1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Účinky toxických látek 1 - Molekulární mechanismy - OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Chápat a dokázat vysvětlit základní pojmy toxikodynamiky –receptor, interakce, afinita, účinnost •Vysvětlit molekulární principy interakcí mezi toxickými látkami a cílovými místy (receptory) • •Vysvětlit a popsat principy nespecifického a specifického působení toxických látek • •Znát principy a příklady látek, které působí nejdůležitějšími mechanismy toxicity, tj. –narušení přirozené fluidity membrány –interakce látek s DNA –inhibice enzymových aktivit –narušení redox-potenciálu –narušení gradientů na membránách –kompetice se substráty / přirozenými ligandy • •Poznat ve struktuře vybraných modelových látek vybrané zásadní strukturní znaky, které jsou odpovědné za konkrétní mechanismy působení Co by si měl student odnést z této přednášky? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TOXIKODYNAMIKA - základní principy - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ToxicoDYNAMIKA http://4.bp.blogspot.com/-MebbujGDXi0/UAu26D7WxII/AAAAAAAAACk/StePoxIb3Go/s1600/2.png Dynamic simulation of processes causing toxicity and their grouping into toxicokinetics and toxicodynamics, illustrated on the example of the aquatic invertebrate Gammarus pulex. MoA ... and measurable EFFECTS Cílová místa = biologické makromolekuly (DNA/RNA, proteiny, membránové P-lipidy) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxikodynamika vychází z propracované „farmakodynamiky“ a přejímá její koncepty popisuje procesy na molekulární úrovni V místě kontaktu toxikantu s cílovým místem („receptorem“) dochází k interakci toxikant-receptor Primární jsou vždy chemické interakce mezi dvěma chemickými látkami „RECEPTORY“ = cílové struktury = základní (makro)molekuly: Proteiny STRUKTURNÍ (tubulin apod.) ENZYMY TRANSPORTÉRY (v membráně, hemoglobin) PROTEINOVÉ RECEPTORY (v membráně i v cytoplasmě) Nukleové kyseliny Fosfolipidy (Sacharidy – menší význam v eko/toxikologii) Malé molekuly (antioxidanty, ATP, hormony + voda) http://www.orko.cz/Varia/Pro%20Katku/Campbell%20obr%E1zky/07_Art_for_Students/07_09-MembProteinFunc tion-L.jpg Ilustrace –příklady funkcí proteinů (jen jedna podskupina - membránové) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady cílových struktur (receptor = jakákoliv biomolekula, kterou může ovlivnit toxikant) - buněčná membrána narkotická toxicita - dosažení takové koncentrace, že dochází k blokaci fluidity membrány a tím její funkce - acetylcholinesteráza enzym - inhibice v aktivním místě organofosfátovými pesticidy (substrate mimics) - arylhydrocarbon receptor (AhR), estrogenní receptor (ER) specifické mechanismy toxicity, xenoestrogenity -DNA v jádře a v mitochondriích, mRNA a další Nukl.kyseliny - -… a další 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy interakcí („vazby“) mezi toxikantem a receptorem -nekovalentní (viz příklad na následujícím snímku) (reverzibilní) vodíkové můstky hydrofobní interakce iontové interakce van der Waalsovy interakce -kovalentní (zpravidla ireverzibilní) - - př. inhibice acetylcholinesterázy organofosfátem... - př. vazba na nukleotid http://www.bioscience.org/2008/v13/af/3175/fig10.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce mezi „receptory“ a malými molekulami (toxikanty) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Typy interakcí mezi chemickými látkami (příklad – interakce s proteinem) Malé molekuly s různou strukturou - nesou funkční skupiny jako např. OH, NH3 atd. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce toxických látek s proteinovými cíli („receptory“) - interakce pozitivní à indukce odpovědi (agonista) (nahrazuje efekt ligandu, mimic effect, hormone-like effect) - interakce negativní à kompetice: nevyvolává reakci (antagonista) (blokuje navázání a efekt přirozeného ligandu, př. anti/estrogenita) HORMONE EFFECT TOXIN HORMONE EFFECT TOXIN 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Rychlost a síla interakce závisí na řadě parametrů, zejména: -Koncentrace obou interagujících látek -ale určující je zpravidla koncentrace toxikantu: vyšší koncentrace než koncentrace receptorů (koncentrace látky je výsledkem toxokinetiky) àAfinita vazby „ligand-receptor“ : Chemická povaha interakce (iontové, kovalentní, hydrofobní atd), popis afinity: disociační konstanty: Kd (pro biologicky aktivní látky cca v rozmezí 10-8 M až 10-3 M) (koncentrace která stačí k navázání z 50% na příslušný receptor) : Vyjadřuje se často jako převrácená hodnota (1/Kd) ________________ à Toxicita (efekt) je pak dán Účinností (efficacy) látky látky vyvolat příslušný efekt (vysoká afinita (navázání) ještě nemusí receptor aktivovat: agonisté vs antagonisté …) Síla a účinnost interakce http://www.blobs.org/science/cells/affinity.gif http://www.blobs.org/science/cells/efficacy.