Využití kapilární elektroforézy pro studium enzymů Roman Řemínek Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kamenice 5, 62500 Brno Nové směry v bioanalytické chemii Kapilární elektroforéza •Capillary Electrophoresis (CE) •Elektroforéza = separační technika založená na rozdílech rychlosti migrace látek ve stejnosměrném elektrickém poli •1807 - Kataforéza •1930 - Volná elektroforéza •1939 - Zónová elektroforéza •1967 - CE •1987 - 1. komerčně dostupný CE systém •1990–2003 - projekt lidského genomu •1992 - CE na čipu Výsledek obrázku pro capillary electrophoresis chip Historie CE Projekt lidského genomu •Sangerova metoda sekvenování DNA Projekt lidského genomu CE - princip separace Elektroosmotický tok CE - princip separace Výhody a omezení CE +Aplikační diverzita Þod atomů po celé buňky, variabilita detekce +Vysoká separační účinnost Þaž miliony teoretických pater +Malá spotřeba vzorku Þjednotky až desítky nL +Malá spotřeba chemikálií Þdesítky mL týdně +Automatizace Þ Minimální riziko experimentální chyby Þ Vysoká propustnost systému -Citlivost (v porovnání s HPLC) -Robustnost (v porovnání s HPLC) Výsledek obrázku pro loh peking Instrumentace CE Výsledek obrázku pro 7100 ce system Výsledek obrázku pro beckman coulter 800 capillary electrophoresis SouvisejÃcà obrázek Capillary electrophoresis system Capel-205 price Výsledek obrázku pro fused silica capillary Agilent 7100 Backman Coulter 800 Plus Lumex Capel-205 PrinCE NEXT CE a (U)HPLC •CE v současnosti představuje ortogonální techniku k (U)HPLC Þ 1. výběr separačního systému podle analytu • 2. 2D separace SouvisejÃcà obrázek 2d_setup Praktické aplikace CE •Analýzy DNA (RNA) •+ aplikace ve forenzní analýze •Separace proteinů (Projekt lidského proteomu) •Analýzy a studium protilátek •QC při výrobě bio-farmaceutických preparátů (protilátky, vakcíny, proteiny, peptidy) •Bioanalýzy ve výzkumu • •+ omezené množství vzorku, případně obtížné podmínky Enzymy •Enzym = biologický katalyzátor •enzymy snižují aktivační energii reakce => výrazné zrychlení (108 – 1014× oproti nekatalizované reakci) 2 H2O2 O2 + 2 H2O Rychlostní konstanta: Bez katalýzy: 0,23 s-1 Pt: 1,3 × 103 s-1 Katalasa: 3,7 × 107 s-1 figure 5-01 Pt Katalasa Enzymy •Význam - prakticky všechny biologické reakce v organismu jsou řízeny enzymaticky •- potravinářství a průmyslová výroba •- biotechnologie •- léčiva •- cíl léčiv v organismu SouvisejÃcà obrázek SouvisejÃcà obrázek •Farmakodynamika Farmakokinetika Vývoj léčiv Vývoj léčiv SouvisejÃcà obrázek Þ ADME/tox studie Vývoj léčiv ADME/tox Intrinsic clearance Bioavailability Drug half-life Kinetic parameters Inhibition parameters etc. Dosing frame? Administration frequency? Dose-exposure relationship linearity? Drug-drug interactions? etc. Vývoj léčiv Studium metabolismu léčiv •cytochromy P450 (CYP), hem-thiolátové oxidoreduktázy, zodpovídají za biotransformaci přibližně 90 % běžně používaných léčiv Lewis, D.F.V., Pharmacogenomics 2003, 4, 387–395. Model struktury CYP2C9. Podíl jednotlivých isoforem CYP na metabolismu léčiv u člověka. Stanovení aktivity CYP pomocí CE Třepačka CE systém Inkubace Analýza http://images.novusbio.com/design/assay_kit.jpg •bez nutnosti použití fluorescenčně nebo radiometricky značených sloučenin Þ Þ RH + O2 + NADPH + H+ ROH + NADP+ + H2O CYP Příklad studie v off-line uspořádání