Vítězslav Bryja Kmenové buňky a hierarchická organizace tkání demonstrovaná na příkladu epitelu střeva Pro zájemce o tuto problematiku: Kmenové buňky Dr. Jiří Pacherník: Bi7575 Biologie kmenových buněk Kmenové buňky •tkáňově specifické •embryonální kmenové (embryonic stem cells, ES) Základní vlastnosti: a) sebeobnova (selfrenewal) b) multipotence – schopnost dávat vznik dalším buněčným typům blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Příprava myších embryonálních kmenových buněk: den 0 (2.5% trypsin) den 6 den 7 vymytí blastocysty ~den 11 ~den 17 (další cykly trypsinizace) ~den 12 zamražení(0.25% trypsin) trypsin trypsin Nutná přítomnost proteinu LIF (leukemia inhibitory factor) a podpůrné vrstvý MEF (mouse embryonal fibroblast) buněk Nobelova cena 2007 Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies za „principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells“ Využití myších ES buněk pro transgenezi Využití myších ES buněk pro transgenezi Science. 1998 Nov 6;282(5391):1145-7 Rozdíly mezi myšími a lidskými ES buňkami Naive and primed pluripotency states of embryos and stem cells. Tim Pieters, and Frans van Roy J Cell Sci 2014;127:2603-2613 Naive and primed pluripotency states of embryos and stem cells. ICM cells from mouse blastocysts and their in vitro counterpart, mESCs, represent the ground (naive) state of pluripotency. These naive stem cells express E-cadherin (E-cadh) both in vivo and in vitro. After implantation, epiblast cells are organized into a cup-shaped epithelium, from which mEpiSCs can be isolated. Both mEpiSCs and hESCs depend on FGF2+activin+Nodal signaling and represent primed states of pluripotency. Also, primed SCs – called FAB-SCs – can be isolated from blastocysts when treated with FGF2, activin and the glycogen synthase kinase 3 inhibitor BIO. Pluripotency states display plasticity and, by providing appropriate signals when, e.g. using specific inhibitors (2i) and cytokines, different types of primed stem cell (i.e. mEpiSCs, FAB-SCs and hESCs) can be converted to naive stem cells. Images of the human blastocyst and hESC colony are courtesy of Petra De Sutter and Katrien De Mulder (both at Ghent University), respectively. embryonálnívývoj blastocysta dospělá tkáň In vivo In vitro vyvíjející se tkáň (orgán) 8h embryo ICM 2d embryo circulation Indukované kmenové buňky - iPSCs iPSCs: Buňky s vlastnostmi embryonálních kmenových buněk, které byly připraveny tzv. přímým reprogramováním kombinací transkripčních faktorů Oct3/4 Sox2 c-Myc Klf4 Indukované kmenové buňky - iPSCs Indukované kmenové buňky - iPSCs Direct reprogramming – přímé přeprogramování Proces, kterým lze s použitím kombinace transkripčních faktorů (nebo inhibitorů/aktivátorů signálních drah) změnit jeden buněčný typ v druhý. Např. gliové buňky v dopaminergní neurony: ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Kmenové buňky K čemu jsou, jak vypadají a jak jsou regulovány kmenové buňky v dospělém organismu? K čemu jsou tkáňově specifické kmenové buňky? 