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jedná látka reaguje s mnoha různými cílovými strukturami („receptory“) v organismu ! Co určuje, která z mnoha „interakcí“ se projeví toxicky ? Významné faktory ovlivňující projev chemicko-biologické interakce: Koncentrace vs. rychlost toxického projevu interakce dioxin: vysoké dávky à akutní chlorakne, smrt, nízké dávky, dlouhodobě à karcinogenita, imunosuprese … Prostorové umístění a možnost kontaktu látky s receptory embryo vs. dospělec insekticid: vysoká dávka - akutní toxicita -> žábry / smrt nízká dávka je distribuována v těle a působí chronicky -> imunotoxicita Kd jednotlivých (různých) interakcí organofosfát: specifická inhibice AcChE, velmi nízké Kd à specifické působení TOXIKODYNAMIKA - základní principy - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jedna látka reaguje s více „receptory“ 2,3,7,8-TCDD - narkotická toxicita (membrána) (Kd 10-6 M) à akutní rychlá intoxikace – „chlorakné“ - modulace estrogenity (ER) (pohlavní orgány Kd 10-9 - 10-12 M) à reprodukční poruchy/měsíce - roky - indukce AhR (thymus, játra Kd 10-12 - 10-15 M) à nádor/měsíce – roky (karcinogenita, imunotoxicita) Příklad TCDD interakce s mnoha receptory à mnoho různých projevů dioxiny 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Akutní (24h) toxicita TCDD vs další příklady (potkan LD50 mg/kg ž.v.) Chemical LD 50 Value (mg/kg ž.v.) TCDD (a form of dioxin) 0.01 Tetrodotoxin (globefish toxin) 0.01 Saxitoxin (shellfish poison) 0.8 Carbofuran (a pesticide) 10 Phosphamidon (an insecticide) 24 Nicotine 50 Caffeine 200 DDT (an insecticide) 200 2,4–D (an herbicide) 370 Mirex (an insecticide) 740 Acetylsalicylic acid (aspirin) 1,700 Malathion (an insecticide) 2,000 Sodium chloride (table salt) 3,750 Glyphosate (an herbicide) 4,300 Ethanol (drinking alcohol) 13,700 Sucrose (table sugar) 30,000 Botulotoxin (enzym! Jedna makromolekula à opakovaná katalýza mnoha reakcí) 0,00000003 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Různé typy (kategorie) mechanismů toxicity •Druhově-specifické mechanismy, příklady –Toxicita pro fotosyntézu (rostliny) vs. teratogenita (obratlovci) –Endokrinní disrupce •Rozdílné řízení (a hormony) u bezobratlých a obratlovců à podobně látky à různé mechanismy toxicity Growth in invertebrates ecdysis (moulting) - ecdysteroids http://img.docstoccdn.com/thumb/orig/8860991.png Growth in humans several hormones 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Různé typy (kategorie) mechanismů toxicity •- Orgánově specifické mechanismy (a účinky) • - hepatotoxicita; neurotoxicita; nefrotoxicita; hemotoxicita; imunotoxicita • - toxicita pro reprodukční orgány; • • • • • • • • • • •Vývojová (Developmental) toxicita -- embryotoxicita/teratogenita: toxicita pro buněčné procesy diferenciace http://img2.allvoices.com/thumbs/image/609/480/103574038-diclofenac-drug.jpg http://www.painstopanswers.com/images/diclofenac.jpg Thalidomid Toxiny sinic (účinky na embrya obojživelníků) Fig2C Fig2B 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jaké makromolekuly jsou cílem toxických látek? Jaké existují interakce mezi toxickými látkami a makromolekulami? Jaký typ interakce bude nejpravděpodobnější mezi * hexachlorhexanem … a hemoglobinem? …a fosfolipidem? * formaldehydem … a tubulinem? … a nukleovou kyselinou? Co je to toxikodynamická disociační konstanta? Ke které makromolekule z následujících dvou má TCDD vyšší afinitu - k receptoru AhR nebo k hemoglobinu? U které interakce (dioxin-protein) bude vyšší Kd? Co je agonista? Co je antagonista? Úvod do toxikodynamiky - otázky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Účinky látek na molekulární úrovni: mechanismy působení 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co by si student(ka) měl(a) odnést ? 1)ZNÁT a dokázat vysvětlit hlavní Molekulární a Biochemické mechanismy toxicity 2) 2) 2)Dokázat přiřadit ke každému mechanismu toxicity některé z významných environmentálních toxikantů 3) 3) 3)Vysvětlit, jak se jednotlivé BIOCHEMICKÉ MECHANISMY toxicity projeví na vyšších úrovních (příklad – inhibice receptoru pro hormon à projev: porušení reprodukce) 4) 4) 4) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Připomenutí: mechanistický koncept od molekuly k populacím (V literatuře: „Adverse Outcome Pathway“) http://u.jimdo.com/www32/o/s09b2938cc0a6d68f/img/iea0bcf86690428e0/1328014089/orig/models-for-ecoto xicology-and-risk-assessment-toxicokinetics-are-what-the-organism-does-with-the-chemical-and-toxico dynamics-are-what-the-chemical-does-to-the-organism.