SIGNALIZACE A LIPIDOVÝ METABOLISMUS
- Některé obecnější principy a jejich aplikace
v buněčné fyziologii;
- Typy buněčných populací a buněčné modely;
- Spolupůsobení látek různé chemické povahy;
- Buněčné signalizace obecněji s důrazem na
metabolismus lipidů;
- Ovlivnění organismu zásahy do
intermediárního a energetického
metabolismu (příklady);
Syntéza dílčích poznatků.
1
Alois Kozubík
Shrnutí a doplnění
probraného učiva
(obecnější východiska a modely)
Částečné zobecnění
2
Buňky tzv. intenzívně proliferujících populací
(zejména buňky krvetvorné),
anebo
buňky nádorové
(leukemické, střevních epitelů, prostaty, jater
etc.)
v celém organismu (in vivo) a in vitro:
3
BIOLOGICKÉ MODELY zvolené pro další výklad
Organismus jako komplexní hierarchický systém
organismální,
tkáňová
molekulovábuněčná
Působení na jednotlivých úrovních
organizace systému nelze oddělovat
chceme-li pochopit fungování celku.
ÚROVEŇ
4
Typy buněčných populací
(možné klasifikace, modely,
obecnější východiska)
5
Dělení buněčných populací podle intenzity obnovy u dospělé myši
1. Statické populace bez známek obnovy během života:
neurony všech typů
srdeční svalové buňky
odontoblasty
Sertoliho buňky
2. Velmi pomalu se obnovující buněčné populace:
Během života se obnoví jen část populace:
hladké svalové buňky
gliové buňky
osteocyty
buňky ledvinných tubulů
buňky dřeně nadledvinek
hlavní buňky žaludeční sliznice
intersticiální buňky Leydigovy
buňky hnědé tukové tkáně
3. Rychle se obnovující buněčné populace:
A. Ne příliš rychle se obnovující populace. Populace, která se během života zcela obnoví, ale
za dobu delší než 30 dní:
hepatocyty a litorální buňky
epitelová výstelka dýchacího traktu
buňky slinných žláz
buňky pankreatu
buňky v kůře nadledvinek
parietální buňky žaludeční sliznice
pojivové buňky v kůži
B. Velmi rychle se obnovující buněčné populace. Všechny se obnoví za dobu kratší než 30 dní:
střevní epitel
krvetvorné buňky, prekursory krevních buněk
epidermis
kornea
epitelová výstelka ústní dutiny a esofagu
povrchový epitel žaludeční sliznice
seminiferní epitelová tkáň
C. Buňky nádorové
Dělení buněčných populací podle intenzity obnovy
6
Proč tyto rozdíly? - rozdílný způsob regulace
Typy buněčných populací
7
expandující,
neopouštějí populaci,
množí se
TYPY PROLIFERUJÍCÍ
stacionární
c. konstantní
Tranzitní populace, ve
které se buňky pomnoží
c. konstantní
populace coby zdroj
buněk pro jiné populace
c. konstantní
NÁDOR
BLASTY
KRVE
K. B.
stále ubývá typ průchozí (tranzitní)
c. konstantní
B.
C.N.S.
OOCYTY
metamyelocyty
k. d.
erytrocyty
granulocyty
TYPY NEPROLIFERUJÍCÍ
podle Gilberta a Lajthy (1965)
Buňky setrvávají nebo procházejí různým prostředím, kde na ně mohou působit
různé regulační faktory mající např. vliv na intenzitu proliferace
DŮLEŽITÁ PRO POSTIŽENÍ CHOVÁNÍ A SMĚROVÁNÍ BUNĚČNÝCH POPULACÍ,
MOHOU BÝT TATO:
- Zachování rovnováhy mezi produkcí buněk (intenzitou proliferace) a jejich úbytkem (např. smrtí
apoptózou) je podmínkou pro zachování homeostázy na tkáňové úrovni.
- Proto změny v intenzitě proliferace, diferenciace a apoptózy po působení jakýchkoli podnětů,
jež mohou tyto procesy ovlivnit, lze chápat jako integrální ukazatele porušení této homeostázy.
- Vhodný způsob detekce těch změn, které vedou k trvalejšímu porušení rovnováhy mezi
produkcí a úbytkem buněk může celkově odrážet nejen poruchy, které jsou základem tzv.
proliferativních chorob (nádorových onemocnění), ale být i ukazatelem procesů vedoucích k
obnově porušené rovnováhy.
- Parametry, jimiž lze postihnout tyto tendence, by proto měly být předmětem zájmu nejen
teoreticky orientovaných pracovníků, ale i laboratoří zabývajících se účinky škodlivých látek
vnějšího prostředí, šlechtitelských a zejména klinicky orientovaných laboratoří.