1) K zajištění homeostázy • v lidském organismu se průběžně obnovují celé tkáně – např. vlasové kořínky (doba „života“ 3-4 roky), epitel střeva, epitel plic, krevní buňky nebo játra 2) K zajištění procesu hojení a regenerace Časy – délka „života“ buněk Využití přechodného zvýšení 14C z dob studené války (Jonas Frisén, Karolinska) Nervové buňky mozkové kůry Jak zjistit délku „života“ buněk/intenzitu obnovy tkání? (Ne)Dynamika srdečních svalových buněk Kde jsou tkáňově-specifické kmenové buňky a jak vypadají? Vlastnosti tkáňových kmenových buněk Kmenové buňky jednotlivých tkání a typů se vzájemně liší – co se týče např. schopnosti proliferovat nebo naopak zůstávat zcela „inaktivní“ (quiescent) V biologii kmenových buněk mají zásadní význam dráhy kontrolující embryonální vývoj – např. Wnt, FGF, Hedgehog, Notch atd. Kmenové buňky zodpovědné za obměnu tkání v rámci homeostázy se mohou lišit od těch, které se aktivují v procesu regenerace Kmenové buňky jsou pod kontrolou svého mikroprostředí – tzv. niky kmenových buněk (stem cell niche) Nika kmenových buněk – stem cell niche kostní dřeň Prostředí kmenových buněk (stem cell niche) Reya & Clevers 2005, Nature Komplexita „stem cell niche“ S využitím klíčových objevů prof. Hanse Cleverse (Utrecht) a jeho animací Epitel střeva jako modelový příklad funkce tkáňových buněk a hierarchické organizace tkání Kmenové buňky střevního epitelu Moore & Lemischka, Science, 2006 Kmenové buňky střeva (2006) střevní epitel 2006: kmenové buňky definovány jako „label-retaining cells“ - tj. jako buňky, které se nedělí Hon za dospělými kmenovými buňkami – Lgr5 střevní epitel – jak prokázat, že je buňka kmenová (Barker et al., Nature, October 2007) A. Příprava transgenní myši č. 1 za účelem zjistit, kde je nový potenciální stem cell marker exprimován (in vivo expression profiling). Lgr5 je exprimován specificky v buňkách ve spodní části krypty. Cre-Lox systém: Lineage tracing • Lineage tracing: genetické označení buněčného potomstva (progeny) konkrétního buněčného typu • Tkáňově specifický promotor – regulační oblast genu, aktivní pouze v konkrétním buněčném typu • Cre-recombináza – enzym schopen vyštěpit úsek mezi dvěma LoxP sekvencemi • Cre-ERT2 – verze Cre-recombinázy indukovatelná 4-hydroxy-tamoxifenem (4- OHT) • Rosa26 locus – úsek genomu, aktivní ve všech buněčných typech • LacZ – gen kódující beta-galaktosidázu, jejíž aktivita se dá vizualizovat pomocí substrátu X-Gal (modré zbarvení) střevní epitel – jak prokázat, že je buňka kmenová (Barker et al., Nature, October 2007) B. Příprava transgenní myši 2, 3 a 4 za účelem zjistit, co všechno vzniká z Lgr5pozitivních buněk (Lgr5+ lineage tracing). Lgr5 pozitivní buňky dávají vzniknout všem částem buněčného epitelu. Hon za dospělými kmenovými buňkami střevní epitel –D. Závěr: Kmenové buňky epitelu tlustého i tenkého střeva jsou protáhlé, dříve nepovšimnuté buňky, v relativní pozici 1´, 2´ a 3´od spodu krypty. Hon za dospělými kmenovými buňkami Jsou si kmenové buňky rovnocenné? Lineage tracing pomocí systému Confetti • Čtyři LoxP sekvence ohraničující geny pro čtyři fluorescenční proteiny GFP, YFP, RFP a CFP • Cre-recombinázy náhodně štěpí mezi dvěma LoxP místy • Každá buňka a její potomstvo, ve které proběhne rekombinace se obarví zeleně, žlutě, červeně a modře Stem cell competition - movie Stem cell niche v epitelu střeva Stem cell niche v epitelu střeva Kondicionální/tkáňově specifický knockout genu Stem cell niche v epitelu střeva Panetovy buňky jako „niche“ kmenových buněk střeva Organoidy C. Lgr5 pozitivní buňky in vitro dávají vzniknout kompletní villus-crypt struktuře in vitro (Doposud se to s žádnými jinými buňkami nepodařilo) Organoidy Organoidy Organoid je miniaturizovaná a zjednodušená verze orgánu vyráběná in vitro ve třech rozměrech, která navíc vykazuje realistickou mikroanatomii. Organoid je odvozen z jedné nebo několika buněk z tkáně, embryonálních kmenových buněk nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk, které se mohou samoorganizovat ve třídimenzionální kultuře díky schopnosti sebeobnovy a diferenciace. Technika růstu organoidů se od počátku roku 2010 rychle zlepšila a byla jmenována The Scientist jako jeden z největších vědeckých pokroků v roce 2013. (wikipedie) Organoidy Organoidy Mozkové organoidy - minibrains Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA (September 2013). "Cerebral organoids model human brain development and microcephaly". Nature. 