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1) Cizorodé organické látky mají toxické efekty pro membránové fosfolipidy = nepolární narkotická toxicita (bazální toxicita, membránová toxicita) projevy při relativně vysokých koncentracích, závisí na logKow (viz dále) Základní typy ekotoxicity organických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1) Cizorodé organické látky mají toxické efekty pro membránové fosfolipidy = nepolární narkotická toxicita (bazální toxicita, membránová toxicita) projevy při relativně vysokých koncentracích, závisí na logKow (viz dále) 2) Kromě základní toxicity, mohou polárnější látky přímo působit na membránové proteiny = polární nakotická toxicita projevy při nižších koncentracích než by odpovídalo logKow Základní typy ekotoxicity organických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1) Cizorodé organické látky mají toxické efekty pro membránové fosfolipidy = nepolární narkotická toxicita (bazální toxicita, membránová toxicita) projevy při relativně vysokých koncentracích, závisí na logKow (viz dále) 2) Kromě základní toxicity, mohou polárnější látky přímo působit na membránové proteiny = polární nakotická toxicita projevy při nižších koncentracích než by odpovídalo logKow 3) Kromě obou nahoře uvedených mechanismů, mohou látky, které jsou reaktivní napadat reaktivně makromolekuly a působit tzv. reaktivní toxicitu - projevy ještě při nižších koncentracích než odpovídá narkóze -toxické látky spíše elektrofily, vyhledávají nukleofilní zbytky = „elektrony-bohatá místa“ (nukleotidy, SH-, NH2- a další skupiny – nukleové kyseliny, proteiny, fosfolipidy) - Základní typy ekotoxicity organických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní typy ekotoxicity organických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní typy ekotoxicity organických látek Všechny organické látky à Membrány (nepolární a polární narkoza) Reaktivní toxicita àVšechny makromolekuly (NK, proteiny, membrána) : oxidativní stres, mutagenita - acylace-/arylace denaturace proteinů (nekompetit. Inhibice enzymů…) Organické látky Kovy : jiné procesy než u org.látek : oxidace/redukce à toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Membránová toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Narušení membrány - základní toxicita (baseline toxicity) = narkoza (narcosis) (nejde o narkozu farmakologickou, kde se uvažuje velmi specifické působení na receptory na membránách) - Zásadní význam v ekotoxicitě většiny organických polutantů - efekty závislé na HYDROFOBICITĚ (Kow / logKow = logP) - při vyšších koncentracích akumulace látek v membránách à narušení zásadních životních funkcí (přenos nervových signálů, tvorba ATP atd atd) Mechanismus 1: Interakce s membránou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Poznámka: cholesterol - strukturně „velikostí“ obdobný jako jiné organické látky (PAHs, neutrální toxikanty…) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0e/Benzo%28a%29pyrene_metabolism.svg/540px-Be nzo%28a%29pyrene_metabolism.svg.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Princip narkotické toxicity (volume of distribution principle) Látky z různou hydrofobicitou (BCF 3-6-12) vyvolají toxicitu když dosáhnou stejné koncentrace v membráně (12 molekul/jednotkový objem). Pro více hydrofobní látky (BCF12) stačí nižší vnější koncentrace („1 molekula/objem“) aby látka vstoupila do organismu a akumulovala se v membránách až dosáhne „toxické“ koncentrace v organismu. Pro látky s nižší BCF je třeba větší vnější koncentrace. (Látky s vyšší BCF se jeví jako toxičtější - stačí nižší vnější koncentrace) 001 BCF – bioconcentration factor * Depends on hydrophobicity (i.e. Kow) * Higher BCF à lower concentration is sufficient for bioconcentration to the same “tissue concentration” à lower external concentration (IC50) will induce toxic effect * Confirmed by chemical analyses (same molar concentrations of different compounds accumulated in membranes) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Narkotická (membránová toxicita) à důsledky a projevy AKUTNÍ EKOTOXICITA Prokázána lineární korelace mezi logKow (=logP) a EC50 u vodních organismů (např. Daphnia, ryby, planktonní řasy …) Obrázek: Neutrální organické látky à Nepolární narkoza Aminy (NH2), fenoly (OH) à Polární narkoza (při stejném logP je pozorována vyšší toxicita – tj. vyšší hodnoty 1/EC50 než u neutrálních látek) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mutagenita a genotoxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif DNA jako cíl toxikantů -Základní molekula pro život -Struktura a funkce jsou pečlivě kontrolovány -Změny jsou rychle opravovány -… nevratné změny à fyziologická buněčná smrt: apoptóza • •Mutageneze à MUTACE • à biologická rozmanitost a evoluce • à změny struktury a kodování DNA •Mutace probíhají •… přirozeně miliardy událostí denně / většina opravena •… indukované stresem à toxické dopady http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e4/DNA_chemical_structure.svg/800px-DNA_chemi cal_structure.svg.