Využití hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF nejen v proteomice Ondrej Šedo Nové směry v bioanalytické chemii Brno, 15. 10. 2018 Research programme 4: Genomics and Proteomics of Plant systems Research Group Proteomics Proteomics Core Facility Využití hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF nejen v proteomice 1. Historie a princip MALDI-TOF MS 2. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS 3. MALDI-TOF MS v klinické diagnostice 2 3 Princip MALDI-TOF MS - MALDI-TOF MS = Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – - Time of Flight Mass Spectrometry Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací s průletovým analyzátorem OH OH O OH OH O OCH3 CH3 O OH O H O O HO C H3 + 66431 50 100 150 200 250 300 Intens.[a.u.] 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 m/z Princip MALDI-TOF MS: stanovení MW (nedochází k fragmentaci molekul) 4 Karas M., Bachmann D., Bahr U., Hillenkamp F., Int. J. Mass. Spectrom. Ion Proc. 78 (1987) 53. Tanaka K., Waki H. Ido Y., Akita S. Yoshida Y. Yoshida T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 2. Koiči Tanaka OH OH O OH OH O CH3 O OH N OH O O OH CH3 nano-kobalt, glycerol Koiči TanakaMichael Karas, Franz Hillenkamp Historie MALDI-TOF MS 5 0 100 200 300 400 500 600 Intens.[a.u.] 62000 64000 66000 68000 70000 72000 74000 m/z 66431 68584 + Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS: Stanovení míry modifikace proteinu Přesnost určení MW < 0,1 % Detekční limit ~ pmol 6 Převzato z www.promega.com Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování - proteolýza 7 6 0 0 1 1 0 0 1 6 0 0 2 1 0 0 m / z 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 a . i . Přesnost stanovení MW< 0,001 % Detekční limit ~ fmol Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování – stanovení MW 8 proteáza databáze modifikace molekulová hmotnost peptidů Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování – databázové vyhledávání 9 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Peptidové mapování – databázové vyhledávání 10 m/z 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 [Abs. Int. * 1000] 649.360 223-228 841.485 483-489 927.512 161-167 1163.587 66-75 1249.571 35-44 1283.664 361-371 1305.664 402-412 1362.621 89-100 1386.562 286-297 1439.763 360-371 1479.750 421-433 1567.707 347-359 1639.901 437-451 1667.784 469-482 1823.899 508-523 1850.870 529-544 1888.945 169-183 2045.057 168-183 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – výběr prekurzorového iontu 11 12 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – výběr prekurzorového iontu 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4x10 Intens.[a.u.] 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z 1567.69 13 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – výběr prekurzorového iontu 175.131 1452.530 334.176 425.233 120.084 591.297262.174 1567.710720.335 830.374 977.399 1121.437 1381.500 70.054 478.214 0 1 2 3 4 5 4x10 Intens.[a.u.] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z 14 A1A2A3A4A5A6 ↓ A1 A2A3A4A5A6 A1A2 A3A4A5A6 A1A2A3 A4A5A6 A1A2A3A4 A5A6 A1A2A3A4A5 A6 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – fragmentace prekurzorového iontu proteáza databáze modifikace molekulová hmotnost peptidů a jejich MS/MS fragmentů Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – databázové vyhledávání 15 16 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – databázové vyhledávání peptid DAFLGSFLYEYSR 17 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS MS/MS ion search – databázové vyhledávání Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Aplikace – kombinace MS s předchozí separací první rozměr IEF IEF proužek na SDS gel druhý rozměr SDS-GE klesajícíMW rostoucí pI vzorek -+ + - 2D GE – dvoudimenzionální gelová elektroforéza 1) IEF – izoelektrická fokuzace 2) SDS-PAGE – denaturující elektroforéza v polyakrylamidovém gelu 18 Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS Aplikace – proteolýza in-gel (z vyřezaných kousků gelu) 19 Bouchal P., Struhárová I., Budinská E., Vyhlídalová T., Zdráhal Z., van Spanning R., Kučera I. Biochim Biophys. Acta 6 (2010) 1350. MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: příčiny neúspěchu v identifikaci biomarkerů - nižší produkce markerů u asymptomatických malých nádorů - stejné proteiny produkují i zdravé tkáně (detekce modifikací) - ovlivnění hladiny markeru jinými onemocněními - ekonomická/diagnostická výhodnost oproti současným postupům - stabilizace vzorků po odběru (inhibice proteáz, rozpad krvinek) - vhodnost metody analýzy a interpretace výsledků - preanalytická fáze (vliv věku, rasy, pohlaví, stravy, režimu, léků…) 20 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: identifikace bakterií 9626 4305 4812 6423 6888 889066135932 3208 8090 4044 4588 5506 91772962 5051 10103 3583 0 2000 4000 6000 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z 21 5176 6105 6797 779773954790 102688305 949942652795 3405 8972 4976 116763897 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 5x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii 53814364 6255 5096 9553 2833 71584776 6507 8368 89937869 4183 10299 0 2 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Escherichia coli 4435 6048 5211 6678 7236 7923 8357 9091 97002213 3020 3613 0 500 1000 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Pseudomonas aeruginosa Kingella kingae50502524 44263154 3592 2212 4120 59684704 71842746 5320 0 2000 4000 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 22 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: identifikace bakterií 5176 9931 6105 6832 83204265 947773814966 89722585 34143051 4486 5932 3879 11082 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 5x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter bouvetii 5175 6105 74486930 92942585 833542653723 47843051 89866642 7186 99745626 0 1 2 3 4 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter haemolyticus 5176 6105 6797 779773954790 102688305 949942652795 3405 8972 4976 116763897 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 5x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii 4269 5176 6091 6871 7393 8320 96742585 48403436 89443043 3827 4474 10076 0 1 2 3 4 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter towneri 23 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: identifikace bakterií 5176 6105 739668024265 922377972585 47553399 66113050 1001683203897 59335393 0 1 2 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii NIPH 2122 5176 6105 6814 739642652585 95115729 779747553405 8320 102693050 6611 89733897 0 2 4 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii NIPH 2124 5175 6104 6814 7395 102952585 4264 4755 92223405 7822 83193050 66093909 5932 0.0 0.5 1.0 1.5 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii NIPH 2126 5175 102676104 68014265 7394 7796 92223013 2584 831947543398 6610 5007 3896 5932 10014 0.0 0.5 1.0 1.5 4x10 Intens.[a.u.] 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z Acinetobacter johnsonii NIPH 2269 24 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice: identifikace bakterií I. MALDI-TOF hmotnostní spektrometr II. Databáze referenčních spekter III. Software pro srovnání dat 6000 8000 10000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 a.i. 6000 8000 10000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 a.i. 4491 4368 4363 4356 4354 2807 1909 1769 667 658 655 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií 25 Výhody: - doba analýzy ~ minuty - identifikace na úrovni druhu, případně i detailnější - minimální náklady na analýzu - identifikace vzorků s abnormálním fenotypem Nevýhody: - vysoká pořizovací cena - problémy s rozlišením blízce příbuzných druhů - identifikace ze směsných vzorků 26 MALDI-TOF MS v klinické diagnostice Identifikace bakterií 