- Vysokou vypovídací hodnotu mohou mít tzv. „integrální ukazatele“ odpovědi systému jako
jsou např. hmotnost orgánů, počet buněk apod. a jejich změny v čase. Podávají prvotní
informaci o stavu systému, jeho směřování, a naznačují, jakým směrem orientovat další,
detailnější, výzkum.
8
Některá OBECNĚJŠÍ VÝCHODISKA,
treatment: ovlivňovaný systém parametry cytokinetiky:
VSTUPY
modelové systémy in vitro, buňky lišící se
růstovou „strategií“, pacient VÝSTUPY
„black box“
cytostatika,
ozařování, …
regulační
podněty, atd.
... „0“
proliferace
diferenciace
apoptóza
Jednoduché, snadno měřitelné
„integrální ukazatele“
9
pojem „CYTOKINETIKA“
Dynamické změny
na úrovni buněčných populací
10
(Možné chyby)
Které faktory, a jak mohou modulovat
dělení, diferenciaci a zánik buněk?
???Dochází k tomu změnami
- exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu (transdukci)
signálů přímo regulujících proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt
včetně exprese protoonkogenů a nádorově-supresorových genů,
- signálů, které tyto funkce ovlivňují do určité míry nepřímo,
jako jsou inhibice mezibuněčných spojení, ovlivnění funkce enzymů
reparujících DNA, metylace DNA, metabolismus apod.
(na různých úrovních organizace
buněčných systémů)
11
Čtyři nejdůležitější skupiny
malých organických molekul v buňkách
V buňce (buněčných signalizacích a metabolismu)
spolupůsobí látky různé chemické povahy
+ ionty atd… důležité jsou všechny, proč dnes důraz na lipidy?
12
mj. fosfolipidy a jejich deriváty jsou
- součástí membránových struktur
- komponenty signálních drah
- neutrální tuky jsou významnou součástí
intermediárního a energetického
metabolismu atd.
Pozn.: Mnohé rozvedeno v rámci dřívějších přednášek.
V tomto kurzu se o nich zmiňoval prof. Vondráček
a v předmětu Fyziologie živočišné buňky Dr. K. Souček
13
Látky lipidové povahy plní v organismu řadu funkcí
Buňky prostoupeny membránovými systémy
tvořenými z velké části
fosfolipidy
Golgiho komplex slouží
k transportu, přechovávání a
posttranslační modifikaci proteinů,
navazování a odstraňování nebílkovinných
(zejména cukerných) složek, syntéze
polysacharidů a imunoglobulinů, tvorbě
váčků využívaných při exocytóze.
Drsné endoplazmatické retikulum:
syntéza některých bílkovin,oligomerizace
proteinů, rozklad poškozených bílkovin.
Hladké endoplazmatickém retikulum:
odstraňování toxických látek, některé části
metabolismu lipidů a metabolismu hemu,
regulované uvolňování Ca2+ iontů.
Cytoplazmatická membrána: semipermeabilní obal
ohraničující vnitřek buněk od vnějšího prostředí a kontrolující
pohyb látek do buňky a ven z buňky. Je selektivně permeabilní
pro ionty a organické molekuly.
Chrání buňku před vnějšími vlivy.
Podílí na různých buněčných procesech jako buněčná adheze,
výměna iontů, buněčných signalizacích.
Skládá se z lipidové dvouvrstvy se zakotvenými
proteiny, glykoproteiny, cholesterolem, sfingolipidy.
14
MEMBRANOVÉ
SYSTÉMY
a buněčné
kompartmenty
protientropické
důsledky
STRUKTURNÍ ÚLOHA
FOSFOPIDŮ v BUŇKÁCH
a BUNĚČNÉ FUNKCE
15
Funkčně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek).
Důsledkem je kompartmentalizace – vznik a existence kompartmentů.
V důsledku toho jsou prvky (složky), např. látky, buňky atd.,
nerovnoměrně rozmístěny.
Příklady
Všechny membránami ohraničené struktury mají své „vnitřní prostředí“.
Selektivně jsou v nich zadržovány určité molekuly proti koncentračnímu spádu.
Některé reakce tak proběhnout mohou, jiným může být zabráněno.
Tato protientropická distribuce molekul a buněčných struktur,
směřující proti neuspořádanosti, má velký význam pro buněčný metabolismus
a regulace.
Základem pro tento stav je existence buněčných membrán,
jeden ze základů existence biologických systémů.
Kompartmenty
16
Struktura fosfolipidů a jejich orientace v plasmatické membráně
17
Phospholipases (PL)
Estery - Kyselina + alkohol (-OH skupina karboxylové kyseliny nahrazena organickým zbytkem
vzniklým z alkoholu po odštěpení vodíku z OH skupiny).