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif V organismu je trvale aktivní komplexní aparát reparačních systémů (specifické komplexy enzymů pro různé typy změn na DNA) Reparační enzymové aparáty: •mnoho je exprimováno konstitutivně (nízké úrovně, stálá kontrola DNA) • •některé jsou inducibilní změnami v DNA (mutace) (např. SOS repair – využití jako biomarkery poškození NK) REPARAČNÍ MECHANISMY DNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Chemické látky mohou indukovat poškození DNA mutageny = látky způsobující mutace (změny/alterace na DNA a chromosomech) genotoxiny = látky poškozující DNA klastogeny = látky vyvolávající chromosomální zlomy Pozn. terminologie není jednotná / přechody ... - Mutagenita a genotoxicita - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1)Bodové mutace interakce toxikantu s nukleotidem např. oxidace / deaminace : záměny změna v tripletu (jedna aminokyselina) à “úprava” funkce enzymu (NEBO nefunkční enzym à apoptóza) : delece, adice zpravidla změna čtecího rámce à vždy nefunkční enzym à smrt apoptozou 1) - Mutagenita a genotoxicita – TYPY MUTACÍ - Záměna T (Purin) à C (Pyrimidin) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Důsledky bodových mutací http://academic.pgcc.edu/%7Ekroberts/Lecture/Chapter%207/07-21_PointMutations_L.jpg (a)Tiché mutace – i po změně koduje stejnou aminokyselinu (amk) (b)Změna smyslu – jiný triplet: změna kodování jedné amk (c)Nesmyslná mutace – např. triplet koduje „STOPL (d – e) Změna čtecího rámce – změna tripletů pro mnoho amk od mutace dále 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 2)Zlomy + chromozomové mutace (toxikant interaguje s “páteří” DNA – cukr-fosfátový řetězec) 3) - Mutagenita a genotoxicita – TYPY MUTACÍ 2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1)Ionizující záření * přímá interakce s DNA (zlomy) * nepřímo à štěpení vody à ROS (viz také dále) 2)elektrofilní malé molekuly * deriváty kyslíku, vody (m.j. také po ozáření) (viz také dále – “oxidativní stres”) * vyhledávají nukleofilní/bazická místa … např. v NK 3) další reaktivní látky - alkylující, acylující nebo arylující látky à kovalentní adukty s nukleotidy v DNA à 1+2+3: „nespecifické“ reaktivní mechanismy 4) interkalátory DNA è cross-linking řetězců DNA à 4: „specifický“ mechanismus genotoxicity (jen látky s definovanou strukturou, velikostí…) Mutageny – hlavní skupiny / příklady 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fyzikální faktory • •Ionizující záření • - přímá interakce s DNA • - nepřímé poškození DNA po interakci s vodou (nejčastější!) à tvorba OH* (hydroxylový radikál a následně dalších ROS: viz oxidativní stres) •à Vážná poškození DNA včetně zlomů • •UV záření • - interakce s aromatickými bazemi à vznik např. dimerů T=T • Jaké látky (stresory) vyvolávají mutace? MUTAGENY 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mutagenita – ionizující záření https://www.windows2universe.org/earth/Life/images/radiation_dna_damage_big.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Různé typy poškození DNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Produkty vznikající z vody a kyslíku Voda - chemikálie s nejvyšší koncentrací, Kyslík – silné oxidační činidlo à ROS reactive oxygen species viz dále – mechanismus “oxidativní stres” Mutagenita – volné radikály / oxidační stres http://www2.le.ac.uk/departments/csmm/images/ROSproductionOSG.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •1) Malé elektrofilní molekuly (interakce s nukleofilními / bazickými místy … m.j. v DNA) • •2) Další reaktivní látky * vnášejí alkyl-, aryl-, acyl- (alkylující, arylující, acylující) • * tvorba kovalentních aduktů • * Reakce mohou být Nespecifické (mnohá protinádorová léčiva) • Stericky specifické („klíč-zámek“) - interkalátory •3) Analoga nukleotidů (analoga bazí) • * nahrazují přirozené nukleotidy během replikace • * změna kodování à nefunkční proteiny à apoptoza • •Některé látky vyžadují „aktivaci“ (pro-mutagen à mutagen) Jaké látky (stresory) vyvolávají mutace? Chemické mutageny 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •HNO2, HSO3- Hydroxylamin (HO-NH2), Methoxyamin (CH3-O-NH2) • •Příklad – oxidace / deaminace • CG à TA shift • Malé mutageny: oxidace (deaminace) nukleotidů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kontaminanty, jejich