1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Toxikokinetika OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co by si student(ka) měl(a) odnést ? Jaké procesy chemická látka prodělává uvnitř ORGANISMU ? Co je to TOXIKOKINETIKA a jaké popisuje procesy. •Znát vstupy •Přeměny •Vylučování toxických látek v organismech 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TOXIKOKINETIKA -Osud látek v organismu – (vstupy / přeměny / vylučování) E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PŘÍJEM ~ ELIMINACE (rovnováha, homeostáza) - udržování látky v organismu pod úrovní škodlivého efektu - organismus však vynakládá energii na udržení rovnováhy (procesy eliminace, metabolismus ...) PŘÍJEM > ELIMINACE - nárůst koncentrací látky v organismu - časem překročení úrovně efektu (threshold level) Překročení limitů homeostatických procesů -> přechod ze stadia rezistence (resp. adaptace) do stadia pozorovatelných negativních efektů u jedince -> škodlivé efekty na vyšších úrovních organizace Toxicita = nerovnováha mezi VSTUPEM a VYLOUČENÍM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jaké procesy zahrnuje toxikokinetika? ADME! ADME Absorption Distribution Metabolism Elimination caption Toxicokinetics ... ... EXPOSURE phase à Determines the final dose 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxico-DYNAMIKA … viz dále http://4.bp.blogspot.com/-MebbujGDXi0/UAu26D7WxII/AAAAAAAAACk/StePoxIb3Go/s1600/2.png Dynamic simulation of processes causing toxicity and their grouping into toxicokinetics and toxicodynamics, illustrated on the example of the aquatic invertebrate Gammarus pulex. Mechanismus účinku (Mode of Action) ... a měřitelné ÚČINKY (efekty) TARGETS = macromolecules (DNA/RNA, proteins, membrane lipids) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příjem látek u různých organismů 1) jednobuněčné organismy - pasivní difuze přes membránu - „selektivní“ vstup přes existující transportní systémy 2) vícebuněčné organismy / řasy - difuze toxikantu přes membránu a mezi buňkami 3) terestrické rostliny - rozpuštěné ve vodě/půdě - vstup kořeny/listy - plyné toxikanty - vstup přes stomata na listech - lipofilní látky (některé herbicidy) - penetrace voskové kutikuly - vstup do buňky à přes membránu TOXIKOKINETIKA 1: příjem látek do organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 4) živočichové - 3 hlavní cesty vstupu do organismu - potrava/pitná voda - průchod trávicím traktem, změny/transformace dle pH, mikroflory střeva, př. cykasin: netoxický - ve střevě konverze->silný mutagen - respirační cesta - trachee u hmyzu, žábry u akvatických organismů, plíce - velká plocha pro výměnu/vstup látky (často 25x > povrch těla) - povrchem těla - větší význam u menších organismů (relativně větší plocha) a akvatických organismů >> vždy je prvním krokem přestup přes buněčnou membránu TOXIKOKINETIKA 1: příjem látek do organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bez ohledu na typ organismu a cestu vstupu (do vyšších organismů) musí toxikant překonat barieru plazmatické membrány (nebo i buněčné stěny) Membrány – klíčová překážka pro toxické látky proteins 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif A screenshot of a cell phone Description automatically generated Cesta látky tělem: Střevo à Krev à Játra à Krev à Ledviny à Vyloučení žluč Obrázek: vyznačeny jen „aktivní“ transportéry (pro živiny a jim podobné látky). Cizorodé látky - nejčastěji pasivní difúze 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přestup toxikantů přes membrány Nejčastější (všechny látky) - pasivní difuze Podskupina látek určitých vlastností (např. podobné živinám nebo dalším tělu přirozeným látkám) usnadněný transport / aktivní transport Velké molekuly + částice - pinocytoza 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přestup toxikantů přes membrány PASIVNÍ DIFUZE - náhodný pohyb molekul podle koncentračního gradientu - proces charakterizovatelný kinetikou prvního řádu - závisí na: - koncentračním gradientu - ploše a tloušťce membrány/buněčné stěny - rozpustnosti látky v tucích a ionizaci toxikantu - lipofilní látky - dobrá difuze - kationické - lepší navázání na povrch membrány (negativně nabité