Vítězslav Bryja Buněčné regulace I Základní morfogenetické dráhy Vlastnosti buněk v průběhu dynamické homeostázy Rychlé buněčné dělení Dynamické změny diferenciačního stavu (cell fate) Intenzivní migrace Změny tvaru a velikosti buňky Schopnost odpovědi na poškození = Vlastnosti buněk v průběhu embryonálního vývoje Role signálních drah v regulaci dynamických procesů a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Hlavní signální dráhy – velká pětka Transkripční faktory Klíčové molekulární komponenty vývoje Wnt (Wingless/Int) Wingless Int-1 WNT Roel Nusse Wnt (Wingless/Int) - rodina ligandů - 19 genů pro proteiny Wnt u člověka a u myši - extracelulární proteiny modifikované glykosylací a palmitoylací - působí na krátké vzdálenosti, váží se k extracelulární matrix - pouze u mnohobuněčných živočichů kanonická dráha /závislá na β-kateninu/ (např. Wnt-1 or Wnt-3a) nekanonická dráha /na β-kateninu nezávislá/ (např. Wnt-5a) Wnt/β-kateninová dráha (= kanonická dráha) - indukuje duplikaci tělní osy u Xenopus - indukuje transformaci buněčné linie odvozené od lidských prsních epiteliálních buněk C57mg - signál přenášen přes translokaci -kateninu do jádra Speciální buněčný aparát pro sekrece Wnt proteinů Kanonická signální dráha Wnt Kanonická signální dráha Wnt - legenda k obrázku: Frizzled – klíčový receptor signálních drah Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt Lrp5/6 – stěžejní ko-receptor kanonické signální dráhy Wnt Destrukční komplex pro beta-katenin Destrukční komplex A working model for the destruction complex. (1) Initially, the destruction complex contains Axin, GSK3, CK1 and APC (with the 15 aa and 20 aa repeat regions shown). The complex contains other components such as PP2A, which are not shown here. (2) Catenin enters the complex by binding Axin and potentially the APC 15 aa repeats. This positions the N-terminus of -catenin near CK1 and GSK3. (3) CK1 phosphorylates catenin at Ser45. (4) GSK3 phosphorylates -catenin at, successively, Thr41, Ser37 and Ser33. (5) The 20 aa repeats, particularly repeat 3, are phosphorylated by a CK1 (and possibly GSK3) which greatly increases their affinity for -catenin. The binding of a phosphorylated 20 aa repeat to -catenin displaces Axin from -catenin. (6) -TRCP1 binds the phosphorylated N-terminus of -catenin, causing the ubiquitination of -catenin by an E2 ligase. APC is then either desphosphorylated within the complex, allowing the ubiquitinated -catenin to leave the complex, or the ubiquitinated -catenin bound to APC leaves the complex and is separated from APC at the proteasome. The complex then returns to Step 1 - legenda k obrázku destrukčního komplexu: Kanonická signální Wnt dráha - video Geny pod kontrolou Wnt dráhy v kmenových buňkách Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami • Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami • Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy • Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě • R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy Vazba R-spondinu na LGR5 aktivuje Wnt dráhu Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami • Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy • Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě • R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy • Wnt signalizace jako klíčová složka komunikace mezi kmenovými buňkami a jejich nikou Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami • Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy • Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě • R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy • Wnt signalizace jako klíčová složka komunikace mezi kmenovými buňkami a jejich nikou • Inhibitory Wnt dráhy - RNF43/Znrf3 – jako cíle kontrolované R-spondiny Vazba R-spondinu na LGR5 aktivuje Wnt dráhu … … díky internalizaci E3-ubikvitin ligáz ZNRF3/RNF43 RNF43 je specializovaná E3 ubikvitin ligáza pro Frizzled (FZD) Propojení mezi Wnt dráhou a kmenovými buňkami • Lgr5 jako cílový gen Wnt dráhy • Lgr5 jako marker kmenových buněk ve střevě • R-spondin jako ligand Lgr5 a jako aktivátor Wnt dráhy • Wnt signalizace jako klíčová složka komunikace mezi kmenovými buňkami a jejich nikou • Inhibitory Wnt dráhy - RNF43/Znrf3 – jako cíle kontrolované R-spondiny • R-spondin jako klíčový faktor potřebný pro růst organoidů Familiární adenomatózní polypóza zkráceně FAP, je autozomálně dominantní dědičné onemocnění tlustého střeva s výskytem četných (tisíce) polypů a adenomů, které později malignizují. Onemocnění způsobuje zmutovaný gen APC Kmenové buňky, Wnt a nádory Kmenové buňky, Wnt a nádory Familiární adenomatózní polypóza Role kmenových buněk v rozvoji nádoru nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň tvorba nádoru regenerace nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 Vztah „kmenovosti“ a „nádorovosti“ Teratomy nádorovost ontogeneze blastocysta vyvíjející se tkáň (orgán) dospělá tkáň Počet mutací nutných pro vznik nádoru: 0 1-3 4 a více Je to pravda? Vztah „kmenovosti“ a „nádorovosti“ Experimentální důkaz: Tkáňově specifický knockout nádorového supresoru APC Vznik malých adenomů, které neprogradují Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Nekontrolovaná aktivace kmenových buněk má fatální následky Rychlý vznik adenomů a nádorů Zkřížení s APC flox/flox myšima + tamoxifen Epitelo-mesenchymální přechod (EMT – epithelio-mesenchymal transition) Epiteliální - mezenchymální přechod (EMT) je proces, při kterém epitelové buňky ztratí svoji buněčnou polaritu a adhezi a získají migrační a invazivní vlastnosti, stanou se mezenchymálními. EMT je nezbytný pro četné vývojové procesy včetně tvorby mezodermu a tvorby neurální lišty. EMT se uplatňuje při hojení ran, při orgánové fibróze a při iniciaci metastáz v progresi rakoviny. Beta-catenin se v buňkách vyskytuje ve dvou hlavních „poolech“ – biochemických komplexech 1. Jako součást Wnt signalizace 2. V komplexu s E-cadherinem jako součást „adherens junctions“ Epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) v nádorech Wnt signální dráha určuje předozadní osu i při regeneraci u ploštěnky Typové otázky z této přednášky Načrtni a krátce popiš fungování signální dráhy Wnt/beta- catenin Jak se beta-katenin podílí na procesu epitheliomesenchymální tranzice? Co víš o genu/proteinu APC? Jak funguje R-spondin? Jak je aktivována Wnt dráha v epitelu střeva? Co je to destrukční komplex beta-kateninu a z jakých proteinů se skládá? Co je to epitelo-mesenchymální tranzice (EMT)?