metabolity, toxiny PAHs Plísňové toxiny atd. Reaktivní organické toxikanty epoxidy, episulfidy, laktony, aminy chinony azo-látky (heterocyklické PAHs) aromatické nitro-látky (NO2-PAHs) http://www.uoguelph.ca/%7Edjosephy/lab/images/mutagens.gif http://www.uoguelph.ca/%7Edjosephy/lab/images/mutagens.gif Adukty (arylace) po aktivaci CYP Aflatoxin B1 (po aktivaci CYP) BaP (po aktivaci CYP) Alkylace Nitrosomočovina Cyklofosfamid Nitromočovina Reaktivní látky (alkylace / arylace) Cyklofosfamid 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kovalentní vazba na NK (alkylace bazí, tvorba crosslinků … nejčastěji reakce s Guaninem:G) •Alkylsulfáty, Nitromočovina, N-nitroso-alkyly •Cis-platina a Cyklofosfamid = protinádorová léčiva cisplatin cyclophosphamide ALKYLUJÍCÍ mutageny Nitrourea (Nitromočovina) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Mutagenita benzo[a]pyren – “arylace” (vznik aduktu) po aktivaci CYP450 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0e/Benzo%28a%29pyrene_metabolism.svg/540px-Be nzo%28a%29pyrene_metabolism.svg.png GUANIN Adukt BaP-G Reaktivní epoxid na BaP 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Covalent binding, aromatic „adducts“ with bases (see also discussion at biomarkers) • •Mycotoxins (Aflatoxins) – requires activation • •PAHs (benzo[a]pyrene) – requires activation •PAH derivatives - 2-AA, 2-AF (grill products) - NQO – model mutagen in experiments • •... many others • Příklady ARYLUJÍCÍCH mutagenů (arylace) http://www.uoguelph.ca/%7Edjosephy/lab/images/mutagens.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bioaktivace: aflatoxin à genotoxicita Výsledek obrázku pro aflatoxin activation Výsledek obrázku pro aflatoxin producer AFLATOXIN sources Výsledek obrázku pro aflatoxin source Výsledek obrázku pro aflatoxin source 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Interkalační činidla m.j. využití v experimentální biologii – značení DNA (ethidium bromid) 598-599 Interkalace: psoralen (v dehtu, psoriáza = lupenka) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •INTERKALACE DO DNA Ethidium bromid (běžná látka v mol-biol výzkumu: vizualizace DNA) http://what-when-how.com/wp-content/uploads/2011/05/tmp32C166_thumb1.jpg Example 1 – ETHIDIUMBROMIDE - experimental dye – visualization of DNA - intercalation à sharing of electrones with bases à high fluorescence 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Strukturně podobné bazím (nukleotidům) à vstup do DNA během replikace • •Příklady –5-Br-Uracil –5-F-Uracil (protinádorové léčivo) – –Důsledek: změna kodování AT à GC shift Mutageny: analogy bází 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1)Důsledky u lidí a zvířat Mutace tělních buněk (somatické mutace) à první krok karcinogeneze a dalších patologií (karcinogeneze, teratogenita: viz další přednášky) Mutace pohlavních buněk à přenos mutací na další generace à evoluce 2) Důsledky pro ekosystémy > změny genomu/genofondu přírodních organismů > adaptace na změny v prostředí à evoluce Příklady/přípomínka: Pesticidy à vznik rezistentního hmyzu Antibiotika à ATB-rezistentní bakterie Důsledky mutací / genotoxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Připomínka: mutace – základ evoluce populací http://www.anselm.edu/homepage/jpitocch/genbi101/13_03bPesticideResist-L%20copy.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PROTEINY jako cíl toxických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Structure of proteins • – primary (sequence of aminoacids, AA), • - secondary, tertiary, quarternary (folding – important for functions) • •Proteins - large/long – key target for number of toxicants! • = polypeptides - tens to thousands of AA •Peptides (small, “πεπτός, "digested“, 2x AA to e.g. 20x AA) • may have various functions (e.g. protective - glutathione) • •Key functions of proteins •STRUCTURE and PROTECTION •CATALYSIS (enzymes) •TRANSFER (information and mass) • - receptors, channels, transporters • Struktura a funkce proteinů https://www.mun.ca/biology/scarr/iGen3_06-04_Figure-L.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif à účinky látek na sekundání a terciární strukturu proteinů (včetně enzymů) Narušení H-můstků alkoholy, aminy Iontové vazby kyseliny (COOH), zásady (aminy) toxické (těžké) kovy - Hg+2, Pb+2, Cd+2 , Ag+1 Tl+1, S-S můstky toxické kovy (reakce se sírou HS-) Detaily (domácí úkol): http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/568denaturation.html Nespecifické mechanismy (reaktivní): denaturace http://www.elmhurst.edu/%7Echm/vchembook/images/568denathbond.gif http://www.elmhurst.edu/%7Echm/vchembook/images/568denatdisul.