https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0021967307019152-gr1.jpg https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0021967307019152-gr2.jpg https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0021967307019152-gr3.jpg 4’-hydroxylace diklofenaku CYP2C9 Konečný, J., Mičíková, I., Řemínek, R., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2008, 1189, 274–277. Kinetika enzymové reakce •Michaelisova konstanta - Km •Mezní (limitní) rychlost reakce - Vmax Vmax Vmax/2 Km Km = Vmax × [S] Km + [S] Inhibice enzymové reakce https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0021967307019152-gr4.jpg https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0021967307019152-gr5.jpg •50% inhibiční koncentrace - IC50 •Inhibiční konstanta - Ki •Cheng-Prusoffova rovnice: • 50 % IC50 -1 / Vmax -1 / Km Lineweaver-Burk Plot [I] Ki = IC50 1 + [S] / Km Cheng, Y., Prusoff, W.H., Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099–3108. Lékové interakce http://ddrblog.files.wordpress.com/2009/11/j0405260.jpg http://www.drozfans.com/wp-content/uploads/2011/04/medicinePills1.jpg •vzájemné ovlivňování souběžně podávaných preparátů, kdy alespoň jeden z nich působí jako inhibitor nebo induktor cytochromů P450 − •Např.: 1. indukce: rifampicin + cyklosporin A • 2. inhibice: sulfaphenazol + warfarin •Lidské jaterní mikrosomy • • =Malé vezikuly získané z endoplazmatického retikula homogenizované jaterní tkáně • +vysoká koncentrace CYP +zastoupení všech isoforem CYP +vysoká enzymová aktivita +jednoduchá příprava a použití +vysoká stability při skladování a inkubaci 1. 2. příklad studie v off-line uspořádání Hepatocyt RH + O2 + NADPH + H+ ROH + NADP+ + H2O CYP Dávkování z krátkého konce Stanovení stability léčiv Bufuralol - Bupivakain + Cyclosporin + Cisapride - Erythromycin + Lidokain + Nifedipin - Propanolol - Quinidin - R-Warfarin - Testosteron - Verapamil - •R. Řemínek, J. Pauwels, X. Wang, J. Hoogmartens, Z. Glatz, A. Van Schepdael, in: C. D. García, K. Y. Chumbimuni-Torres, E. Carrilho (Eds.), Capillary Electrophoresis and Microchip Capillary Electrophoresis: Principles, Applications, and Limitations, John Wiley & Sons. Inc., Hoboken, 2013. On-line uspořádání CE •Off-line On-line Termomixér CE systém Inkubace Analýza Inkubace + analýza CE systém µL nL •1. Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA, Electrophoretically Mediated MicroAnalysis) •a. Kontinuální mód •b. Zonální mód • •2. Míchání difuzí a.Podélnou (At-Inlet) b.Příčnou (TDLFP, Transverse Diffusion of Laminar Flow Profiles) c. •3. Imobilizovaný Enzymový reaktor (IMER, IMmobilized Enzyme Reactor) On-line uspořádání CE 1a. EMMA, kontinuální mód Bao, J., Regnier, F.E., J. Chromatogr. 1992, 608, 217–224. 1b. EMMA, zonální mód Harmon, B.J., Petterson, D.H., Regnier, F.E., Anal. Chem. 1993, 65, 2655–2662. 2a. At-Inlet metody Van Dyck, S., Vissers, S., Van Schepdael, A., Hoogmartens, J., J. Chromatogr. A 2003, 986, 303–311. 2b. TDLFP Okhonin, V., Liu, X., Krylov, S.N., Anal. Chem. 2005, 77, 5925–5929. 2b. TDLFP Řemínek, R., Zeisbergerová, M., Langmajerová, M., Glatz, Z., Electrophoresis 2013, 34, 2705–2711. 