Význam molekulární patologie pro účely precizní onkologie Slabý Ondřej Ústav patologie, Fakultní nemocnice Brno Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita 3,2 miliard jednotek DNA kódu: • 127 knih • 1000 stran na knihu • cca 25000 znaků na stranu Informační obsah lidského genomu Genom (3,2 Gbp) – 127 knih Exom (30-40 Mbp) – 2,5 knihy (23 000 genů, 180 000 exonů) Interindividuální variabilita – 1 kniha (0,1-0,4% genomu) 500-genový panel – 40 stran (kapitola o nádorové biologii) Jeden gen – <1/10 strany Informační obsah lidského genomu Akumulace genetických změn vedoucí ke vzniku nádoru Maligní transformace buněk je důsledek akumulace genetických změn Doprovodné (passenger) mutace nejsou kauzálně zapojené do patogeneze nádoru Řídící (driver) mutace jsou kauzálně zapojeny do maligního fentotypu a představují selekční výhodu Počet mutací v nádorovém genomu je ohadován na 10 000 passenger mutací 5-10 driver mutací 1-2 “actionable” (klinicky-relevantních) mutací Stratton, M.R. (2013) EMBO Mol Med. 5(2):169-72. Typy genetických změn v nádorovém genomu Nepoškozený chromozom Gen Bodové mutace* Inzerce a delece Variabilita v počtu kopií genů Přestavby (fúzní geny) * mutace nebo varianta? historické zvyklosti versus jasná názvoslovná pravidla Stratton, M.R. (2013) EMBO Mol Med. 5(2):169-72. Typy genetických změn v nádorovém genomu – bodové mutace Bodové mutace (SNV*) Záměna jedné báze v sekvenci DNA Klinicky významné příklady EGFR T790M: rezistence k inhibitorům EGFR EGFR L858R or L861Q: citlivost k inhibitorům EGFR BRAF V600E: citlivost k inhibitorům BRAF * SNV = single nucleotide variation Typy genetických změn v nádorovém genomu – inzerce/delece Inzerce a delece (indels) Genové inzerce a delece (1-40 parů bází) Klinicky významné příklady EGFR delece v exonu 19: citlivost k inhibitorům EGFR Typy genetických změn v nádorovém genomu – variabilita v počtu kopií genů Variabilita v počtu kopií genů (CNV*) Amplifikace nebo delece jednotlivého genu nebo chromozomální oblasti amplifikace onkogenu delece nádorového supresoru Klinicky významné příklady Amplifikace HER2: citlivost k herceptinu u karcinomu prsu Delece CDKN2A: společně s inaktivací Rb je spojena s citlivostí k CDK4/CKD6 inhibitorům * CNV = copy number variation Typy genetických změn v nádorovém genomu – přestavby (fúzní geny) Přestavby (fúzní geny) Klinicky významné příklady ALK-EML4: karcinom plic, citlivost k ALK inhibitoru TMPRSS-ERG: u karcinomu prostaty RET fusions: citlivost k RET inhibitorům u karcinomu plic a štítné žlázy Chromozomové zlomy vedou ke kolokalizaci 2 genů nebo jejich částí, ktere normálně neleží blízko sebe Inter-nádorová variabilita Prevalence somatických mutací u různých nádorových onemocnění Různé typy nádorů jsou charakteristické různou mírou genomové nestability a počtem somatických mutací v nádorovém genomu! CZ/ONCO/0917/0113 LB Alexandrov et al. Nature 1-7 (2013) doi:10.1038/nature12477 Intra-nádorová variabilita Diverzita driverových mutací u jednoho typu nádorového onemocnění a koncept MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE NÁDORŮ Histopatologicky definovaná diagnostická jednotka = skupina nemocí s rozdílnou molekulární patologií například EGFR-řízený karcinom plic ALK-řízený karcinom plic Garraway LA. Journal of Clinical Oncology, 31(15), 1806-1814 (2013) Catherine B. Meador et al. Clin Cancer Res 2014;20:2264-2275 Histopatologicky definovaná diagnostická jednotka = skupina nemocí s rozdílnou molekulární patologií, a také s rozdílnou citlivostí k různým léčebným modalitám například ALK-řízený karcinom plic = CRIZOTINIB EGFR-řízený karcinom plic = ERLOTINIB Intra-nádorová variabilita