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Inhibice enzymových aktivit 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Inhibice enzymových aktivit Řada (eko)toxikantů působí jako specifické inhibitory řady enzymů inhibice reverzibilní (nekovalentní) ireverzibilní (kovalentní) inhibice kompetitivní : vazba v aktivním místě, na úrovni substrátu: viz příklady dále inhibice nekompetitivní / alosterické : vazby na jiném místě enzymu à „nespecifická“ změna struktury a následně funkce (např. nízké pH: hodně H+ à denaturace proteinu, toxicita) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Acetylcholinesteráza - klíčový enzym v přenosu nervových signálů (mezi neurony, mezi neuronem a svalem) -Inhibice Ach (organofosfátové pesticity, karbamáty …) à křeče, udušení Specifické inhibice enzymů – příklad AcCholE 1 http://s2.hubimg.com/u/4316027_f520.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady – inhibitory AcCholE http://www.scielo.br/img/revistas/jbchs/v15n6/22667f1.gif Nervové plyny http://www.darkgovernment.com/news/wp-content/uploads/2012/12/sarin.jpg Insekticidy - karbamáty http://1.bp.blogspot.com/-vJjcfxZOpBY/UghViEI7QXI/AAAAAAAADdw/0EuZdLLJHRw/s1600/nerve.tif Organofosfátové insekticidy Výsledek obrázku pro carbamate insecticides Novichok 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif inhibice enzymů respiračních řetězců - Respirace & tvorba ATP - klíčový metabolický proces - Kyanid (C≡N), CO vazba na hemový komplex à nejrychlejší toxicita – mitochondrie à také v hemoglobinu, CYP450 atd. Specifické inhibice enzymů - příklady 1 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modelové toxikanty inhibující produkci ATP v mitochondriích http://classconnection.s3.amazonaws.com/64/flashcards/266064/png/poison1355459598482.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •N-(phosphonomethyl)glycine •Broad-spectrum herbicide („RoundUp“) •Selective inhibition of ESPs 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase; •(synthesis of aromatic AAs – Tyr, Trp, Phe) •Uptake via leafs - only to growing plants •„Non-toxic“ to other organisms (no ESPs in animals, AA-like chemical - rapid degradation) Mechanismus: Glyfosát (Pesticid RoundUp) Roundup Expres 3000ml 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Další specifické mechanismy • intracelulární a extracel. receptory 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce látek s proteinovými receptory: část 1: membránové http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/hormone_types.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AKTIVACE membránových kanálů: neurotoxiny sinic •Neurotoxins (cyanobacterial) • • • • • Toxins 02 02359 g005 1024 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQHRpAgIeIPwnv_Z0rdf0lvw1uSuGlyI5UAd8_akQHeZy4 mLGrf http://microbiology.science.oregonstate.edu/files/micro/theo%20photo%202.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif BLOKACE membránových kanálů: neurotoxiny obrněnek SAXITOXINS •Produced by dinoflagelates and cyanobacteria •(toxic blooms, „red tides“) •PSPs – Paralytic Shelfish Poisons Výsledek obrázku pro saxitoxin 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - v buňce se přirozeně udržují gradienty iontů (plazmatická membrána, ER, mitochondrie) Význam gradientů: - zajištění semipermeability - zajištění správného signálování (Na+/K+, Ca2+) - gradienty H+ pro tvorbu ATP Toxické látky narušující gradienty - ionofory - usnadněný přenos iontů (např. antibiotika) - další mechanismy – viz dříve - rozpojování toku elektronů z respiračních řetězců (chinony) - blokace přenosu v respiračních řetězcích (kyanidy) Změny gradientů na membránách – IONOFORY C:\Documents and Settings\Ludek Blaha\Obrázky\1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lectures/hormone_types.jpg Interakce látek s proteinovými receptory: část 2: cytoplazmatické / jaderné 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce chemických látek s receptory pro přirozené ligandy = reakce s proteinovými receptory PROTEINOVÉ RECEPTORY A) Membránové receptory – menší význam v ekotoxicitě - přirozené ligandy - velké hormony (inzulin): menší význam toxických látek - malé signální molekuly (neurotransmittery): strukturně blízké malým mk toxikantů (spíše farmakologie) B) Intracelulární receptory! Velký význam v (eko)toxicitě Kompetice toxických látek s přirozenými ligandy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Intracelulární (nukleární, jaderné) receptory Nukleární receptory - přímo interagují s DNA (transkripční faktory) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxické látky interferují s ligandy nukleárních receptorů Nukleární receptory - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Intracelulární (jaderné) receptory Velký význam v ekotoxikologii ! Ligandy nukleárních receptorů – řada nízkomolekulárních hormonů estrogeny, androgeny, thyroidní hormony … Organické toxické látky: strukturní podobnost s hormony (!) à Specifické mechanismy a účinky (efekty při nízkých koncentracích) Důsledky: chronická toxicita velmi významných polutantů - persistentní látky - PCBs, PCDDs/Fs, DDT, - ftaláty a další aditiva (bisfenol A) - detergenty (nonylfenol) - nové typy pesticidů atd. Thyroxine Cortisol (Hydrocortisone) O HO OH H3C CH2OH C O HO O I I I I NH2 CH2 COOH H3C Testosterone O OH H3C H3C CH 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Aktivace AhR : - není znám přirozený ligand, nejsilnějším ligandem TCDD (!) - aktivace AhR vyvolává - indukce detoxikačních enzymů (CYP1A1) - hyperfosforylace regulačních enzymů à proliferace (! nádory), apoptoza (imunotoxicita) Aktivace ER - přirozeným ligandem ER jsou estrogeny (17beta-estradiol atp.) - efekty jsou závislé na typu buněk - proliferace (nádory), produkce hormonů, změny aktivit ... - nefyziologická hyperaktivace ER à xenoestrogenita (významný proces endokrinní disrupce) Nukleární receptory významné v ekotoxicitě AhR – receptor pro aromatické uhlovodíky (arylhydrocarbon receptor) ER – estrogenní receptor také např. AR (androgenní receptor) další (PPAR, ThR) – méně prostudované účinky látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady – ligandy jaderných receptorů •Malé molekuly – hormony (signální látky) rozpustné v tucích –Přestup přes membránu – vazba na NR – aktivace transkripce (transkripční faktory) –STEROIDNÍ HORMONY •Pohlavní hormony (estrogen, progesteron, testosteron) •Kortikosteroidy (glucocorticoids and mineralcorticoids) –Další hormony a ligandy Thyroidní hormony, vitamín D3, kyselina retinová, ligandy AhR (např. TCDD) – –Malé molekuly - plyny Např. NO (signálování v imunitních reakcích) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Natural products genistein naringenin coumestrol zearalenone Various POPs DDT and its metabolites (DDE) kepone PCBs/OH-PCBs PAHs and dioxins Industrial chemicals Bisphenol A Nonionic surfactants Pthalate esters (eg. DEHP) Endosulfan (pesticide) Pharmaceuticals Ethinyl estradiol Diethylstilbestrol gestodene norgestrel endosulfan_obr dehp DEHP >> látka může působit jako AGONISTA a/nebo ANTAGONISTA (podle konkrétní situace v tkáni a v závislosti na koncentraci ligandu) à Dopady – především reprodukční toxicita, ale také imunosuprese ad. Příklad – ligandy ER (Estrogenní receptor) Environmentální toxikanty (xenoestrogeny, exoestrogeny, anti-ER) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AhR (Arylhydrocarbon receptor) = receptor pro planární aromatické uhlovodíky = dioxinový receptor 2,3,7,8-TCDD (dioxin) ve vazbě s AhR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AhR •Ligandem aktivovaný transkripční faktor –Stejně jako ostatní NRs (nuclear receptors, jaderné receptory) •Aktivní AhR řídí expresi mnoha různých genů • •Významný mediátor toxicity mnoha POPs – primárně aktivován planárními aromatickými látkami –Po aktivace spouští primárně syntézu CYPs (detoxikace – vč. „aktivace“) a současně ovlivňuje další geny • •Křížová aktivace (crosstalk) s dalšími NRs (př. potlačuje de novo syntézu ER ~ antiestrogenita) • •Nejsilnější známý ligand: TCDD –Může být aktivován i endogenními látkami – např. deriváty aromatických heterocyklických aminokyselin Gram-scale synthesis of FICZ, a photoreactive endogenous ligand of the aryl hydrocarbon receptor | Scientific Reports 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mnoho genů v buňce je pod kontrolou AhR •Promotory mnoha genů obsahují tzv. xenobiotic response elements (XRE) nebo dioxin responsive elements (DRE) : • –Detoxifikační geny •phase I enzymes (CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 1B1) •phase II enzymes (UDP-glucuronosyltransferase, GST-Ya, NADP(H):oxidoreductase – –Další geny - např. řízení buněčného cyklu, apoptozy •Bax (apoptosis control), p27Kip1, Jun B (MAP-kinase), TGF-b (tumor growth factor) • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Denison & Nagy, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43:309 Klasické a další (neplanární) ligandy AhR “Non-classical” Různé látky, které aktivují AhR Classical = planar structures à direct binding to AhR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Schmidt & Bradfield, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:55 Účinky vyvolané toxikanty přes AhR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Změny redox-potenciálu Oxidativní stres 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Redox-potenciál - v buňce