Jan Vondráček Játra jako model pro studium principů regenerace a regulace funkcí buněčných systémů Játra a jejich základní funkce Játra hrají kritickou úlohu při udržování homeostázy v organismu: zásadní úloha v metabolismu organismu; degradace endogenních látek; detoxifikace xenobiotik; exokrinní (tvorba žluči – metabolismus lipidů, exkrece toxických látek) i endokrinní žláza (erytropoetin, tvorba vitamínu D3); tvorba složek krve; imunitní orgán; Játra a jejich základní funkce játra jsou poškozována celou řadou toxikantů a dalších faktorů; udržení funkčních jater je zcela zásadní pro udržení základních životních funkcí - unikátní schopnost regenerace; Játra a jejich základní funkce 1. stavba jater; 2. vznik a vývoj jater; 3. jaterní zonace a její principy; 4. základní principy regenerace, „kmenové“ buňky jater; Histologie jater http://www.histology.leeds.ac.uk/digestive/liver.php játra prasete játra králíka Mikroskopická anatomie jater http://www.quasargroupconsulting.com/Encyclopedia/anatomy/liver.php Členění jater na strukturní podjednotky Jaterní lalůček - polygonální útvar ohraničený velmi tenkou vrstvou kolagenního vaziva; v něm je tzv. portální triáda – céva napojená na vrátnicovou žílu (v. portae), céva napojená na jaterní tepnu (a. hepatica) a žlučový kanálek. - je složený z trámců hepatocytů oddělených jaterními sinusoidami; - uprostřed se nachází centrální žíla, která odvádí krev do jaterní žíly; Nature Rev. Immunol. (2006) 6: 244-251 Členění jater na funkční podjednotky http://www.quasargroupconsulting.com/Encyclopedia/anatomy/liver.php - portální lalůček - část jaterního parenchymu, která má má vrcholy ve třech centrálních žílách a jeho středem je portální triáda (tvoří trojúhelník); je to oblast, ze které odchází žluč do žlučovodu; - primární jaterní acinus – tvar oválu (dvou spojených trojůhelníků) nejmenší funkční jednotka jaterního parenchymu; definice jaterní zonace; vrcholem trojúhelníků – 2 centrální žíly; Buňky jater • hepatocyty – většina buněk jaterního parenchymu – jaterní epiteliální buňky uspořádané do trámců; • endoteliální buňky cév a venózních sinusoidů; • na povrchu endoteliálních buněk – diferencované makrofágy - Kupfferovy buňky; • mezi endotelem krevních sinusoid a hepatocyty se nachází štěrbina označovaná jako Disseho prostor probíhá zde výměna látek mezi krví a hepatocyty – hvězdicovité (stellate cells) Itovy buňky – podílejí se na uskladnění tuků a metabolismu vitamínu A; • epiteliální buňky žlučových cest; Nature Rev. Immunol. (2006) 6: 244-251 Vývoj jater • játra představují jeden z prvních orgánů vznikajících v průběhu embryogeneze; • v průběhu časné embryogeneze představují základní hematopoetický orgán; • základní kroky: rozčlenění střevní trubice na přední, střední a zadní střevo; vytvoření jaterní výchlipky; vznik jaterního pupenu (zahrnujícího základ žlučníku); proliferace a diferenciace hepatocytů/buněk žlučového epitelu; maturace jaterní tkáně (postnatálně); Vývoj jater myši Zorn, A.M., Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.1.25.1, http://www.stembook.org Vznik jaterní výchlipky/pupenu Zorn, A.M., Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.1.25.1, http://www.stembook.org • pro indukci tvorby jaterní výchlipky z předního střeva a základu jater je důležité působení FGF a BMP faktorů uvolňovaných z mezodermu ze základu srdce a septum transversum; • na opačné straně střevní trubice zároveň vznikají základy slinivky a plic; Původ jaterních buněk Zorn, A.M., Liver development (October 31, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook, doi/10.3824/stembook.1.25.1, http://www.stembook.org • jaterní epiteliální buňky (hepatocyty, epiteliání buňky žlučových cest cholangiocyty) jsou entodermálního původu; • další neparenchymální buňky (Itovy buňky, Kupfferovy buňky, buňky cév) jsou původu mezodermálního; Hepatocyty a jaterní zonace • hepatocyt – klíčová buňka definující funkce jater – 80% veškerých jaterních buněk; • přestože se z morfologického hlediska jeví jako uniformní buněčná populace, ve skutečnosti jsou hepatocyty rozlišené funkčně, v závislosti na jaterní zonaci !!! S.P.S. Monga (ed.), Molecular Pathology of Liver Diseases, Springer, 2011 Hepatocyty a jaterní zonace • z hlediska funkce a vlastností rozlišujeme hepatocyty: • periportální (dobré zásobení O2 a živinami, více mitochondrií, méně hladkého ER - oxidativní metabolismus - β-oxidace mastných kyselin, glukoneogeneze, proteosyntéza, syntéza močoviny); • perivenózní (horší zásobení O2, glykolýza, syntéza lipidů, biotransformace xenobiotik – souvisí s větším množstvím hladkého ER, syntéza glutaminu); • někdy členěny na zónu I, II (přechodná) a III; Crit. Rev. Toxicol. (2012) 42(6): 501–548 CYP3A4 Jaterní zonace metabolismu Redox Biology 11 (2017) 622–630 nejvýraznější pro metabolismus glukózy (glukoneogeneze v periportální oblasti zatímco glykolýza probíhá zejména v perivenózní oblasti); je však ovlivněn i metabolismus lipidů, žlučových kyselin a xenobiotik; metabolismus dusíkatých sloučenin – konečným produktem v periportální oblasti je močovina, zatímco v perivenózních hepatocytech je to glutamin – př. působení Wnt dráhy – významným cílovým genem pro b-katenin je glutamin syntetáza; Mechanismy a signální dráhy řídící jaterní zonaci • významnou roli v regulaci jaterní zonace – funkční diferenciace zralých hepatocytů – hraje Wnt/b-kateninová signální dráha, resp. gradient její aktivity; • vedle toho se zde uplatňují ale také další transkripční faktory, jejichž aktivita může mít gradientový charakter – pravděpodobně nejvýznamnějším příkladem je hepatocytární jaderný faktor alfa – hepatocyte nuclear factor a – HNF4a; • obě dráhy spolu interagují jak v regulaci základních buněčných funkcí diferencovaných hepatocytů, tak mají zásadní dopad na procesy spojené s regenerací jater a rozvojem jaterních onemocnění, včetně hepatokarcinogeneze; • gradienty aktivity specifických signálních drah tak mají význam nejen v embryogenezi/morfogenezi, ale také v regulaci funkcí diferencovaných buněk v dospělém organismu; Wnt/b-kateninová dráha v játrech Gastroenterology (2015) 148:1294–1310 Gradient aktivity Wnt/b-kateninová dráhy v játrech Redox Biology 11 (2017) 622–630 v periportálních hepatocytech – vysoká hladina APC – blokuje bkateninovou signalizaci; v perivenózních hepatocytech – nízká hladina APC, aktivní bkateninová dráha; aktivita b-kateninové dráhy je dále podpořena aktivací prostřednictvím Rspondin/LGR5 signalizace a modulována dalšími transkripčními faktory (HIF1a); Jaterní zonace částečně souvisí s hladinou O2 Redox Biology 11 (2017) 622–630 parciální tlak kyslíku klesá od PP do PC oblasti; dostupnost O2 může ovlivnit reakce metabolismu endogenních látek i xenobiotik; hladina kyslíku také ovlivňuje aktivitu proteinů regulovaných hypoxií, jako je HIF1a; HNF4a • HNF4a – jaderný receptor – transkripční faktor fungující jako homodimer; Gene Expression (2015) 16: 101–108 • v hepatocytech – nízká hladina podporuje proliferaci, dediferenciaci, zatímco vysoká hladina podporuje diferenciaci; HNF4a • HNF4a – vysoká hladina zejména v játrech a ledvinách; • přímo reguluje transkripci genů spojených s glykolýzou, glukoneogenezí, tvorbou močoviny, žlučových kyselin, metabolismem tuků, xenobiotik, tvorbou apolipoproteinů i faktorů podílejících se na srážení krve; • spolupracuje s dalšími jadernými receptory kontrolujícími metabolismus v játrech – konstitutivní androstanový receptor (CAR) pregnanový X receptor (PXR), receptor pro peroxizómové proliferátory a (PPARa); Rovnováha signalizace b-kateninu a HNF4a definuje genovou expresi v hepatocytech Hepatology (2014) 16: 2081 - 2082 Gastroenterology (2015) 148:1294–1310 Játra jsou orgán vystavený toxickému působení řady látek – schopnost regenerace Játra – schopnost regenerace – dediferenciace a transdiferenciace Nat Rev Mol Cell Biol. (2016) 17: 413-25 • tkáně v dospělém organismu – rozdílná schopnost regenerace; • rychle se obnovující tkáně – střevní epitel, krevní buňky, pokožka – populace rezidentních kmenových buněk; • tkáně s velmi limitovanou obnovou – nervová tkáň, srdeční svalovina; • tkáně se schopností regenerace po poranění, poškození – plicní epitel, játra – obnova z tzv. dospělých progenitorů, nebo procesy dediferenciace a transdiferenciace; Higgins