Amidy - náhradou skupiny OH karboxylové skupiny za amidovou skupinu NH2.
PLA-2
PLA-1
PLC
PLD
Složení fosfolipidů a jejich
štěpení fosfolipázami (PL)
18Molecular Biology of the cell, 4th Edition
NEUTRÁLNÍ TUKY
19
No phosphate
Fyzikálně-chemické vlastnosti
fosfo- a glykolipidů dovolují
ve vodném prostředí vzniknout
strukturám membránového
charakteru na
samoorganizačním principu.
Další formy lipidů
Molecular Biology of the cell, 4th Edition
PC - fosfatidylcholin
diC 16 – k. palmitová
diC 18:2 – k. linoleová
chol - cholesterol
Dynamický charakter biologických membrán - model
Znázorněna je dynamika „samoorganizačních schopností“
modelového systému (v µs) vytvářet membránové
struktury ve vodném prostředí, jsou-li dodány prekursory:
20
Dynamický charakter biologických membrán
(model) a lipidové rafty
Zajištění většiny biologických funkcí
se neobejde bez unikátních interakcí
lipidových komponent jako jsou VNMK,
fosfolipidy s dalšími biologicky
významnými molekulami.
VNMK jsou součástí
lipidových raftů:
membránových mikrodomén
obohacených o glykosfingolipidy +
cholesterol
Jejich modulace mohou významně měnit
intenzitu a také směr signálové transdukce
PC - fosfatidylcholin
diC 16 – k. palmitová
diC 18:2 – k. linoleová
chol - cholesterol
Červená – nenasycené lipidy
Zelená - nasycené lipidy
A - planární rozložení
C - liposom
21
Prerkursory:
…mj. jsou komponenty signálních drah…….
….a mohou ovlivňovat chování (cytokinetiku)
normálních i nádorových buněčných populací
22
Látky lipidové povahy plní v organismu řadu funkcí
Produkty metabolismu fosfolipidů
(jejich regulační úloha)
Spektrum eikosanoisů
23
N-6 (CH3)
Čtyři cesty přeměny AA na své metabolity eikosanoidy
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
24
4 = vazby, silně reaktivní, nestabilní
(možný parakrinní způsob regulace)
MEMBRÁNOVÉ POSFOLIPIDY
CYCLOOXYGENÁZY EPOXYGENÁZY
(P450)
LIPOXYGENÁZY
CH2
CH CO NH CH2
COOH
NH
COCH2CH2CHCOOH
NH2
C5H11
OH
S
COOH
COOH
LTA4
LTF4
LTE4
LTD4
LTC4LTB4
EPOXYKYSELINY,
DIOLY, etc.
TXB2
TXA2 PGI2 PGD2 PGE2
PGH2
PGG2
LTC4:
PLA2
O
OH
COOH
OH
PGE2:
METABOLISMUS KYSELINY ARACHIDONOVÉ
25
Hlavní osy biosyntézy
eikosanoidů.
Metabolity hlavních směrů
přeměny jsou barevně odlišeny:
COX (fialově),
5-LOX (oranžově),
15-LOX (zeleně),
12-LOX (žlutě),
CYP epoxygenázy (červeně),
CYP ω-hydroxylázy (modře),
nenzymatická oxidace (šedě)
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
26
Rozšířené schéma hlavních směrů biosyntézy eikosanoidů.
PG nomenclature and structure. Arachidonic acid carbons are numbered
1–20, starting from the carboxylate. The prostaglandin letter indicates
composition of the prostane ring, with PGH2 as an example.
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
27
STRUKTURY METABOLITŮ KYSELINY ARACHIDONOVÉ (AA)
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktury metabolitů AA, jejichž vznik je katalyzován cytochromy P450
28
Nestabilní produkty
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktury metabolitů AA, jejichž vznik je katalyzován 12-lipoxygenázou
29
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
(cystein)
LTC4
(peptidoleukotrieny)
Struktura metabolitů AA (peptidoleukotrien C4 a Lipoxin (LXA4)
30
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Struktura metabolitů AA (peptidoleukotrien C4 a Eoxinoxin (EXC4)
31
Examples of LTB4 metabolism by β-oxidation, CYP ω-hydrolases, and
glucuronidation.
From: J. Lipid Res. 2009 June; 50 (6): 1015-1038.
Příklad metabolismu LTB4
CYP ω – hydrolasa
CYP ω – hydrolasa
β - oxidace
glucuronidace
Glukuronidace - konjugace s kyselinou glukuronovou (glukosiduronovou).
Je to děj lokalizovaný v největším počtu tkání a orgánů.