501 (7467): 373–9. Využití organoidů pro buněčné terapie poruch funkce střeva – např. cystická fibroza Moore & Lemischka, Science, 2006 Kmenové buňky střeva (2006) Co tedy jsou „labelretaining cells“? 2006: kmenové buňky definovány jako „label-retaining cells“ - tj. jako buňky, které se nedělí Nedělící se zásobárna buněk (Dll1+) pro případ poškození a regenerace: Nedělící se zásobárna buněk pro případ poškození a regenerace: a, The intestinal epithelium follows the distinct contours of villus–crypt units in the intestine. b, Normally, Lgr5-expressing stem cells (Lgr5+) lead to the production of precursor cells that further differentiate into the various types of crypt epithelial cell. Buczacki et al.1 report that precursors of one type of differentiated intestinal cell, Paneth cells, can persist for several weeks in a quiescent state before maturing into Paneth cells. Intriguingly, these quiescent precursors can revert back into Lgr5+ stem cells following crypt damage. Role kmenových buněk v rozvoji nádoru nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň tvorba nádoru regenerace nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 Vztah „kmenovosti“ a „nádorovosti“ Teratomy nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 1-5 5 a více Je to pravda? Vztah „kmenovosti“ a „nádorovosti“ Experimentální důkaz: Tkáňově specifický knockout nádorového supresoru APC Vznik malých adenomů, které neprogradují Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Nekontrolovaná aktivace kmenových buněk má fatální následky Rychlý vznik adenomů a nádorů Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Typové otázky Jaké jsou vlastnosti a možné využití embryonálních kmenových buněk? Jak se připravují embryonální kmenové buňky? Jaké jsou rozdíly mezi myšími a lidskými ES buňkami? Popiš přípravu a využití indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC) Uveď alespoň tři rychle se obnovující buněčné typy (čas obnovy do 14 dnů) Uveď alespoň tři pomalu se obnovující buněčné typy (čas obnovy více než půl roku) Definuj niku kmenových buněk a uveď konkrétní příklad Jak lze charakterizovat kmenové buňky epitelu střeva? Popiš krátce homeostázu a sebeobnovu střevního epitelu Co jsou to organoidy? Jakým způsobem lze prokázat, že buňka je kmenová? Co je to „lineage tracing“? Popiš přípravu tkáňově specifického knockoutu s využitím systému Cre-Lox Nádorová kmenová buňka a jejich využití v terapiích Cancer stem cell based therapy - naděje pro nemocné s nádorem slinivky? • Adenokarcinom slinivky Pancreatic adenocarcinoma čtvrtý nejčastější důvod úmrtí u pacientů nádorových onemocnění • Medián přežití – 4-6 měsíců • 5leté přežití – 1 % • Léčba gemcitabinem- nezabírá gemcitabine gemcitabine Terapie budoucnosti? Factor X gemcitabine Terapie budoucnosti? Klasické morfogenetické dráhy (Wnt, Hh, Notch a další) regulují regeneraci, tkáňové specifické kmenové buňky i nádory • legenda k obrázku: Klasické morfogenetické dráhy (Wnt, Hh, Notch a další) regulují regeneraci, tkáňové specifické kmenové buňky i nádory