se přirozeně udržuje určitý stav redox-potenciálu - rovnováha oxidanty/antioxidanty - - narušení rovnováhy à oxidační stres - - Antioxidanty: endogenní syntéza – glutathion (!) dietární beta-karoten, kys. askorbová (vitamin C) - - Zdroje “pro-oxidantů” (viz dále) - přirozené procesy (metabolismus) - záření - xenobiotika (přímá reaktivita, reaktivita po aktivaci) Změny redox potenciálu / oxidativní stres https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQgt2WMFH5Q29sZCcknGSNXxp2xpH7GR8b23AEFy-2JYUe pS9cXfg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Metabolismus - mitochondrie kyslík = terminální akceptor elektronů fyziologicky: O2 + glukoza à voda + CO2 patologie: O2 à ROS (reactive oxygen species) METABOLISMUS a oxidativní stres http://cardiovascres.oxfordjournals.org/content/cardiovascres/61/3/461/F1.large.jpg Hlavní ROS •Superoxid (O2- . ) •Peroxid vodíku (H2O2) •Hydroxylový radikál (OH . ) à poškození molekul • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Velká reaktivita ROS (krátká reakční doba = nestabilita, reaktivita, toxicita) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Respirační řetězec v mitochondriích - zdroj elektronů à zdroj ROS - http://www.qub.ac.uk/schools/SchoolofBiologicalSciences/People/DrAGalkin/Research/Image1,172487,en. jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ionizující záření à reakce s vodou v buňkách à produkce ROS (OH-radikál) à základní mechanismus toxicity způsobené zářením ! Další zdroje „oxidantů“ v buňce - záření http://www.frontiersin.org/files/Articles/22593/fphar-03-00094-HTML/image_m/fphar-03-00094-g001.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif - přímo reaktivní látky (např. epoxidy a další …) - metabolity vznikající při transformacích a detoxifikaci àReakce s “antioxidanty” à omezení antioxidační kapacity -toxické kovy (Fentonova reakce – katalýza rozkladu H2O2 à OH*) -redoxní cyklátory – např. chinony àIndukce radikálů (viz příklad dole: kovy à ROS) XENOBIOTIKA A OXIDAČNÍ STRES http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0891584902007797-gr1.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif CYP450 jako zdroj ROS (příklad CYP2E1, MEOS – microsomal ethanol oxidising system) http://themedicalbiochemistrypage.org/images/cyp2e1-activities.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Oxidativní poškození buněčných součástí & biomarkery oxidativního poškození 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Oxidativní stres = narušení rovnováhy oxidanty/antioxidanty Oxidační stres vzniká: à Zvýšením koncentrací oxidantů a/nebo à Odstraněním antioxidantů - velmi obecný mechanismus vyvolaný toxickými látkami - důsledky: chronické efekty – nemoci, rakovina, stárnutí ... Pozn: Druhý extrém narušení rovnováhy: ? Snížení koncentrací oxidantů - málo prostudováno (anoxie - častý stav v nádorech) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Komplexní účinky – důsledky oxidativního stresu (akutní i chronické!) Příklad – akutní infarkt myocardu (acute coronary syndrome; ACS) http://www.geneactivatornrf2.org/wp-content/uploads/2013/03/oxidative_stress_diseases-600.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ROS a oxidace na molekulární úrovni - DNA - proteiny - fosfolipidy Důsledky: à Přímá toxicita, stárnutí, nemoci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přehled mechanismů: ke každému znát principy, důsledky, příklady chemických látek Základní typy toxicity Nespecifická toxicita - (ne)polární narkotická toxicita (bazální toxicita) - toxicita vyvolaná reaktivními látkami Specifická toxicita - inhibice enzymů, interakce s receptory apod. Konkrétní příklady - narušení přirozené fluidity membrány - interakce látek s DNA - inhibice enzymových aktivit - narušení redox-potenciálu - narušení gradientů na membránách - kompetice se substráty / přirozenými ligandy Shrnutí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Co se rozumí pod pojmem receptor v toxikodynamice? Uveďte příklady •Jaké molekulární interakce nastávají mezi toxickou látkou a cílovým místem? Popište princip hydrofobní interakce (atp.) •Co je to agonista a antagonista? Co je to specifická a nespecifická inhibice enzymu? •Vysvětlete na jakých vlastnostech látky závisí nepolární narkoza, genotoxicita atp. •Popište co to je oxidativní stres, jak vzniká, jaké jsou jeho důsledky? •Co je to acetylcholinesteráza? Jakou má funkci v organismu? Jaké jsou důsledky její inhibice? Jaké látky ji inhibují? •Co je to estrogenní receptor? Vysvětlete proč je v toxicitě významnější než např. receptor pro inzulin? •Jaké jsou důsledky mutagenity u člověka? Jaké jsou důsledky mutagenity u přírodních organismů? Příkladové otázky