Má největší spektrum xenobiotik, se kterými vytváří konjugáty.
To zvyšuje polárnost a rozpustnost substrátu ve vodě, což ulehčuje detoxikaci
a vylučování. 32
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
33
Efekt koncentrace mastných kyselin (VNMK)
(- prekurzorů eikosanoidů -)
na proliferaci krvetvorných nádorových buněk
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
34
Efekty koncentrace mastných kyselin na proliferaci
krvetvorných nádorových buněk (vliv peroxidace lipidů)
35
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
Efekty koncentrace n-6 mastných kyselin na proliferaci
krvetvorných nádorových buněk (vliv prostaglandinů)
receptory
růstové signály
molekuly
signálové
transdukce
molekuly
zesilovací
kaskády
regulátory
transkripce
cykliny
CDKs
p27
p21
p16
p15
+
Transdukce
(přenos) signálů
„klasické“ schéma s. transdukce
36
Představuje zákonitě koordinovanou (a nesmírně rychlou) souslednost dějů
(reakcí) vedoucích od vnější plasmatické membrány (návázání regulátoru
-ligandu- na plasmatickou membránu anebo průchod regulátoru touto membránou)
přes cytosol k jádru (expresi genetické informace).
Jedná se o PŘENOS INFORMACE.
Výsledkem je zabezpečení všech fyziologických funkcí buněk a organismu
včetně regulace cytokinetiky (proliferace, diferenciace a smrti buněk v čase).
Procesu se účastní řada regulátorů různé chemické povahy.
Charakter přenosu signálu se odvíjí se od specifické chemické struktury
jednotlivých komponent dané signální dráhy.
Podstatou je změna konformace molekul (souslednost změn konformací).
Jeden z principiálních rozdílů způsobu signalizace spočívá zejména v tom,
zda má daný regulátor povahu hygrofilní (lipofóbní) anebo hygrofóbní (lipofilní).
Transdukce (přenos) signálů - podstata
37
Transdukce (přenos) signálů
Membránové
receptory
Růstové signály
hygrofilní povahy
(proteiny, katecholaminy, apod.)
molekuly
signálové
transdukce
molekuly
zesilovací
kaskády
regulátory
transkripce
cykliny
CDKs
p27
p21
p16
p15
Lipofilní regulátory
Jaderné
receptory
Způsob signalizace odvislý od chemické podstaty ligandů
38
Receptorem zprostředkovaná dráha aktivace
(naznačení sousledností konformačních změn)
39
PŘÍKLAD - ENZYMY
40
Podstatou je
změna konformace
(jednotlivé funkce jsou neodmyslitelně spojeny
se strukturami od nichž se odvozují)
Substrát přesně zapadne do lůžka v molekule enzymu.
V tomto lůžku ho poutají různé typy sil:
hydrofobní (modrá), přitahování opačně nabitých
skupin (zelená v substrátu a červená v lůžku),
vodíkové můstky. Štěpená vazba se tím dostane mezi
„nůžky“ silně polárních skupin (např. karboxylů).
Při „vyvolaném přizpůsobení“ je
enzym teprve domodelován silami, které
poutají substrát k jeho lůžku.
Jak vzniká komplex substrát – enzym
Substrát Enzym
41
Alosterická aktivace enzymu.
Enzym sám
není schopen rozštěpit
substrát, neboť jeho
molekula nemá
správný tvar.
Teprve naváže-li se
na jiné místo regulační
molekula (hnědá
zprava),
než se váže substrát,
získá funkční formu.
regulační
molekula
substrát
enzym
42
Regulační molekula se připojuje opět na jiném místě molekuly enzymu,
než kam se váže substrát.
Tím se liší od pouhého blokování lůžka, které může způsobit látka podobná
substrátu (soutěživá čili kompetitivní inhibice).
Alosterická inaktivace patří k regulačním pochodům. Může ji vyvolat jen
zcela určitá látka, ta, která svými vlastnostmi přesně odpovídá místu, na
které se váže.
enzym
Regulační molekula
Alosterická inaktivace enzymu.
43
A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993
44
Struktura izoforem protein kinázy C (PKC) - schéma
A. Basu: Pharmacol. Ther., 59 (3), 257-280, 1993
Model aktivace protein kinázy C
45
Buněčné signalizace
obecněji
s důrazem na
metabolismus fosfolipidů
46
CSF-1
c-fms
PKC?
e.g.u-PA, JE, KC
b actin,
fibronectin R (b)
hck, frg, fos, jun,
myc G1 cyclins
DNAsynthesis
mRNA
nucleus
?
Glucose
?
K+
Na+
Na+
H+
PKC
tyr tyr-P
receptor substrates
e.g. PI-3 kinase
G proteins
(ras/GAP?)
other effectors e.g.