Diverzita driverových mutací u jednoho typu nádorového onemocnění a koncept MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE NÁDORŮ Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S et al. The New England Journal of Medicine, 366(10), 883-892 (2012) Intra-individuální variabilita nádorového genomů - intratumorální heterogenita Mutační topografie primárního tumoru a metastáz • Sekvence nádorového genomu je vždy “momentkou” • Dědičné (zárodečné, germline) varianty odražejí paternální a maternální variabilitu • Další somatické mutace se akumulují v průběhu života (životní styl, prostředí,…) • Driverové mutace řídí nádorový růst, passenger mutace nejsou kauzální • Vznikají další mutace zpusobující diverzitu nádorových buněk • Některé klony nádorových buněk tak mohou být oslabeny • …a být citlivé k protinádorové léčbě • Jiné klony budou rezistentní a stanou se příčinou rozvoje relapsu onemocnění… Zárodečné varianty Primární nádor Somatické varianty Metastázy Léčba Nádorové genomy nejsou statické. U nádorů jeden genomový “snímek” nemusí stačit. Relaps Nadorový genom je extrémně dynamickou entitou CZ/ONCO/0917/0113 Histopatologická diagnostika nádorů získává molekulární rozměr Molekulární rozměr nádorové diagnostiky a narůstající počet cílených protinádorových léčiv zvyšuje komplexitu léčebných strategií Karcinom prsu Karcinom plic Karcinom prostaty Melanom CLL Molekulární rozměr nádorové diagnostiky a narůstající počet cílených protinádorových léčiv zvyšuje komplexitu léčebných strategií NEMALOBUNĚČNÝKARCINOMPLIC 1x 4x Hematologické malignity v čase - důsledky molekularizace PŘED 60 LETY Onemocnění krve PŘED 50 LETY Leukémie Lymfomy PŘED 40 LETY Chronická leukémie Akutní leukémie Pre-leukémie Indolentní lymfom Agresigní lymfom DNES 40 podtypů leukémie 50 podtypů lymfomů V současnosti je vývíjeno přibližně 250 nových léčiv Pětileté přežití vzrostlo na více než 70% NTRK inhibitor larotrectinib prototyp tumor-agnostického přístupu ve vývoji nových léčiv NTRK inhibitor larotrectinib/entrectinib u různých diagnóz s fůzním genem NTRK Odpověď na NTRK inhibitor larotrectinib u dětí a dospělých Molekulárně-onkologická indikační komise (Molecular Tumor Board) na Klinice dětské onkologie, FN BRNO, Ústav patologie FN Brno, spolupráce CEITEC MU Biopsie nádoru Informovaný souhlas Vysoce rizikový/ refrakterní solidní tumor Bukální stěr Odběr krve Sekvenování zárodečného a nádorového exomu, Detekce fúzních genů Analýza dat + příprava protokolů Molekulárněonkologická komise (jednou měsíčně) obvykle 6-7 pacientů Actionable variany Drug repurposing Kombinovaná léčba Schválení terapeutického plánu Individualizovaná léčba 3-4 týdny Tkáňový vzorek -resekát/biopsie FFPE – DNA/exome, RNA/fúze Nativní tkáň – RNA/transkriptom Periferní krev – DNA/exomIzolace DNA PBMC (zárodečné varianty) Nádorá tkáň (somatické var.) Izolace RNA / kontrola kvality 2 X celoexomové sekvenování zárodečná DNA / nádorová DNA Illumina TruSeq Exome Kit Ilumina NextSeq 500 Bioinformatická analýza Analýza transkriptom Affymetrix GeneChip/ RNAseq MOLELULÁRNÍ CHARAKTERIZACE TUMORU PRO POTŘEBY MTB – FN BRNO KDO / CEITEC MU DNA – EXOM/METYLACE RNA – FÚZNÍ GENY/TRANSKRIPTOM Bioinformatická analýza INTEGRACE VÝSTUPŮ JEDNOTLIVÝCH ÚROVNÍ CHARAKTERIZACE NÁDORU A PACIENTA PŘÍPRAVA KOMPLEXNÍCH VÝSTUPNÍCH PROTOKOLŮ PRO POTŘEBY MOLEKULÁRNĚ ONKOLOGICKÉ INDIKAČNÍ KOMISE KDO, FN BRNO Analýza fúzních genů TruSight RNA Pan-Cancer Panel 1385 transkriptů Metylační profily -mozkové nádory TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit - 3,3 mil. CpGs míst Jednonukleotidové varianty, indels –klasifikace dle klinické relevance Mutační nálož (TMB) Metylační profily – např. MBL SHH Fúzní geny, deregulované geny/dráhy Molekulární taxonomie MBL Turnaround time: 3-4 týdny Kapacita: 8-12 pac./měs. Klasifikace variant MATCH trial a MSKCC Klasifikace variant používaná v naší studii Celkový počet readů Median target coverage Coverage mean Coverage 20x (%) Medián 144.763.142 95 173,2 90,8 Průměr 158.127.573,4 108,8 179,7 90,4 Výsledky – soubor pacientů Všechny sekvenační běhy prošly kvalitou kontroly a dosáhly požadovaného pokrytí Od 08/2016 - 08/2018 jsme provedli analýzu germinálního/somatického exomu a analýzu fúzních genů u celkem 109 dětí 42 tumorů CNS 11 Ewingových sarkomů 10 rhabdomyosarkomů 10 neuroblastomů 9 sarkomů z měkkých tkání 7 osteosarkomů 20 dalších typů solidních tumorů • Actionable varianty (level I a II) byly nalezeny u celkem 29 pacientů (27 %) • Klinicky významná fúze byla pomocí sekvenování RNA nalezena u 25 pacientů (23%), přičemž 7 z těchto fúzí bylo terapeuticky cílitelných. • Kombinací WES a komplexní analýzy fúzních genů se podařilo nalézt terapeuticky ovlivnitelnou variantu celkem u 36 pacientů (33%). • U všech tumorů byla stanovená mutační nálož (Tumor Mutational Burden, TMB) a u tumorů s TMB>10 mut/Mb (celkem 8 - 7%) také mutační podpis (mutational signature). • Molekulárně řízená cílená léčba (či její kombinace) byla podána u celkem 40 pacientů (37%). Germinální varianty: Např. pac s GBM - potvrzen Constitutional mismatch repair-deficiency syndrome (AR dědičnost) - 2 zděděné varianty v PMS2 + mut.nálož 175 mutací/Mb - nivolumab Mimo to nalezeny ještě prognosticko/diagnostické: H3F3A K27M, HIST1H3B K27M- DIPGs Výsledky molekulárního vyšetření Výsledky celoexomového sekvenování: ukázka protokolu Výsledky celoexomového sekvenování: ukázka protokolu Výsledky celoexomového sekvenování: mutační nálože (TMB) submitted Tekutá biopsie : aktuální stav Především u tumorů CNS z mozkomíšního moku QIAseq Targeted DNA Panel - Human Lung Cancer Panel (72 genů) Zavádíme systém Avenio Roche, droplet digital PCR pro monitoring (H3K27M) submitted 34 Patient case 3: Secondary glioblastoma Patient presentation, initial diagnosis and treatment • Diagnosis: bifocal invasive colon adenocarcinoma (G2, pT2, pN1a, pM0, IIIA) • Mutations: KRAS • Treatment: hemicolectomy + FOLFOX 1. CCR OS 58 months …but a very strange tumour for a child... Jan 2014 • Male, 14 years old Patient profile Case courtesy of Jaroslav Sterba, University Hospital Brno, Czech Republic. CMMR-D: constitutional mismatch repair deficiency syndrome; TMB: tumour mutational burden. 35 Patient case 3: Secondary glioblastoma Constitutional mismatch repair-deficiency syndrome (CMMR-D) • Syndrome related to changes in MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 or EPCAM genes • Frequent and early occurence of colon cancer, haematological malignancies and brain tumors (malignant gliomas, high grade glioma) • Typically TMB-high Germinal exome sequencing identified biallelic CMMR-D: • Both parents: healthy carriers • Both sons: composed heterozygotes Gene Variant PMS2 c.2521delT/p.W841fs c.2T>A/p.M1K MET c.2975C>T/p.T992I NTRK1 c.1792C>T/p.H598Y c.1820G>T/p.G607V MYC c.1213G>T/p.A405S Medical background CMMR-D: constitutional mismatch repair deficiency syndrome; MRI: magnetic resonance imaging; PNET: primitive neuroectodermal tumour. 36 Patient case 3: Secondary glioblastoma PNET component Glial component Diagnostic MRI Histopathology Jan 2014 Mar 2017 Based on proven bCMMR-D follow-up, paradigm changed to whole body MRI Diagnostic work-up on proven CMMR-D Secondary malignancy glioblastoma diagnosed 37 Patient case 3: Secondary glioblastoma MRI scans revealed early progression • Subtotal tumour resection with early postoperative progression • Radiotherapy + concomitant alkylating chemotherapeutic agent /metronomic schedule/ MRI: magnetic resonance imaging. Jan 2014 Treatment decision and early progression April 2017Mar 2017 FFPE: formalin-fixed paraffin-embedded. . 