Vítězslav Bryja Buněčné regulace II Základní morfogenetické dráhy – Hedgehog, Notch, BMP a RTK Klíčové molekulární komponenty vývoje Hedgehog dráha • hedgehog (Hh) u octomilky – název „ježek“ podle fenotypu larvy • u savců jsou tři homology: • sonic hedgehog (Shh) • indian hedgehog (Ihh) • desert hedgehog (Dhh) Sonic the Hedgehog The hedgehog gene (hh) was first identified in the fruitfly Drosophila melanogaster in the classic Heidelberg screens of Christiane Nüsslein-Volhard and Eric Wieschaus, as published in 1980. These screens, which led to them winning the Nobel Prize in 1995 along with developmental geneticist Edward B. Lewis, identified genes that control the segmentation pattern of the Drosophila embryos. Schéma Shh dráhy • Sonic hedgehog (SHH) je modifikován oxysterolem a pro sekreci vyžaduje protein Dispatched (Disp) • Shh váže Patched (PTCH), který je za normálních okolností inhibitorem Smoothened (SMO), po vazbě Shh je tato inhibice přerušena • Uvolnění SMO umožňuje aktivaci transkripčních faktorů z rodiny GLI, které se přesouvají do jádra a spouští transkripci • legenda k obrázku: Sonic hedgehog (SHH) is translated as a ~45kDa precursor and undergoes autocatalytic processing to produce an ~20kDa N-terminal signaling domain (referred to as SHH-N) and a ~25kDa C-terminal domain with no known signaling role (1 on figure 5). During the cleavage, a cholesterol molecule is added to the carboxyl end of the N-terminal domain, which is involved in trafficking, secretion and receptor interaction of the ligand. When SHH reaches its target cell, it binds to the Patched-1 (PTCH1) receptor(3). In the absence of ligand, PTCH1 inhibits Smoothened (SMO), a downstream protein in the pathway(4). It has been suggested that SMO is regulated by a small molecule, the cellular localisation of which is controlled by PTCH. PTCH1 has a sterol sensing domain (SSD), which has been shown to be essential for suppression of Smo activity. A current theory of how PTCH regulates SMO is by removing oxysterols from SMO. PTCH acts like a sterol pump and remove oxysterols that have been created by 7-dehydrocholesterol reductase. Upon binding of a Hh protein or a mutation in the SSD of PTCH the pump is turned off allowing oxysterols to accumulate around SMO.This accumulation of sterols allows SMO to become active or stay on the membrane for a longer period of time. The binding of SHH relieves SMO inhibition, leading to activation of the GLI transcription factors(5): the activators Gli1 and Gli2 and the repressor Gli3. The sequence of molecular events that connect SMO to GLIs is poorly understood. Activated GLI accumulates in the nucleus(6) and controls the transcription of hedgehog target genes(7). Schéma Shh dráhy Shh – učebnicový morfogen Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh Shh = jeden z nejlépe popsaných klasických morfogenů (tzv. model francouzské vlajky) – v závislosti na koncentraci morfogenu se spouští odlišné transkripční programy Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Přirozené inhibitory Shh dráhy cyclopamin – teratogenní alkaloid z kýchavice (Veratrum californicum), poprvé identifikován jako látku způsobující kyklopii (= 1 oko) a holoprosencephalii u ovcí Expression of Sonic hedgehog (Shh) protein and the determination of the midline structure in mouse embryo. An SEM micrograph of the frontal view of a mouse embryo (fetal age 7.75 days). Shh protein is green. The dotted line in the micrograph shows the region: Shh antibody reveals Shh. The part that will become the brain (head fold) is followed by the perchordal plate. Shh (in green) that is expressed in the prechordal plate induces midline structure formation. Model mice with Holoprosencephaly due to a Sonic Hedgehog (Shh) deficiency. An SEM micrograph of ten-day old mouse embryos (front view of face). The mouse deficient in Shh gene (right) has no midline structure and only one region (eye position shown in green). Note, too, the lack of nostril separation due to no midline structure. The normal embryo (left), by contrast, has both the eyes and nostrils separated to between the two hemispheres. Hedgehog (Hh) dráha je vázána na primární cilie • Abnormální Hh/Wnt a s nimi spojená onemocnění jsou způsobena defekty ve tvorbě primárních cilií (infertilita, polydaktylie, polycystické ledviny, degenerace retiny). • Hh je přímo vázán na primární cílie. Primary cilia vs. motile (secondary) cilia • struktura 9+2 • pohyblivé • epitely tracheje, vejcovodů, ependym… • struktura 9+0 • nepohyblivé • téměř všechny buňky (www.primary–cilium.co.uk) • solitérní PRIMÁRNÍ SEKUNDÁRNÍ Primární cilie - funkce • délka 2-10µm, průměr 0.25µm • chemo- a osmosenzory • fotoreceptory • mechanoreceptory • obsahují– receptory iontové kanály, efektorové proteiny, transkripční faktory Intraflagelární transport (IFT) • Poprvé popsali Kozminski et al. 1993 pomocí DIC mikroskopie • Za transport zodpovědný kinesin-II – transport k distálnímu „+“ konci a dynein zodpovědný za transport k „-“ konci. • Kif3A, Kif3B (podjednotky kinesinu) KO buňky netvoří cilie. • IFT je zodpovědný za regulaci signálních drah vázaných na primární cilie Primární cilie a Hh signalizace • Je spojen s primárními ciliemi • Ligand se naváže na patch (Ptc) protein, což způsobí zrušení inhibičního efektu Ptc na protein smoothened (Smo), který transdukuje signál přes glioma transkripční faktory (Gli) do jádra, kde řídí expresi Hh genů. (Gli1, Gli2 a Gli3A jsou aktivátory a Gli3R je represor). Hlavním represorem je SuFu. • IFT hraje klíčovou úlohu ve funkci regulace Hh signální dráhy (spojuje Smo a Gli) • Mutace Kif3A a Kif3B mají podobné fenotypy v důsledku ztráty cilie. Primární cilie a Hh signalizace – změny Gli Neural stem cells in the mouse forebrain SVZ, like other adult stem cells, produce lineage-restricted progenitors and respond to SHH. (A) In the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles (LVs), neural stem cells (NSCs; blue) self-renew or divide asymmetrically to generate transit-amplifying cells (TACs, green), progenitors that proliferate and give rise to proliferating neuroblasts (NBs, magenta) that migrate away from the SVZ via the rostral migratory stream (RMS) to the olfactory bulb (OB). The end feet of NSCs and astrocytes (purple) often contact blood vessels (BVs), which are an essential component of the neurogenic niche. Multiciliated ependymal cells (brown) form the immediate boundary between the cerebrospinal fluid-filled ventricle and the SVZ. Cb, cerebellum; DG, dentate gyrus. (B) Mature astrocytes and NSCs share many molecular and morphological characteristics, and both cell types respond to sonic hedgehog (SHH) signaling. Whether one cell type can be transformed into the other (dashed double-headed arrow), as appears to occur during injury and what role HH signaling may play in this process remain to be determined. NSCs also produce a small number of oligodendrocytes (gray), which is augmented by SHH signaling. Smoothened (SMO) and patched 1 (PTCH1) are thought to be expressed at all the stages of NSC lineage progression. Activation of the canonical HH signaling pathway, however, occurs only at the NSC stage, where it is important for maintaining the undifferentiated and proliferative state of the NSCs (circular arrow). Expression of the glioma-associated oncogene proteins (GLIs) ends as the lineage progresses from NSCs to TACs. In addition, whereas GLI2 and GLI3 are expressed in mature astrocytes and NSCs throughout the SVZ and the rest of the brain, GLI1 is present in only a subset of NSCs and astrocytes (hatched orange line), possibly in regions where HH signaling is the highest. Hh signalizace reguluje „klidové“ kmenové buňky: v mozku • Důsledek deregulace Shh v mozku – meduloblastom, glioblastom … Hh signalizace reguluje „klidové“ kmenové buňky …. nebo v kůži • Důsledek deregulace Shh v kůži – bazocelulární karcinom (BCC) Primární cilie a Hh signalizace: důkaz Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Basal cell carcinoma – způsobena aktivací Smoothened Primární cilie a Hh signalizace: důkaz control Shh active, cilia present Shh active, cilia absent Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Klíčové molekulární komponenty vývoje Notch • Notch=zářez – podle prvního fenotypu octomilky se zářezy na křídlech (T.H. Morgan, 1919) Transmembránové heterodimerické receptory Notch 1-4 Notch ligandy Jagged a Delta – jsou vázány na buněčný povrch Notch Notch dráha - overview • Vazba ligandu Notch receptor aktivuje dvě proteázy (enzymy specificky štěpící protein) • Proteázy jsou z rodiny ADAM a gamma-sekretáz • Štěpení Notch těmito proteázami uvolňuje tzv. NICD (Notch intracellular domain), který se uvolňuje a do cytoplazmy a následně přesouvá do jádra • NICD přímo interaguje s transkripčními faktory CBF1/Mastermind a