RAF-1 kinase
Fluid-phase
pinocytosis
phospholipids phospholipases
DAG
? ?
47
48
Pět mezibuněčných paralelních signálních drah
aktivovaných receptory svázanými s G-proteiny,
tyrozin kinázovými receptory nebo oběma typy
Kaskáda proteinových kináz v přenosu
signálu
Ca 2+ Ca 2+
Ca 2+
ATPase
PIP2
DAG
Ca 2+
PLC
RSRS
G
PKC
sm
ACTIVATIVACE CÍLOVÝCH PROCES
protein
phosphorylation
kináza
kináza kináza
kinázakinázakinázakináza
PKC
Zesílení signálu
49
Growth factor
Receptor
DNA synthesis
Transducer
Effector
2nd messenger
Target
Regulatory proteins
RNA/protein synthesis
Tyrosine kinase
abl
erb
B2/neu
fes/fps
fgr
fyn
kit
lck
met
ret
sea
src
trk
yes
Nuclear
fos
jun
myb
myc
ski
Serine kinase
mil/raf
mos
pim-1
pks
raf
rel
G protein
rab
ral
ras
Receptor
bek
erb B
fkg
fms
mas
ros
Growth factor
fgf-5
hst
sis
int-2
MEMBRANECYTOSOLNUCLEUS
Receptor Receptor Receptor Receptor
Receptor
tyrosine
kinase
G protein
PLCg
G protein G protein
PLA2 Adenylyl-
cyclase
Na+/H-
antiport
[pH]i
?
cAMP
PKA
Arachidonate
PG TX
Calmodulin
DG IP3
PKC PK (?)
[Ca2+]i
Oncogenes
podle: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991
50
Jednotlivé úrovně signálních kaskád s naznačením zapojení
fosfolipidových komponent
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROS
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
mRNA
RE
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFAn-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonovákyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROSROS
lipidová
peroxidace
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
(stresory)
Změny
metabolismu,
buněčného růstu
diferenciace
a apoptózy
lipidové
rafty
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení ω-3 a ω-6 VNMK
(mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě)
51
PLA 2
PLA 2
P
receptor
growth factors
hormones
AA
- ion channel activity
- guanylate cyclase
- adenylate cyclase
protein kinase C
protein kinase A
tyrosine kinase
MAP kinase
G-proteins
cyclooxygenases lipoxygenases
CP450 monooxygenases
eicosanoid
s
transcription factors
gene expression cell
growth
+
According to: A. Sellmayer et al.:
Prostaglandins, Leukotrienes and
Essential Fatty Acids ;
57: 353 - 357, 1997.
52
Zjednodušené schéma úlohy eikosanoidů v buněčných signalizacích
Časové hledisko: efekt je závislý na délce působení
doba působení
53
Jednotlivé signální dráhy
bývají mezi sebou propojeny.
Mohou interagovat, „spolupůsobit“.
54
https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_signaling
Přehled klíčových signálních drah
Key components of a signal transduction pathway (MAPK/ERK pathway shown)
Zpětnovazebná
inhibice proliferace
EGF ?
55
EGF: epidermální růstový faktor, PLA2: fosfolipáza A2, AA: kyselina arachidonová, 5-LOX: 5-lipoxygenáza, 5HETE: 5 hydroxykyselina,
LTA4, C4: leukotrien A4, C4, PKC: protein kináza C, DAG: diacylglycerol, PIP2: fosfoinositoldifosfát, PLC: fosfolipáza C,
Tyr K: tyrosin kináza
Ca 2+
Ca 2+
Ca 2+
Ca 2+
AA 5HETE LTC4LTA4 PIP2DAG
Tyr-K Tyr-K
PLA2 5-LOX
PKC PLC
+
Nuclear responses
EGF EGF
Přenos signálu Epidermálního Růstového Faktoru (EGF)
modulovaný metabolity kyseliny arachidonové (AA)
Podle:Peppelenbosh et al.:Cell, Vol. 69, 2, 1992, 295-303
56
57
Příklad propojení (Wnt dráha a její modulace eikosanoidy)
Propojení
signálních drah
Nadměrná produkce PGE2 podporuje v žaludku a kolonu vznik nádorů
Lze ovlivnit
58
Pozitivní důsledky modulace metabolismu AA pomocí NSAIDs
Vlastní výsledky - Příklad praktického využití NSAIDs
Působení několika
strukturálně odlišných NSAIDs
na nádorové buňky (G:5:113)
in vivo
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Doba přežití (týdny)
% Přežití
Kontrola
Dicloph 0.15 mg p<0,01
Dicloph 0.5 mg p<0,05
Ibuprof 0.5 mg
Ibuprof 0.15 mg p<0,01
Flurbiprof 0.5 mg
Flurbiprof 0.15 mg p<0,05
COX2 metabolity mohou v závislosti na typu tkáně dělení
buněk stimulovat, ale i inhibovat jako např. b. krvetvorné.