fosfolipidy) - molekulové hmotnosti - malé molekuly (<0.4 nm) rozpustné ve vodě (CO, HCN, N20, NO) dobrá pasivní difuze - příliš velké molekuly – špatný (nebo minimální) přestup TOXIKOKINETIKA 1 - příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přestup toxikantů přes membrány USNADNĚNÝ TRANSPORT - transmembránové proteiny vyvazují extracelulární látky a usnadňují přenos přes membránu : toxická látka - interference (Ca2+ / calmodulin, Fe2/3+ / transferin) AKTIVNÍ TRANSPORT - „pumpy“ po/proti koncentračnímu gradientu - navázání látky na receptor / přenos přes membránu za spotřeby ATP spřažené transporty Na+/K+ ATPáz - toxické látky / interference Tyto speciální biologické procesy se však u „cizorodých“ látek uplatňují vzácně – ojediněle u látek, které jsou podobné živinám apod. (např. toxiny sinic: peptidy) TOXIKOKINETIKA 1 - příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PINOCYTOZA - transport větších molekul endocytozou - př. vstup vzdušných toxikantů na prachových částečkách (< 1 mm) do alveolárních buněk, vstup vláken azbestu do fagocytujících buněk TOXIKOKINETIKA 1 - příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Transport u živočichů - krev, lymfa, hemolymfa - transport rozpuštěných látek - transport po navázání na proteiny (albumin, specifické proteiny) ! Mnoho organických (nepolárních) látek je vázáno TOXIKOKINETIKA 2 - transport látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Transport u rostlin - vodní proud v xylemu - plasmadesmy ve floemu - - -procesy závislé na podmínkách prostředí (T,vlhkost, světlo ...) TOXIKOKINETIKA 2 - transport látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Afinita k různým tkáním/pletivům - chemické vlastnosti určují afinitu -> cílové tkáně - biokoncentrace mušle - Cd/Pb - gonády savci Cd - mozek/kosti, Pb - ledviny/kosti Hg - u savců: ledviny > játra > slezina > střevo > srdce ... lipofilní látky -> tukové tkáně (játra, mozek) TOXIKOKINETIKA 2 - Distribuce látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – kovy v tkáních ryb: Nové Mlýny (Kenšová et al. ACTA VET. BRNO 2010, 79: 335-345) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Transformace xenobiotik v organismech - geneticky fixované staré konzervativní systémy pro transformaci xenobiotik jsou u všech organismů: - v minulosti - transformace biotoxinů (plísní, rostlin, bakterií ...) - produkty hoření (PAHs) TOXIKOKINETIKA 3 - transformace látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní strategie detoxifikace - eliminace látky z organismu = omezení expozice - většina vylučovacích orgánů: vodné tekutiny => transformace = lepší rozpustnost ve vodě - tvorba polárnějších, méně hydrofobních / více hydrofilních produktů - zpravidla rozlišovány 2 hlavní fáze detoxifikace (příp. i 3. fáze, exkrece) - dobře prostudováno u zvířat (savců) Poznámka: u obratlovců (zvl. savců – teplokrevní = vyšší rychlost chemických reakcí >> aktivnější detoxikace než u ryb nebo bezobratlích (è mlži akumulují PAHs, savci méně – efektivní metabolismus/oxidace/exkrece) -u rostlin podobné procesy - transformace oxidujícími enzymy -cytochrom oxidáza, fenol oxidáza, peroxidáza, askorbát oxidáza TOXIKOKINETIKA - transformace látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Velikost těla à rychlost metabolismu (transformací) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Picture 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze I transformace - enzymy MFO (mixed function oxidase, mixed function oxygenase) -membránové enzymy vázané na endpoplasmatické retikulum -Jsou extrahovatelné v podobě membránových vesikulů (= mikrozomy = S-9 frakce = mikrosomální oxidáza) à S9 využití při testování „promutagenů“ – bioaktivace – viz dále -Geneticky konzervované - u všech rostlin i živočichů - podobné geny/proteiny i u bakterií TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze I transformace – CYP450 - základní složkou MFO jsou enzymy obsahující jako koenzym hem = cytochromy P450 (CYP) = superrodina s více než 150 geny - u obratlovců nejčastější v parenchymu jater = hlavní orgán detoxifikace (ale i jinde - epitely střeva, žábry ...) - u bezobratlích v hepatopankreasu a trávicích žlázách - hlavní reakce – reakce s kyslíkem + další reakce (hydrolyza / epoxidace / dehalogenace / hydroxylace / deaminace / dealkylace) TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0e/Benzo%28a%29pyrene_metabolism.svg/540px-Be nzo%28a%29pyrene_metabolism.