Kapilární Izotachoforéza v = m . E v - rychlost iontu v elektickém poli E - intenzita elektrického pole m - elektroforetická pohyblivost FE - elektrická síla FE = Q x E Q - náboj iontu E – intenzita elektrického pole FF – frikční síla FF = -6rv  - viskozita roztoku r - poloměr iontu v – rychlost iontu + -FE FF Během elfo se vytvoří ustálený stav, ustálí se rychlost iontu. Platí: FE = FF při určité rychlosti Q x E = 6rv v = m x E m = Q/6r v = m . E v - rychlost iontu v elektickém poli E - intenzita elektrického pole m - elektroforetická pohyblivost Elektroforetická pohyblivost - vztažena vždy na prostředí, ve kterém se látka pohybuje - jednotky m2V-1s-1 - hodnota pro většinu iontů ~ 10-8 - vyjímky: H+ 362,5 x 10-9 m2V-1s-1 OH- 205,5 x 10-9 m2V-1s-1 Iontové pohyblivosti a pKa vybraných látek (25 oC) Iontová pohyblivost m . 10-9 (m2.V-1.s-1) pKa Na+ 51,9  - Alanin (+1) 36,7 3,552 Histidin (+1) 29,6 6,04 Tris 29,5 8,076 Cl- -79,1 kyselina octová -42,4 4,819 Kyselina propionová -39,1 4,874 Kyselina kapronová -30,2 4,857 - znaménko určuje směr pohybu iontu pohyblivost kationtů - kladné znaménko pohyblivost aniontů - záporné znaménko Získání údajů o pohyblivosti 1. literární prameny publikované obsáhlé tabulky Hirokawa T. and all. J. Chromatog. 271, D1 (1983) přepočet z dostupnějších limitních iontových vodivostí m =  - molární iontová vodivost F - Faradayova konstanta ( 96487 C mol-1 ) z - počet elementárních nábojů nesených iontem 2. Empirické rovnice Joklova: M - relativní iontová hmotnost možnost korelací - u podobných iontů dosadit do rovnice a zjistit číselné konstanty problém - u malých iontů (hlavně kovových) zůstává část hydratačního obalu, jehož velikost se těžko odhaduje zF mol 910).6,9 485 ( = M zm Bez korelace: 910).6,9 05,60 485( =m μ = - 52,9 . 10-9 Korelace: Příklad použití Joklovy rovnice Stanovení mobility kyseliny octové Kyselina octová Mr = 60,05 μ = - 42,4 . 10-9 m2/Vs Kyselina propionová Mr = 74,08 μ = - 37,1 . 10-9 m2/Vs 910).6,9 08,74 (1,37 = X 910).6,9 05,60 94,401( =m μ = - 42,3 . 10-9 X = 401,94 Skutečná pohyblivost - vliv vnějšího prostředí vliv iontové síly - Onsagerova rovnice m - iontová pohyblivost mo - limitní iontová pohyblivost zR - náboj protiontu I - iontová síla I I zzz R  =  1 )10.3,3123,0( 900 mmm Vliv teploty m (T) = m (To) [ 1 + a (T - To)] a 0,02 zvýšením teploty o 10 oC se zvýší pohyblivost přibližně o 20%  2 3 541 Efektivní pohyblivost vliv chemických rovnováh na pohyblivost iontů Tiselius: Látka, přítomná v roztoku ve více formách, které jsou navzájem v rychlé dynamické rovnováze, migruje elektrickým polem jako jediná látka o určité efektivní pohyblivosti m : xi - molární zlomky jednotlivých forem látky mi - iontové pohyblivosti jednotlivých forem látky i i ix mm = Princip metody Zónová elektroforéza Izotachoforéza Intenzita el. pole Teplota Pohyblivost Měrná vodivost Koncentrace protiiontu Vlastnosti izotachoforetických zón 1. Samozaostřující efekt T L 2. Koncentrace v izotachoforetických zónách Při analýzách s neměnnou koncentrací vedoucího elektrolytu je koncentrace látek v zónách konstantní - lze využít délku zóny pro kvantitativní vyhodnocení - koncentrace látek v původním vzorku nemá žádný vliv na výslednou koncentraci látky v adjustované izotachoforetické zóně L RL RX X LX cc m mm mm m   = .. Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH 8,8 Tris/gly pH 8,8 Tris/HCl pH 6,8 Tris/HCl pH 8,8 Tris/HCl pH 6,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH 8,8 Tris/gly pH 8,8 Tris/HCl pH 6,8 Tris/HCl pH 8,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH 8,8 Tris/gly pH 8,8 Tris/HCl pH 6,8 Tris/HCl pH 8,8 Diskontinuální elektroforéza Tris/gly pH 8,8 Tris/gly pH 8,8 Tris/HCl pH 6,8 Tris/HCl pH 8,8 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Čas (s) Napětí(kV) Historie 1897 – Kohlrausch - teoretické základy metody 1923 – Kendall - první pokusy separace látek na izotachoforetickém principu 1953 – Longsworth – demonstrována možnost užití izotachoforézy jako analytické kapilární separační metody 1963 – Konstantinov a Ošurkovová – separace kationtů kovů v tenkostěnné skleněné kapiláře 1967 – popis prvního izotachoforeografu 1970 – začal se používat název izotachoforéza Komerční přístroje 1974 – Tachophor 2127 LKB, Bromma, Švédsko 1975 – IP-1B (následovaly IP-2A a IP-3A), Shimadzu, Kyoto, Japonsko 1983 – CS Isotachophoretic Analyser, Villa LABECO, Spišská Nová Ves, Slovensko Další výrobci: ITABA, Švédsko (Tachophor Delta) JZD Odra Krmelín (Agrofor) Villa LABECO, Spišská nová ves, Slovensko Předseparační kolony Délka 90 a 160 mm Průměr 0.8 mm Separační kolony Délka 90 a 160 mm Průměr 0.3 mm Dávkování vzorku mikrostříkačkou nebo dávkovacím kohoutem (30ml) Detektory Vodivostní Rozsah 30 k - 20 M  Detekční limit 1 x 10-10 M Fotometrický 254, 289 nm (405) detekční limit 5 x 10-12 M (kyselina pikrová) Možnost práce v roztocích s metanolem (do 30%) Maximální napětí 15 KV Maximální proud 500 mA Promytí systému vodícím ellytem Promytí systému vodícím ellytem Promytí nanášecího ventilu a prostoru pro koncový ellyt Promytí systému vodícím ellytem Promytí nanášecího ventilu a prostoru pro koncový ellyt Nanesení vzorku http://www.recman.cz/nova-generace/ IONOSEP detekční limit: 10-12 mol dávkované množství 10, 20, 30, 50 ml UV 160 – 800 nm autosampler Volba elektrodového systému - rozpustnost (vyšší mastné kyseliny-často nutno používat směsná rozpouštědla jako voda- metanol) - chemická stabilita (oxidace či redukce v elektrolytu, srážení iontů z roztoku např Pb2+ či Ag+ x Cl-ionizace analyzovaných látek (velmi důležité kriterium pro všechny elektromigrační metody) V případě slabých kyselin a bází je stupeň jejich ionizace závislý na pH prostředí (v ITP na pH dané zóny) 0.1 cH+ = 0.9 KHA -1 – pH = -0.045 - pKHA Jednosytná slabá kyselina (HA) Disociační konstanta je rovna: Disociační stupeň pak: Pro efektivní pohyblivost platí: Slabá kyselina je disociována z 50% při pH=pKHA, tedy: Pro je disociace větší než 10% což už je podmínka pro migraci analyticky využitelnou Analogická situace je u slabých bazí: HA AH HA c cc K  =    == HHA HA A A A cK K c c  AAA mm .=  = HHA HA AA cK K .mm 5,0== A A A m m  1 HA pKpH    = HBH H BB cK c .mm Ostwaldův zřeďovací zákon: HA H+ + A- CH+ = α . c CA- = α . c CHA= (1- α) . c Z toho α : )1( . ).1( ... 2      =  = c c cc KHA )1( /.2    =  H c KHA  = HHA HA cK K  1,0== A A A m m   = HHA HA cK K 1.0 1 BH pKpH Kationtová ITP Aniontová ITP vedoucí ion K+, NH4 +, Na+ Clterminátor Slabá báze Slabá kyselina Protiion Slabá kyselina Slabá báze Podmínka ionizace analyzovaných látek pH  pKBH +1 pH  pKHA -1 protiion pH Koncový elektrolyt Kyselina octová 4,2 –5,2 GABA Kyselina propionová 4,4 – 5,4 Kreatinin MES 5,7 – 6,7 Histidin, imidazol veronal 6,9 – 7,9 Imidazol, triethylendiamin asparagin 8,3 – 9,3 Triethanolamin, Tris glycin 9,1 – 10,1 Triethanolamin, NH3  -alanin 9,8 – 10,8 NH3, ethanolamin Kationty Vedoucí elektrolyt: 5 – 50 mM KOH + protiion protiion pH Koncový elektrolyt  - Alanin 3,1 – 4,1 Kyselina glutamová Kyselina propionová Kyselina kapronová EACA 4,1 – 5,1 Kyselina glutamová Kyselina propionová Kyselina pivalová Kreatinin 4,5 – 5,5 Kyselina pivalová MES Histidin 5,5 – 6,5 MES, HEPES Imidazol 6,6 – 7,6 MES, veronal Tris 7,6 – 8,6 Glycin + Ba(OH)2 Asparagin + Ba(OH)2 Ammediol 8,3 – 9,3 Glycin + Ba(OH)2 EACA + Ba(OH)2 ethanolamin 9,0 – 10,0 EACA + Ba(OH)2 Anionty Vedoucí elektrolyt: 2 – 20 mM HCl + protiion + aditivum (0,05 – 0,2% polyvinylalkohol, 0,05 – 0,5% hydroxyetyl celuloza, 0,05 – 0,5% Triton X-100) Jevy provázející separaci Elektroosmotický tok  - permitivita roztoku  - viskozita roztoku  - elektrokinetický potenciál ( zeta potenciál )   E v = Vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody, začnou kationty migrovat směrem ke katodě a zároveň budou odpuzovány od kationtů, které jsou umístěny v nepohyblivé části dvojvrstvy. Protože kationty migrují směrem ke katodě i se svými solvatačními (hydratačními obaly) dochází k pohybu celé kapaliny uvnitř kapiláry směrem od anody ke katodě. možnosti řešení: - zvýšení viskozity roztoku přídavkem 0,05 – 0,3 % derivátu celulosy (hydroxypropyl-, hydroxyethyl-, hydroxypropylmethyl-) do vedoucího elektrolytu - obrácení znaménka elektrokinetického potenciálu přídavkem kationogenního smáčedla (např. 1mM cetyltrimethylamonium bromid) do vedoucího elektrolytu - snížení elektrokinetického potenciálu přídavkem 0,05 – 0,2% neionogenních smáčedel (Triton X-100, polyetylenglykol, polyvinylalkohol) do vedoucího elektrolytu   E v = Jouleovo teplo - elektrický ohřev je hlavním limitujícím faktorem velikosti hnacího proudu -výrazně jsou ovlivňovány iontové pohyblivosti separovaných látek -vznikají teplotní gradienty a tedy další nehomogenity -ohřev ovlivňuje disociaci slabých kyselin a zásad -může docházet k destrukci termolabilních látek Největší problém u krátkých zón, které předcházející zóna ovlivňuje Kapiláry: FEP – kopolymer perfluorovaného polyetylénu a polypropylénu PTFE – Teflon (polytetrafluoroetylen) - nevhodný kruhový průřez, špatná tepelnou vodivost - dobrá chemická a mechanická odolnost, malý elektroosmotický tok a snadno se vyrábějí příklad: vodící ion 5mM NaBr terminál jodičnan 50 mA je třeba 10 mm, aby teplota v zóně dosáhla ustálené hodnoty Účinnost termostatování: T – střední teplota zóny T0 – termostatovací teplota Kvocient q se stanovuje experimentálně tak, že při různých termostatovacích teplotách měříme proud protékající kapilárou (např. 1 mol/l KCl) v závislosti na vloženém napětí. Ideálně q = 0 Tachofor (0,8 mm) q = 1,36 KmW-1 EIqTT = 0 Gravitace Rozdílná hustota ITP zón vede k deformaci rozhraní možnosti řešení: - separace v inertních nosičích a gelech - hustotní gradient neionogenní látky - podmínky nulové gravitace - stabilizace zón gravitací tenké kapiláry metoda pro eliminaci balastních složek vzorku možná kombinace s koncentrační kaskádou Villa LABECO: Předseparační kolona Délka 90 a 160 mm Průměr 0.8 mm Separační kolona Délka 90 a 160 mm Průměr 0.3 mm první část kapiláry naplněna koncentrovaným roztokem vedoucího elektrolytu (vyšší separační kapacita x nižší citlivost [kratší zóna]) druhá část kapiláry naplněna vedoucím elektrolytem o nižší koncentraci L RL RX X LX cc m mm mm m   = .. původní rychlost vEL se snižuje o rychlost toku protiproudu vH na rychlost v metoda zvyšuje migrační dráhu zón (separační kapacitu) migrační rychlost můžeme snížit max. o 30% ( jinak dochází k narušení ostrosti zónových rozhraní) protiproud nastaven tak, aby vykompenzoval elektromigrační pohyb zón metoda slouží k zakoncentrování velkých objemů naředěných vzorků vlastní separace pak probíhá bez protiproudu Mapa enviromentálních zátěží ● zátěže po těžbě uranu ● zátěže po těžbě polymetalických a ostatních rud ● zátěže po těžbě uhlí Likvidace a sanace lokality do roku 2005 (v milionech Kč) Dokončení likvidace, sanace, čerpání, čištění vod, monitoring max. do roku 2040 (v milionech Kč) Zátěže po těžbě uranu 10213 49766 Zátěže po těžbě polymetalických a ostatních rud 1423 821,7 Zátěže po těžbě černého uhlí a lignitu 9472 7395,4 celkem 21108 57983 Sledování buněčné aktivity bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans Konečné produkty H+ SO4 2pH metr Gravimetrie Chromatografie Elektromigrační metody 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Čas (s) Napětí(kV) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 dny S04 2- ,S2O3 2- aH + (mmol/l) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 H+ S2O3 2- SO4 2- vyšší polythionany S4O6 2- polythionany(A.U.)