NSAIDs inhibují COX2 a působí protizánětlivě (2 mechanismy)
2
Všem zvířatům (MYŠÍM)
byly v několika režimech
injikovány
nádorové buňky fibrosarkomu
(G:5:113) a sledováno jejich
PŘEŽÍVÁNÍ.
Výsledky neovlivněných
(kontrolních) zvířat byly
srovnávány s odpovědí
pokusných-ovlivněných zvířat
PO TERAPII INHIBITORY COX.
VŠECHNY HLAVNÍ
KOMPONENTY SPOLUPŮSOBÍ
Otázkou je charakter interakcí
60
D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984
VLIV KONCENTRACE NENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN (VNMK)
NA PROLIFERACI NÁDOROVÝCH BUNĚK – shrnutí (do r. 1985)
(„FATTY ACID PARADOXES“ )
Efekty závisí na koncentraci
U modelových krvetvorných (nádorových) populací
mohou VNMK generovat jak + , tak – signál na proliferaci
61
V reálném prostředí jednotlivé faktory spolupůsobí
v různých koncentracích
(Použita vlastní data z: Eur. J. Pharmacol. 316, 349–357, 1996)
Příklad interakce dvou faktorů
inhibujících proliferaci
epiteliálních buněk CCL64 (%)
(Esculetin = Faktor 1) a (TGF-β1= faktor 2)
Synergické působení a nelineární
charakter odpovědi jsou zjevné po
kombinaci vyšších koncentrací obou
faktorů.
62
Interakce závisí na
koncentraci látek a mohou
mít různý charakter
(antagonistický, aditivní,
synergický)
„aditivity line“
Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy
(dílčí shrnutí)
Fosfolipidy a zejména jejich složky
vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetně jejich metabolitů eikosanoidů,
patří mezi významné epigeneticky působící faktory schopné ovlivnit
jak dělení a zánik normálních,
ale i transformovaných buněčných populací,
tak proces maligní transformace.
Hlavní mechanismy působení PUFAs
1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů
významných z hlediska cytokinetiky
2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových regulátorů,
cytokinů a imunitní systém
3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů vznikajících peroxidací lipidů.
63
Praktické dopady
Význam lipidových komponent
(a metabolismu)
pro zachování homeostázy, zdraví a
regeneraci organismu in vivo
Brno
METABOLISMUS A REGENERACE ORGANISMU
64
Hlavní dráhy intermediárního metabolismu
65(Dále viz ox. posforalace - OxPhos)
Vyváženost tendencí
vs.
tendence k nestabilitě
Příklad komplexního zpětnovazebného působení
insulinu
- apoptosis
+
„cytokinetiku“
EFEKTY na
metabolismus
Insulin generuje pozitivní signál na proliferaci
Účinek na výsledný počet buněk je posílen
inhibicí apoptózy66
Metabolity a meziprodukty enzymových reakcí
zpětná vazba (metabolismus – b. „signálování“)
alosterická kontrola enzymatické aktivity;
intracelulární metabolity často kontrolují post-translační
modifikace (aktivitu) klíčových proteinů – signální proteiny i
metabolické enzymy
glukóza je substrátem pro tvorbu UDP-N-acetylglukosaminu (UDPGlcNac)
– nezbytná pro glykosylaci receptorů (folding, transport)
růstových faktorů; tvorba acetylkoenzymu A (aktivita ACL) je klíčová
pro acetylaci histonů – tvorba klíčových enzymů a kofaktorů;
hladina esenciálních aminokyselin kontroluje aktivitu mTOR
komplexu1. Pozn.: Reguluje růst, proliferaci, b. motilitu a přežívání, autofágii, syntézu proteinů a
transkripci. Funguje rovněž jako tyrosin kináza activující insulinové receptory;
Biol. Cell 2015, 107: 251–272
67
68
Metabolické vztahy mezi tkáněmi
(STAV SYTOSTI)
Adaptace metabolismu u proliferujících buněk
proliferující buňky vyžadují nejen energii, ale i
velké množství substrátů pro anabolické reakce;
Cell Metabol. 2016, 23: 27 - 47.
intenzívní aerobní glykolýza - podpora syntézy buněčných makromolekul,
kofaktorů apod. – komplexní přestavba buněčného metabolismu
včetně metabolismu lipidů a glycidů;
Jak je možné energetickou rovnováhu zajistit?