3. IMER Např. prof. Zuzana Bílková, Katedra biologických a biochemických věd, FCht, UPCE Příklad studie v uspořádání EMMA •Dextrometorfan - antitusikum • - aktivní látka ve volně prodejných přípravcích • Příklad studie v uspořádání EMMA Zeisbergerová, M., Řemínek, R., Mádr, A., M., Glatz, Z., Hoogmartens, J., Van Schepdael, A., Electrophoresis 2010, 31, 3256–3262. •1 - EMMA, 2 - At-inlet, produkt reakce: Dextrorfan Příklad studie v uspořádání EMMA Zeisbergerová, M., Řemínek, R., Mádr, A., M., Glatz, Z., Hoogmartens, J., Van Schepdael, A., Electrophoresis 2010, 31, 3256–3262. Příklad studie v uspořádání TDLFP Řemínek, R., Zeisbergerová, M., Langmajerová, M., Glatz, Z., Electrophoresis 2013, 34, 2705–2711. Příklad studie v uspořádání TDLFP Řemínek, R., Zeisbergerová, M., Langmajerová, M., Glatz, Z., Electrophoresis 2013, 34, 2705–2711. Příklad studie v uspořádání TDLFP K´m = 2,66 ± 0,18 μM V´max = 7,91 ± 0,22 nmol min-1 nmol-1 n = 1,59 ± 0,16 IC50 = 0,94 ± 0,04 μM K´i = 0,39 ± 0,07 μM Řemínek, R., Zeisbergerová, M., Langmajerová, M., Glatz, Z., Electrophoresis 2013, 34, 2705–2711. Enantioselektivní separace •~ 60 % léčiv na trhu jsou chirální sloučeniny •! Jednotlivé enantiomery aktivní látky mohou mít značně rozdílné farmakokinetické a farmakodynamické vlastnosti, jako např. S a R thalidomid. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a5/NCP14053.jpg Rentsch, K. M., J. Biochem. Biophys. Methods 2002, 54, 1–9. •Ketamin - léčivo s anestetickým a analgetickým účinkem používané v zdravotnické a veterinární praxi http://i.imgur.com/ISibs.png CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 Enantioselektivní separace File:Gamma CD cone shape.jpg Structure of AGT complexes with β-CD (a) and γ-CD (b). (Reproduced with permission of Wiley-VCH from Ref. 50.) Enantioselektivní separace Podmínky inkubace: 200 nM CYP3A4, 400 µM ketamin (rac), 2 mM NADPH; 10 min v kapiláře termostatované na 37 °C Řemínek, R., Glatz, Z., Thormann, W., Electrophoresis 2015, 36, 1349–1357. Enantioselektivní separace S-Norketamine R-Norketamine RSD of tM intraday (n = 6), 40 µM Ket intraday (n = 6), 400 µM Ket interday (n = 6 x 6), 40 µM Ket interday (n = 6 x 6), 400 µM Ket 1,21 % 1,15 % 3,36 % 4,61 % 1,31 % 1,22 % 3,20 % 4,83 % RSD of Ar intraday (n = 6), 40 µM Ket intraday (n = 6), 400 µM Ket interday (n = 6 x 6), 40 µM Ket interday (n = 6 x 6), 400 µM Ket 3,68 % 2,96 % 6,76 % 7,47 % 4,57 % 2,03 % 8,09 % 6,37 % Linearity 2.5 – 200 µM Mean of calibration curves R2 (n = 6) RSD of calibration curves slopes ( n = 6) 0.995 2.03 % 0.995 2.03 % LOD (N/S = 3) 0.8 µM LOQ (N/S = 10) 2.5 µM Control sample, mean / RSD (n = 6 x 6, 15 µM) (n = 6 x 6, 100 µM) 15.45 µM / 5.06 % 96.33 µM / 6.14 % 15.89 µM / 5.45 % 98.46 µM / 6.01 % Recovery 96.05 – 102.60 % 93.22 – 102.83 % Enantioselektivní separace KM (µM) Vmax (nmol/min/nmol) 74.22 ± 5.75 15.66 ± 0.52 79.54 ± 8.49 10.13 ± 0.48 62.91 ± 8.02 8.18 ± 0.40 66.45 ± 6.62 7.47 ± 0.31 Enantioselektivní separace Řemínek, R., Glatz, Z., Thormann, W., Electrophoresis 2015, 36, 1349–1357. Enantioselektivní separace Ketoconazole Substrate IC50 (µM) Ki (µM) S-Ketamine (Rac) 0.93 ± 0.10 0.45 ± 0.11 R-Ketamine (Rac) 0.93 ± 0.11 0.46 ± 0.09 S-Ketamine 0.52 ± 0.15 0.26 ± 0.14 R-Ketamine 0.45 ± 0.17 0.22 ± 0.18 Enantioselektivní separace Řemínek, R., Glatz, Z., Thormann, W., Electrophoresis 2015, 36, 1349–1357. Příklad studie v uspořádání IMER •reaktor s vázaným CYP2C9 mikročástice SiMAG-karboxyl (Ø = 1 μm), činidla: 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] karbodiimid (EDAC), N-hydroxysukcinimid (NHS) B Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Příklad studie v uspořádání IMER Příklad studie v uspořádání IMER Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Příklad studie v uspořádání IMER Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Příklad studie v uspořádání IMER Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Příklad studie v uspořádání IMER Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Příklad studie v uspořádání IMER Schejbal, J., Řemínek, R., Zeman, L., Mádr, A., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2016, 1437, 234–240. Online CE •+ homogenní reakční směs •+ prolnutí zón E a S => žádné ředění •- pracná optimalizace míchání + univerzální - nehomogenní reakční směs + homogenní reakční směs bez ředění + univerzální - stabilita a aktivita enzymu Alzheimerova choroba •= progresivní, nevratné, neurodegenerativní onemocnění •≈ 34 milionů pacientů (2015) Beta-sekretáza ADEAR: "Alzheimer's Disease Education and Referral Center, a service of the National Institute on Aging.". H.M. Kumalo, S. Bhakat, M.E. Soliman, J. Biomol. Struct. Dyn. 2016, 34, 1008–1019 https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fb/Amyloid-plaque_formation-big.jpg •= BACE1 (β-site amyloid precursor protein cleaving protein enzyme 1) •= aspartátová proteáza Beta-sekretáza http://www.4ti.co.uk/application/files/4114/6581/6407/Vision-Plate-parallax1.jpg •pro studie aktivity BACE1 jsou využívány analytické systémy založené na FRET (Förster Resonance Energy Transfer) technologii -nízká rozpustnost fluorescenčně značených substrátů -riziko falešně pozitivních/negativních výsledků Off-line uspořádání s CE-ESI-QTOF Výsledek obrázku pro qtof maxis impact Výsledek obrázku pro bruker maxis impact esi spray Schejbal, J., Slezáčková, L., Řemínek, R., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2017, 1487, 235–241. Off-line uspořádání s CE-ESI-QTOF Off-line uspořádání s CE-ESI-QTOF Schejbal, J., Slezáčková, L., Řemínek, R., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2017, 1487, 235–241. Off-line uspořádání s CE-ESI-QTOF Schejbal, J., Slezáčková, L., Řemínek, R., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2017, 1487, 235–241. Off-line uspořádání s CE-ESI-QTOF Schejbal, J., Slezáčková, L., Řemínek, R., Glatz, Z., J. Chromatogr. A 2017, 1487, 235–241. Současné trendy v bioanalýze •Minituarizace •Zvyšování propustnosti systémů •Zvyšování citlivosti • → CE na čipu →spojení mikrofluidiky a CE na principu Lab-on-Chip →CE-MS standardem • (Sheetless CE-MS?) Výsledek obrázku pro droplet microfluidics SouvisejÃcà obrázek SouvisejÃcà obrázek Současná a budoucí témata CE? •aplikace •proteomika (native CE) •studium glykosylací proteinů •mikrofluidika a CE •multidimenzionální analýzy •analýzy jednotlivých buněk •hledání extraterestriálního života Výsledek obrázku pro glycosylation Mise NASA •Mars Science Laboratory (2012–současnost) •Europa Clipper (2022?) •Enceladus Life Finder → hledání aminokyselin a malých organických kyselin pomocí CE-C4D a CE-MS • Výsledek obrázku pro enceladus nasa mission https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/ce/PIA19808-MarsCuriosityRover-AeolisMons-Bu ckskinRock-20150805.jpg/800px-PIA19808-MarsCuriosityRover-AeolisMons-BuckskinRock-20150805.jpg Výsledek obrázku pro europa jupiter