01002003004005006007008009001000 A_guillouiae_NIPH_2681 A_guillouiae_NIPH_522_III A_guillouiae_NIPH_820 A_guillouiae_NIPH_2169 A_guillouiae_NIPH_2272 A_guillouiae_NIPH_2273_I A_guillouiae_NIPH_3626 A_guillouiae_NIPH_769 A_guillouiae_NIPH_2127 A_guillouiae_NIPH_682 A_guillouiae_NIPH_2689 A_guillouiae_NIPH_2273_II A_guillouiae_NIPH_522_I A_guillouiae_NIPH_522_II A_bereziniae_NIPH_1054 A_bereziniae_NIPH_2274_I A_bereziniae_NIPH_2528 A_bereziniae_NIPH_2537 A_bereziniae_NIPH_2542 A_bereziniae_NIPH_2524 A_bereziniae_NIPH_1741 A_bereziniae_NIPH_870 A_bereziniae_NIPH_2260 A_bereziniae_NIPH_2274_II A_bereziniae_NIPH_2532 A_bereziniae_NIPH_521_I A_bereziniae_NIPH_521_III A_bereziniae_NIPH_521_II Distance Level27 Shluková analýza na základě MALDI MS dat 01002003004005006007008009001000 Pilsner Urquell bottle 3 analysis I Pilsner Urquell bottle 3 analysis II Pilsner Urquell bottle 1 analysis I Pilsner Urquell bottle 1 analysis II Pilsner Urquell bottle 2 analysis I Pilsner Urquell bottle 2 analysis II Branik bottle 1 analysis I Branik bottle 1 analysis II Branik bottle 3 analysis I Branik bottle 3 analysis II Starobrno bottle 1 analysis II Starobrno bottle 2 analysis I Starobrno bottle 3 analysis I Starobrno bottle 3 analysis II Starobrno bottle 2 analysis II Budweiser Budvar bottle 1 analysis I Budweiser Budvar bottle 1 analysis II Budweiser Budvar bottle 2 analysis I Budweiser Budvar bottle 3 analysis I Primator bottle 1 analysis I Primator bottle 1 analysis II Cerna Hora bottle 2 analysis I Rychtar bottle 2 analysis II Rychtar bottle 3 analysis I Rychtar bottle 1 analysis I Rychtar bottle 2 analysis I Rychtar bottle 3 analysis II Rychtar bottle 1 analysis II Budweiser Budvar bottle 2 analysis II Budweiser Budvar bottle 3 analysis II Cerna Hora bottle 1 analysis I Cerna Hora bottle 1 analysis II Cerna Hora bottle 3 analysis I Cerna Hora bottle 3 analysis II Cerna hora bottle 2 analysis II Primator bottle 2 analysis I Primator bottle 2 analysis II Primator bottle 3 analysis I Primator bottle 3 analysis II Krusovice bottle 3 analysis I Staropramen bottle 3 analysis I Branik bottle 2 analysis I Branik bottle 2 analysis II Staropramen bottle 2 analysis II Staropramen bottle 2 analysis I Gambrinus bottle 1 analysis I Gambrinus bottle 1 analysis II Gambrinus bottle 3 analysis I Gambrinus bottle 3 analysis II Gambrinus bottle 2 analysis I Gambrinus bottle 2 analysis II Krusovice bottle 1 analysis II Krusovice bottle 2 analysis I Krusovice bottle 3 analysis II Starobrno bottle 1 analysis I Krusovice bottle 2 analysis II Zlaty Bazant bottle 3 analysis I Zlaty Bazant bottle 3 analysis II Zlaty Bazant bottle 2 analysis I Zlaty Bazant bottle 2 analysis II Staropramen bottle 1 analysis I Staropramen bottle 3 analysis II Staropramen bottle 1 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis II Krusovice bottle 1 analysis I Heineken bottle 1 analysis I Zlaty Bazant bottle 1 analysis I Heineken bottle 2 analysis I Zlaty Bazant bottle 1 analysis II Heineken bottle 1 analysis II Heineken bottle 3 analysis I Heineken bottle 2 analysis II Heineken bottle 3 analysis II Bernard bottle 1 analysis I Bernard bottle 1 analysis II Bernard bottle 2 analysis I Bernard bottle 2 analysis II Bernard bottle 3 analysis II Bernard bottle 3 analysis I Carlsberg bottle 1 analysis I Carlsberg bottle 1 analysis II Carlsberg bottle 2 analysis II Carlsberg bottle 2 analysis I Carlsberg bottle 3 analysis I Carlsberg bottle 3 analysis II Stella Artois bottle 1 analysis I Stella Artois bottle 1 analysis II Stella Artois bottle 2 analysis II Stella Artois bottle 2 analysis I Stella Artois bottle 3 analysis I Stella Artois bottle 3 analysis II Corona bottle 1 analysis I Corona bottle 1 analysis II Corona bottle 3 analysis I Corona bottle 2 analysis I Corona bottle 2 analysis II Corona bottle 3 analysis II 28 Šedo O., Márová I., Zdráhal Z. Food Chem. 135 (2012) 473. Alternativní aplikace MALDI-MS profilování