69
KLIDOVÝ STAV PROLIFERACE
POTRAVA: Základní podmínka existence, zdroj živin (E),
základ veškerých regulací
Významné je Složení (kvalita),Množství
Časové rozložení (frekvence příjmu) potravy
(FOSFOLIPIDY vs. NEUTRÁLNÍ TUKY)
Má vliv na modulaci lipidového a celkového metabolismu
a růstové vlastnosti tkání.
(důležité zejména po poškození a za stresu)
„Úloha lipidů ve fyziologii a patofyziologii buněk“
70
IF ?
je nutriční model
spočívající ve změně
frekvence příjmu
potravy
Významně moduluje
metabolismus všech
živin
(zejména však
energetický a lipidový
metabolismus)
Současně významně
moduluje růstové
vlastnosti tkání
Důsledky modulace
pomocí potravního
režimu
Vysokoglycidová
DIETA !!!
Krysy:
Střídání 24 h hladovění
a následné realimentace
(Pokusy z 50.-60. let 20.stol.)
INSULIN
IF- Intermitentní krmení (intermittent feeding/fasting)
71
Adaptace buněčného metabolismu – játra a tuková tkáň -
orgány intenzívního metabolismu (lipogeneze, glykogenosyntéza)
Upraveno podle: Petrásek R. et al., 1970
Glykogen v játrech
Důsledek střídání 24 h hladovění
a následné realimentace
Dynamika odpovědi
u krys
72
Charakter metabolické odpovědi je
nelineární
Intenzita odpovědi
je závislá na délce adaptace
73
Rizika vyplývající ze změněné frekvence
příjmu potravy
(důsledky a možnosti ovlivnění
fyziologických funkcí – celkové odolnosti)
Deregulace cytokinetiky
74
Tukový a
energetický
metabolismus
vs.
radiační stres ionizující
záření
75
Využití radiací utlumené krvetvorby
jako modelu in vivo
pro studium regenerace krvetvorných funkcí
Princip,
volba dávky,
volba druhu laboratorního zvířete (myš)
Metoda CFU-S
76
Jestliže dojde k celotělovému vystavení ionizujícímu záření, dochází k rozvoji tzv.
RADIAČNÍHO SYNDROMU provázeného devastujícími účinky na organismus
(Nevada, USA)Dobový kontext
od 40.- 80. léta 20. stol.
Radiobilogický výzkum
především pro vojenské účely.
Důsledky:
Utlumení a poškození krvetvorby
(intenzívně proliferujících populací)
imunitních funkcí a celého organismu.
Vznik nádorů včetně leukémií atd. ,smrt.
Porušení rovnováh na úrovni
buněk, tkání, organismu
77
Model radiací utlumené krvetvorby in vivo
Formy nemoci z ozáření (myš)
Viz. výše včetně C.N.S.100 GyCentrálně nervová
Epitely, zejména střeva5 -10 GyStřevní
Kmenové buňky K.D.0.1- 6 GyDřeňová (má smysl 1)
Hlavní oblasti postiženíDávkaForma nemoci z ozáření
1) zvládnutí této formy (u myši do 6-10ti Gy) rozhoduje o přežití organismu
Pozitiva:
1) výsledky uplatnitelné v radioterapii nádorů
2) objev kmenové buňky krvetvorby
3) radiací utlumená krvetvorba – model pro studium regeneračních
schopností krvetvorby a celého savčího organismu viz níže:
Průběh nemoci závisí zejména
1) na dávce ozáření
2) na druhu a celkové „kondici“ organismu.
Po ozáření (cca 8 Gy) dojde k vyhlazení krvetvorných buněk. Po transplantaci
syngenních kmenových buněk kostní dřeně ze zdravých jedinců ozářeným zvířatům lze
sledovat úpravné procesy po rozličných typech ovlivnění a studovat, které faktory
rozhodují o výsledném efektu.
78
KMENOVÉ a PROGENITOROVÉ
buněčné populace
(včetně buněk krvetvorných
a buněk střevních epitelů)
jsou velmi CITLIVÉ k působení
škodlivých faktorů vnějšího
prostředí (včetně radiace).
Proto je
a) míra jejich poškození,
(které vede k destrukci
imunitního systému a intoxikaci organismu)
b) i rychlost regenerace
limitující pro obnovu a přežití
celého organismu
Dlouho je známo, že
79
Prof. Milan Pospíšil – BFÚ
Dřívější náhodná pozorování in vivo ukázaly, že:
zvířata se spontánně vyšší kapacitou lipogeneze
a aktivovaným energetickým metabolismem
se vyznačují celkově vyšší citlivostí k ozáření (radiosenzitivitou) !!!