38 Patient case 3: Secondary glioblastoma Somatic exome analysisGermline exome analysis • DNA purified from FFPE sample • Whole dataset (exome) evaluated + • Variants were filtered on the FoundationOne® gene set (315 genes) • DNA purified from peripheral blood • Whole dataset (exome) evaluated Exome analysis methods: TruSeq® Exome kit, NextSeq™ 500 (Illumina®) Genomic profiling performed • MSI-high • TMB-high (384.23 / MB) MSI: microsatellite instability; TMB: tumour mutational burden. . 39 Patient case 3: Secondary glioblastoma Gene Variant PIK3CA c.1360G>T/p.D454Y c.2422C>T/p.R808W c.2746C>T/p.R916C PIK3R1 c.37G>A/p.G13R c.418C>T/p.R140W PDGFRA c.863A>G/p.Y288C c.1715A>C/p.Y572S c.3265C>A/p.L1089M PDGFRB c.2765G>A/p.R922H KDR c.3352C>T/p.R1118X c.2830C>T/p.R944X Gene Variant BRCA2 c.52C>T/p.R18C c.5292dupA/p.S1764fs c.6952C>T/p.R2318X DNMT3A c.2162C>T/p.A721V c.1679G>A/p.R560H c.1492G>A/p.V498I c.233C>T/ p.S78F TP53 c.448C>T/p.R150W RET c.2437C>T/p.R813W PTEN c.180G>T/p.K60N c.922C>T/p.R308C Somatic mutations in glioblastoma sample * EudraCT number 2014-003388-39. TMB: tumour mutational burden. . 40 Patient case 3: Secondary glioblastoma Based on high TMB: immune checkpoint inhibitor (anti PD-1) + autologous dendritic cell vaccine* producing IL-12 + valproic acid + metronomic low dose alkylating agent Molecularly-guided therapy Prior immunotherapy 3 months 6 months 18 months FLT-PET: fluoro-L-thymidine-positron emission tomography; MRI: magnetic resonance imaging; PET: positron emission tomography. 41 Patient case 3: Secondary glioblastoma Patient follow-up Prior immunotherapy Recent follow-up (week 73) • Gradual response on FLT-PET MRI • Decreasing tumour size and PET avidity • Able to attend school (outpatient treatment) • Karnofsky 90 Souhrn • Od 08/2016 - 08/2018 jsme provedli analýzu germinálního a somatického exomu, a komplexní analýzu fúzních genů u celkem 109 dětí • Actionable varianty (level I a II) byly nalezeny u celkem 29 pacientů (27 %) • Klinicky významná fúze byla pomocí sekvenování RNA nalezena u 25 pacientů (23%), přičemž 7 z těchto fúzí bylo terapeuticky cílitelných. • Kombinací WES a komplexní analýzy fúzních genů se podařilo nalézt terapeuticky ovlivnitelnou variantu celkem u 36 pacientů (33%). • U všech tumorů byla stanovená mutační nálož (Tumor Mutational Burden, TMB) a u tumorů s TMB>10 mut/Mb (celkem 8 - 7%) také mutační podpis (mutational signature). • Molekulárně řízená cílená léčba (či její kombinace) byla podána u celkem 40 pacientů (37%). • Při verifikaci nezávislou FDA-approved metodou jsme dosáhli 100% shody v identifikaci actionable mutací, a vysoké korelace TMB Molecular Oncology II (O. Slaby) group THANK YOU! CEITEC Mgr. Hana Nosková, PhD Mgr. Martina Rédová, PhD Mgr. Jiří Šána, PhD Mgr. Kamila Součková, PhD Mgr. Jaroslav Juráček, PhD Mgr. Petra Vychytilová-Faltejsková, PhD Tina Catela Ivković , PhD Mgr. Elleni Michu Mgr. Soňa Klusová MVDr. Martina Vodínská Ing. Dana Knoflíčková DEPT. OF PATHOLOGY doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D. MUDr. Marta Ježová, Ph.D. MUDr. Zdeněk Pavlovský, Ph.D. Dr. Massimo Negrini University of Ferrara Prof. George Calin MD Anderson Cancer Center Dr. Markus Kretz University of Regensburg Prof. Klaus Jung Charite, Berlin DEPARTMENT OF PEDIATRIC ONCOLOGY, UH BRNO PROF. MUDr. JAROSLAV STERBA, PH.D.