GM, Anderson RM. Experimental pathology of the liver. Arch Path Lab Med. 1931;12:186–202. Schopnost regenerace po částečné hepatektomii Regenerace po hepatektomii = hepatocyty & epiteliální buňky žlučových cest Schopnost regenerace jater myši po částečné hepatektomii je obrovská – 30 opakování – odpovídá jedné buňce Hepatocyty jsou v klidovém stavu • TGFb produkovaný sinusoidálními endoteliálními buňkami indukuje zástavu buněčného cyklu u hepatocytů – G0 fáze buněčného cyklu; Nature Med. (2014) 20: 857-869 Po hepatektomii nebo akutním poškození jater dochází k aktivaci proliferace hepatocytů a buněk ž. epitelu • solubilní faktory produkované endot. buňkami, Itovými buňkami a Kupfferovými buňkami stimulují proliferaci hepatocytů a buněk žlučových cest; Nature Med. (2014) 20: 857-869 Po hepatektomii nebo akutním poškození jater dochází k aktivaci proliferace hepatocytů a buněk ž. epitelu • koordinovaná mobilizace jaterních růstových faktorů, remodelace ECM a přísně kontrolovaná proliferace epiteliálních buněk; • endoteliální buňky neuvolňují TGF-b během časné fáze regenerace, naopak sekretují HGF, WNT2 a cytokiny (CXCR7, CXCR4); Itovy buňky produkují HGF a hedgehog (Hh), zatímco Kuppferovy buňky sekretují cytokin IL-6; • to stimuluje proliferaci hepatocytů (spojenou s částečnou dediferenciací), následovanou proliferací neparenchymálních buněk; • proces je velice rychlý – 7 -10 dní u myši, 6 – 8 týdnů u člověka; • pro normální regeneraci nejsou v játrech třeba specializované populace kmenových buněk; Chronické poškození jater vede k aberantní regeneraci • chronické poškození jater (chronická hepatitida, alkohol) – masivní ukládání ECM, omezená proliferace hepatocytů a epit. buněk ž. cest – to vede k omezené regeneraci – zároveň probíhají procesy spojené s ukládáním vaziva – jaterní fibróza, cirhóza; Nature Med. (2014) 20: 857-869 Po hepatektomii nebo akutním poškození jater dochází k aktivaci proliferace hepatocytů a buněk ž. epitelu • nicméně i v podmínkách chronického poškození si játra udržují jistou schopnost regenerace – využití progenitorových buněk? • duktulární reakce – tvorba bipotentních progenitorových buněk; • to naznačuje velkou plasticitu jaterních buněk – možnost dediferenciace hepatocytů?, specifické populace progenitorových buněk?, perivenózní hepatocyty (vysoká aktivita b-kateninové drájy) jako kmenové buňky jater? „Adult liver progenitor cells“ – kontroverzní úloha v obnově jaterní tkáně Cell Stem Cell (2014) 14: 561-574 Kontroverze: • existují skutečné kmenové buňky v játrech? • fakultativní kmenové buňky – hepatocyty, progenitorové buňky? • pokud ano – které a kdy se zapojují? K zamyšlení přestože morfologicky představují hepatocyty relativně homogenní populaci buněk, lze rozlišovat odlišné populace buněk jejichž funkční vlastnosti závisejí na jaterní zonaci; gradienty tak hrají významnou roli nejen morfogenní (v embryonálním vývoji), ale mohou významně regulovat i funkce diferencovaných buněk v dospělých tkáních; v játrech nejsou dány jen aktivitou specifických signálních drah, ale také gradientem hladiny kyslíku (a metabolitů); jaterní zonace daná gradientem aktivit transkripčních regulátorů, jako jsou b-katenin a HNF4a, hraje úlohu v regulaci metabolismu hepatocytů, a to jak endogenních látek (cukry, lipidy, močovina, některé aminokyseliny) tak i xenobiotik – řídí tedy rozdělení základních funkcí jaterních buněk v rámci základních morfologických jednotek jater – jaterního lalůčku či primárního acinu; K zamyšlení regenerace poškozených jater ve většině případů probíhá prostřednictvím částečné dediferenciace a masivní proliferace hepatocytů; v případě, že je schopnost hepatocytů proliferovat omezená – onemocnění, působení toxikantů – může dojít k obnově jater ze specifických populací „adult progenitor cells“; identita buněk, sloužících jako zdroj pro normální obnovu jater a regeneraci v případě jejich poškození, není zcela jasná – specifické populace hepatocyty?, progenitorové buňky (epiteliálního původu?)? – podobně jako u jiných orgánů (např. srdce) není tedy zcela jasné zda (a v jaké podobě) se v játrech vyskytují kmenové buňky;