Otázky:
Do jaké míry a jakým způsobem může určitá
metabolická orientace jedince
- ovlivnit celkovou zdatnost a odolnost vůči pronikavé radiaci?
- jak lze tyto vtahy detailněji studovat, metodicky podchytit?
(vhodné metodické propojení)
cíl: podrobnější vymezení vztahů mezi
specifickou metabolickou orientací
a
chováním obnovných buněčných populací a celkovou odolností
(s využitím ozáření jako zátěžového faktoru)
Další východiska vztahující se k problematice
( RQ 1)
80
Kozubík A., et al.: Gen. Physiol. Biophys.:
7, 293-302, 1988Vlastní výsledky u myší
RQ >1
Bez ozáření Po ozáření
? „IF“ - Model - změna frekvence příjmu potravy
Dynamika a intenzita lipogeneze
81
BUŇKY KOSTNÍ DŘENĚ (KB)
POSTIRADIAČNÍÚPRAVA
PROLIFERAČNÍAKTIVITYBUŇEK
KOSTNÍDŘENĚ
PREIRRADIAČNÍBIOSYNTÉZA
MASTNÝCHKYSELIN
RADIOREZISTENCE
543210
Přežívání po ozáření
Vliv délky adaptace na celkovou
radiorezistenci ke 30. dni po ozáření
(3 kmeny C a IF myší)
IF je faktor ovlivňující !!
lipidový a energetický metabolismus,
proliferaci buněk a odolnost organismu
(zhoršení i zlepšení)
Stejná potrava (přístup nepřetržitě vs. nárazově)
Kozubík A, Pospíšil, M.: Strahlentherapie 158, 734, 1982
-+
82
Zásahy do
intermediárního a energetického
metabolismu významně mění
odolnost organismu in vivo
(mj. ovlivněním krvetvorných b. populací).
V závislosti na intenzitě odpovědi
mohou vést ke zvýšení, ale i zhoršení
odolnosti.
Nezbytná je
„vyváženost tendencí“
83
Dílčí závěr
POSTIRADIAČNÍÚPRAVA
PROLIFERAČNÍAKTIVITYBUŇEK
KOSTNÍDŘENĚ
PREIRRADIAČNÍBIOSYNTÉZA
MASTNÝCHKYSELIN
RADIOREZISTENCE
543210
Kozubík A., Pospíšil M., Netíková J.: Folia biologica (Prague) 36, 291, 1990
1) Intenzita odpovědi je závislá na délce adaptace
2) Charakter odpovědi - reakce celého organismu - je nelineární.
K maximalní stimulaci lipogeneze dochází v prvním týdnu adaptace, pak klesá.
Lipogeneze je v inverzním vztahu k úpravě proliferace km. buněk kostní dřeně, což
pozitivně koreluje s přežíváním myší po ozáření (nejvyšší intenzita biosyntézy
mastných kyselin je provázena zhoršenou úpravou krvetvorby i přežíváním a naopak).
3) Je nárazový
příjem živin (IF)
stresorem?
Závěry:
Shrnutí
84
K zamyšlení I
Strukturu biologických membrán a co jsou tzv. lipidové rafty?
Co je „transdukce signálů“ (molekulární podstata) a jakým způsobem
dochází k multiplikaci signálů? Obecné principy.
Úlohu lipidů a fosfolipidů obecněji, jejich význam pro regulaci
buněčných procesů a pro organismus (včetně úlohy v energetickém
a intermediárním metabolismu)?
Metabolismus kyseliny arachidonové (AA) a hlavní dráhy přeměny?
Co můžete odvodit z její struktury a ze struktury jejich metabolitů?
Dovedeš nakreslit tyto struktury (AA, LTC4, PGE atd.)? Nakreslit
schéma libovolného fosfolipidu a vyznačit místa jeho štěpení
fosfolipázami s uvedením jejich názvů?
Molekulární mechanismy působení konkrétních vysoce nenasycených
mastných kyselin (n-3, n-6) a eikosanoidů, jejich fyziologickou úlohu?
Spolupůsobení látek různé chemické povahy a propojení jednotlivých
signálních drah? Uveď příklady.
85
Dovedeš popsat a vysvětlit
K zamyšlení II
Co víš o
porušení homeostázy a možnostech posílení obnovy poškozených
funkcí zásahy do metabolismu neutrálních lipidů;
lipidovém metabolismu a jeho vlivu na odolnost a regeneraci organismu
v důsledku změn výživy (obecněji);
Dovedeš popsat další příklady ovlivnění buněčných populací modulací
intermediárního a energetického metabolismu (např. úlohu
metabolismu v regulaci dělení buněk v souvislosti s působením
stresových faktorů)?
86
Děkuji za pozornost
87