spouší transkripci Notch dráha - biologie • Díky přímému působení má význam zejména při diferenciaci • Typicky např. „Binary decisions“ a laterální inhibici • Role v nikách kmenových buněk nebo při angiogenezi Nika zárodečných kmenových buněk (Caenorhabditis elegans) https://www.stembook.org/node/497 Laterální inhibice – proces, který zajistí, že dvě sousedící buňky nebudou mít stejnou buněčnou identitu (fate); díky signálním drahám (např. Notch), které díky přímému kontaktu zajistí odlišnost sousedících buněk https://www.stembook.org/node/497 Nika zárodečných kmenových buněk (Drosophila melanogaster) Nika kmenových buněk ve střevě • Pohárková buňka (Goblet cell) – vylučuje mucin a produkuje hlen • Enterocyt – diferencovaná buňka epitelu střeva Notch dráha – role v angiogenezi • Viz další přednáška Klíčové molekulární komponenty vývoje TGF/BMP • TGF – transforming growth factor (transformující růstový faktor) • BMP – bone morphogenetic protein (kostní morfogenetický protein) • patří do TGF nadrodiny 1. TGF1-3 2. BMPs – 20 různých ligandů 3. GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4. activin/inhibin/nodal TGF nadrodina má následující podrodiny: TGF beta nadrodina: Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny Signální dráha BMP Inhibitory BMP faktorů • noggin • chordin (Chd) • sklerostin Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP Klíčová role BMP inhibitorů produkovaných notochordem při indukci nervové ploténky notochord (= chorda) produkuje faktory, které specifikují ektoderm a vedou ke tvorbě nervové ploténky (neural plate). Jde zejména o následující faktory: noggin, chordin a follistatin (inhibitory BMP a aktivinu). BMP signalizace přímo antagonizuje Wnt ve střevní kryptě - Noggin (inhibitor BMP) je spolu s Wnt, R-spondinem a EGF základní složkou média pro kultivaci organoidů Integrace signálů vede k homeostáze Další zajímavé proteiny z BMP rodiny Myostatin (GDF8) – regulátor diferenciace svalu GDF8 (myostatin) – příklad tzv. master regulátoru konkrétní tkáně whippet Belgian blue Klíčové molekulární komponenty vývoje Receptorové tyrosin kinázy (RTK) 1. ligand se specificky váže na receptor 2. receptor dimerizuje 3. tyrosin-kinázové domény se navzájem fosforylují 4. autofosforylace vede k navázání (recruitment) adaptérových proteinů 5. V závislosti na receptoru se aktivují „downstream“ signální dráhy –např. Ras/Raf1/MEK/MAPK kinázová dráha, 6. která vede k buněčné odpovědi Adaptorové proteiny s SH2 doménou Doména SH2 rozpoznává fosfo-tyrosin Receptorové tyrosin kinázy Hlavní skupiny receptorových tyrosin kináz EGF funguje jako mitogenní signál ve střevním epitelu Mitogen – faktor, typicky protein, který indukuje proliferaci buněk (mitózu) EGF (epidermální růstový faktor) FGF (fibroblastový růstový faktor) – jsou typické mitogeny - EGF je spolu s Wnt-3a, R-spondinem a Nogginem (inhibitor BMP) základní složkou média pro kultivaci střevních organoidů EGF funguje jako mitogenní signál ve střevním epitelu Integrace signálů vede k homeostáze Jak rostou dlouhé kosti? - klíčová role chrupavky a růstové ploténky resting cartilage bone proliferating cartilage proliferating cartilage age resting cartilage FGF dráha na příkladu regulace růstu kostí růstová ploténka (growth plate) – zaniká v dospělosti Aktivující mutace v FGFR3 způsobují skeletální dysplázie Hypochondroplasia Achondroplasia SADDAN Thanatophoric Dysplasia STATURE AC TM TK I II III FGF binds here Achondroplasia FGF-FGFR3 dráha blokuje růst dlouhých kostí FGFR3 Ras Raf-1 MEK Erk FRS2 FGF2 Inhibice proliferace chrupavky healthy TD resting proliferating hypertrophic bone Růstová ploténka v detailu Typové otázky z této přednášky Načrtni a krátce popiš fungování signální dráhy BMP Které jsou hlavní přirozené inhibitory BMP dráhy? Načrtni přenos signálu u signální dráhy Notch Co je to laterální inhibice? Jaká může být role signální dráhy Notch v nikách kmenových buněk Načrtni a krátce popiš fungování signální dráhy Hedgehog (Hh) Uveď, jak mohou primární cilia kontrolovat buněčnou signalizaci Jak funguje myostatin? Která z uvedených signálních drah nezahrnuje sekretované ligandy: Wnt, Hedgehog, EGF, Notch, BMP Typové otázky z této přednášky Načrtni a krátce popiš signální transdukci receptorových tyrosin kináz Jak FGF dráha kontroluje růst kostí? Co je to růstová ploténka Uveď pět signálních drah z rodiny receptorových tyrosin kináz Co je to achondroplazie.