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0e/Benzo%28a%29pyrene_metabolism.svg/540px-Be nzo%28a%29pyrene_metabolism.svg.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Fáze I biotransformace – příklady 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Fáze I biotransformace – příklady 2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze I biotransformace – příklady 3 E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze II transformace -konjugace metabolitů z fáze I (nebo přímo reaktivních toxikantů) s řadou endogenních metabolitů ( dále více rozpustné produkty) Enzymy „transferázy“ - Sacharidy a deriváty (glukuronová kyselina) aminokyseliny + tripeptid , glutathion (GSH!), fosfáty, sulfáty ... TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze II transformace - enzymy cytosolové i membránové: glutathion S-transferázy (GST), epoxid hydroláza (EH), UDP-glucuronosyltransferaza (UDP-GTS), sulfotransferáza (ST) - vyloučení rozpustných produktů v moči / potu / žluči ! Existuje řada látek, které jsou stabilní a podléhají jen pomalé nebo žádné transformaci ! (organochlorové látky ...) TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Fáze II biotransformace – příklady 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fáze II biotransformace – příklady 2 E3 Phase II Metabolism in Human Skin: Skin Explants Show Full Coverage for Glucuronidation, Sulfation, N-Acetylation, Catechol Methylation, and Glutathione Conjugation | Drug Metabolism & Disposition Příklady: konjugační reakce 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Indukce systému MFO a Fáze II: - enzymy MFO jsou indukovatelné řadou (lipofilních/toxických) látek - organochlorové látky, PCDDs/Fs, PAHs, PCBs ... -enzymy Fáze II jsou indukovatelné - zvýšeným výskytem substrátů (z I. Fáze detoxifikace) - reaktivních toxikantů v buňkách -Dlouhodobé expozice subletálním dávkám à indukce detoxikačních enzymů à tolerance organismu k toxikantu (fyziologická adaptace) => příliš dlouhé působení: energetické vyčerpání TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Indukce detoxikačních enzymů = biomarker expozice -z aktivity detoxikačních enzymů lze usuzovat na předchozí expozici cizorodými látkami = biomarkery -Často nárůst oproti základním aktivitám až 100+ krát - Velký význam indukce CYP1A (cytochromy P450 1AI) -Vazba toxikantů a aktivace AhR (aryl hydrocarbon receptor) -spuštění transkripce a translace nových detoxikačních enzymů CYP450 - - měření aktivních CYP450 – tzv. metoda EROD - ethoxyresorufin-O-deethylaza - zvýšené aktivity - korelace s organickým (+chlor) znečištěním - - indukce dalších enzymů CYPs - stanovení MROD, BROD (různé substrány v enzymové reakci „methoxy-“, „butoxy“ ) - TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Změny v EROD aktivitě kaprů (samců vs. samic) u dvou řek (Anoia, Cardener) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Indukce detoxikačních enzymů u rostlin: - oxidace : peroxidáza, 4-hydroxyláza - ochrana před oxidací (superoxiddismutáza, kataláza ...) - indukce - zejména herbicidy TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Detoxikace à Aktivace -po metabolizaci řady látek detoxikačními enzymy vznikají více toxické metabolity -Obecně se užívá pojem „aktivace“ (nebo bioaktivace) -pro určité látky poje „aktivace prokarcinogen à karcinogen“ Například – POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY Hydroxylace a epoxidace benzo[a]pyrenu (BaP) à reakce s guanosinovými zbytky v DNA - mutace / aktivace onkogenů ALE BaP bez aktivace -> akutně netoxická látka (!) samotná indukce detoxikačních enzymů po expozici xenobiotiky může mít i další přímé i nepřímé škodlivé efekty, m.j. tzv. toxicita dioxinového typu (viz dále) TOXIKOKINETIKA - transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 TOXIKOKINETIKA – Bioaktivace Prokarcinogenu BaP interkalovaný v DNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif img_7180 Přehled: Metabolismus toxických látek + související negativní toxické účinky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Uložení xenobiotik v inertních tkáních => omezení cirkulace a snížení expozice Živočichové - tuk (organochlorové látky), zuby, vlasy, rohy (kovy) - u bezobratlích popsáno ukládání nerozpustných zinkových granulí ve střevě pijavek Rostliny - vakuoly, listy, kůra (-> opadání) Uvolnění ze zásob PCBs a další organochlorové látky -> tuk: ALE: rychlá potřeba energie (strádání, tvorba mléka ...) uvolnění ze zásob -> náhlá větší expozice a/nebo uvolňování v mléce ULOŽENÍ (sequestration) TOXIKOKINETIKA- ELIMINACE 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Metalothioneiny (MTs, MT-like proteins) - cytoplasmatické nízkomolekulární proteiny (6-10 kD) bohaté na Cys - známy u velké řady eukaryot - vazba kovů : Zn, Cd, Hg ... => snížení expozice / toxicity - dlouhý poločas života proteinů (~ 25 dní) - původní biologická funkce - ? snad regulace dostupnosti esenciálních kovů (např. Zn) ? INDUKCE MTs expozice kovy jiný méně specifický stres - hypoxie, změny teploty ... - Indukce MTs - další příklad BIOMARKER EXPOZICE ULOŽENÍ (sequestration) TOXIKOKINETIKA- ELIMINACE 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Indukce MTs (příklad – expozice ryb arsenem) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Eliminace – transport metabolitů přes membrány („Fáze III detoxikace“) •Membránové transportéry Fáze III –ATP-Binding Cassette transporters (ABC transporters) –Velká superrodina (or prokaryot po lidi) –Transmembránové proteiny – exkrece různých látek z buňky •Metabolity po detoxifikaci (GS-, UDG-konjugáty apod) à žluč a vyloučení stolicí •Léčiva, lipidy, steroly • A picture containing text, map Description automatically generated 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - MRP (MDR) - multidrug resistance-associated protein family - OATP - Organic Anion Transporting Polypeptide - P-glycoprotein ABC transportery - příklady Žlučový kanálek Jaterní buňka 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.nature.com/nrc/journal/v2/n6/images/nrc823-f3.gif ABC - jeden z mechanismů rezistence nádorů na cytostatika - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ABC - jeden z mechanismů rezistence bakterií na antibiotika - http://www.nature.com/nature/journal/v406/n6797/images/406775ac.2.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Míra eliminace xenobiotika - míra možné toxicity delší expozice / větší nebezpečí efektů SUCHOZEMŠTÍ ŽIVOČICHOVÉ (obratlovci) Většina rozpustných neplynných a nevolatilních látek * Moč - glomerulus - kličky: filtrace / aktivní transcelulární exkrece / transcelulární difuze / i resorpce (!) * Potní žlázy - Velmi významné vylučování - žluč aktivní transport konjugátů z jaterních buněk do žluči / ve střevě další transformace mikroflorou / event. resorpce - plynné látky (NH3) a volatilní látky (alkoholy) - plíce/dýchání EXKRECE - VYLUČOVÁNÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif VODNÍ ŽIVOČICHOVÉ - hlavním vylučovacím orgánem žábry (NH3) + žluč (ledviny méně) ROSTLINY - ukládání ve vakuolách, vylučování plyných toxikantů EXKRECE - VYLUČOVÁNÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Př: EXKRECE různých kongenerů PCBs z ryby po injekci Pomalé (nedokonalé) vyloučení zejm. u výšechlorovaných (vyšší hydrofobicita) The developmental neurotoxicity of legacy vs. contemporary polychlorinated biphenyls (PCBs): similarities and differences | SpringerLink 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif U kterého z organismů bude rychleji probíhat biotransformace (detoxifikace) látek? U ryby nebo u člověka? Vysvětlete proč. Jaké jsou hlavní procesy, které látka prodělává v organismu? Které enzymy se podílí na biotransformacích látek? Které jsou nejčastější chemické reakce při biotransformacích? Jaké transformační produkty s největší pravděpodobností vzniknou v organismu, který bude exponován látce benzen? Co je to glutathion? Co je to první a druhá fáze detoxifikace? Znáte příklad látky, která je „bioaktivována“ v organismu? V jaké podobě a jakým orgánem se vylučují toxické látky z ryb? z rostlin? z živočichů – obratlovců? Shrnutí - otázky