příspět ke zlepšení léčebných výsledků u pacientů s metastatickým stádiem onemocnění. MODELOVÁ STUDIE 3 Cílení miRNA představuje slibný terapeutický přístup pro pacienty s kolorektálním karcinomem, přičemž řada miRNA terapeutik je v různých stádiích preklinického vývoje a některá z nich již vstoupila do testování klinického (fáze 1/2). VYUŽITÍ MIKRORNA V DIAGNOSTICE A LÉČBĚ KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Molecular Oncology II (O. Slaby) group THANK YOU! CEITEC Mgr. Hana Nosková, PhD Mgr. Martina Rédová, PhD Mgr. Jiří Šána, PhD Mgr. Kamila Součková, PhD Mgr. Jaroslav Juráček, PhD Mgr. Petra Vychytilová-Faltejsková, PhD Tina Catela Ivković , PhD Mgr. Elleni Michu Mgr. Soňa Klusová MVDr. Martina Vodínská Ing. Dana Knoflíčková DEPT. OF PATHOLOGY doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D. MUDr. Marta Ježová, Ph.D. MUDr. Zdeněk Pavlovský, Ph.D. Dr. Massimo Negrini University of Ferrara Prof. George Calin MD Anderson Cancer Center Dr. Markus Kretz University of Regensburg Prof. Klaus Jung Charite, Berlin