1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Stanovení ekotoxicity OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Cíl přednášky – co by si měl student odnést •Chápat princip testování ekotoxicity s využitím „biologických modelů“ •Znát různé typy (křivky) vztahů mezi dávkou a toxickou odpovědí •Dokázat zakreslit, využít a interpretovat jednoduchou křivku „dávka-odpověď“ •Znát základní odvozené parametry •Znát princip probitové metody •Umět vysvětlit rozdíly a principy „prahového“ a „bezprahového“ působení •Znát příčiny a příklady „nemonotonního“ působení toxických látek •Chápat vztah toxicity a doby expozice a principy kritických reziduí •Dokázat vysvětlit pojmy aditivita – antagonismus – synergismus v ekotoxikologii a uvést příklady •Umět odhadnout toxicitu směsi látek za předpokladu aditivního působení • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Cílem ekotoxikologických analýz je poznání efektů, které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí - suborganismální úroveň laboratoř - - jednotlivé organismy laboratoř - - populační efekty laboratoř mikro/mezokosmy - - efekty ve společenstvech mikro/mezokosmy polní studie terénní pozorování - - ekosystémové efekty terénní pozorování Hodnocení efektů v ekotoxikologii ekologická reálnost, relevance obtížnost stanovení 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 laboratoř Testování ekotoxicity v realitě = Účinky na vybraných modelových organismech (systémech) à predikce / extrapolace pro celý ekosystém 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co je to ekotoxikologie ? •Věda na průniku ekologie a toxikologie studující a hodnotící přímé i nepřímé účinky přírodních i uměle vytvořených škodlivých chemických látek a případně dalších stresorů na živočichy (kromě člověka), rostliny a mikroorganismy na všech úrovních biologické organizace. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Hlavním požadavkem ekotoxikologické studie je průkaz KAUZALITY mezi expozicí (látkou) a efektem (= nejčastěji průkaz „jak se toxicita mění s dávkou“ – dávka/odpověď) Expozice (dávka) Atmospheric Deposition Erosion & Runoff Untreated discharges Efekt (Jaká expozice vyvolá efekt ?) bosmina FISH Laboratorní a polní studie Ekotoxikologické testy sample56 lab2 faCTORY1 WWTP 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co je to biotest ? •Nástroj (metoda, postup …), kdy živý organismus (tkáň, populace, systém …) je vystaven (= exponován), ve víceméně kontrolovaných standardních podmínkách působení sledovaných stresových faktorů (chemické látce) a sleduje se účinek či jev • •První biotesty – „ochutnávači“ faraonů •Dnes téměř na všech typech organismů • •Test toxicity – sleduje se toxický účinek •Test bioakumulace – sleduje se jev •EKOtoxikologický (bio)test = vyhodnocuje EKOtoxicitu • • 7 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Proč ekotoxikologické testy ? • CHEMICKÉ ANALÝZY samotné NEDOKÁŽOU postihnout reálné riziko pro živé organismy: • •1) reálná expozice se liší podle biodostupnosti toxických prvků a látek v dané situaci, •2) jde vždy o směs toxikantů, která působí jinak než jednotlivé toxikanty zvášť •3) Negativní vlivy matrice samotné bez ohledu na obsah toxikantů na živé organismy či interakce vlivu matrice s efekty toxikantů •4) spektrum analytických metod (tedy i limitních hodnot) je omezené a ve vzorku mohou být přítomny neanalyzované významně toxické látky. • 8 PŘEDNOSTI chem. analýz - Reprodukovatelnost, standardizovanost - Exaktní číselné výstupy srozumitelné laikům: využití v zákonech 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Praktické metody stanovení ekotoxicity - laboratorní biotesty in vitro - laboratorní biotesty in vivo - jednodruhové - laboratorní mikrokosmy - manipulované a kontrolované mezokosmy - polní studie - reálné ekosystémy METODY HODNOCENÍ EFEKTŮ Roste obtížnost průkazu KAUZALITY 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? •Výsledky biotestů jsou využitelné pro: • •prospektivní hodnocení ekologických rizik u testů čistých látek, pesticidů či testů směsí před jejich vnosem do ekosystému (kaly ČOV) • •retrospektivní hodnocení ekologických rizik u hodnocení toxicity matricí z prostředí – hledání kauzality mezi znečištěním a efekty 10 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? 11 INDIVIDUAL TOXICANTS MIXTURES OF CHEMICALS CONTAMINATED ENVIRONMENT RETROSPECTIVE PROSPECTIVE Bioassessment Field assessment Monitoring Bioassessment Field assessment Monitoring Lab studies Lab studies Simulated small ecosystems DISASTERS PREDICTIONS for future Time: NOW ! MIXTURES OF TOXICANTS 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? •Cíle prospektivního přístupu: •zhodnocení škodlivosti konkrétních kontaminantů (jednotlivých i směsí) a dalších stresorů pro organismy •analýza vztahů mezi koncentrací a účinkem („dose-response relationship“) •kvantifikace nebezpečnosti, hodnocení rizik (včetně legislativně nařízeného hodnocení) a predikce negativních účinků v reálném vzorku ŽP •nastavení limitních hodnot pro (legislativní) regulaci chemických látek, pesticidů a materiálů, které mohou přijít do kontaktu s ŽP (odpady, kaly, hnojiva…) •poznání dějů, procesů, zákonitostí a mechanismů týkajících se účinků kontaminantů (případně dalších stresorů) na biotu, osudu a biodostupnosti kontaminantů v ŽP a expozice organismů •pochopení příčin škodlivých účinků kontaminantů na organismy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kde lze biotesty využít ? •Cíle retrospektivního přístupu: •poznání vazeb (kauzality) mezi výskytem a osudem kontaminantů (stresorů) a stavem bioty •poznání proběhlých dějů a jejich zákonitostí umožňuje odhadovat vývoj pro budoucnost v podobných situacích (predikce) •hodnocení zásahů na reálné složky ŽP v reálných ekosystémech (hodnocení hnojení, remediací, posuzování kontaminovaných míst…) •poznání dějů, procesů, zákonitostí a mechanismů týkajících se účinků kontaminantů (případně dalších stresorů) na biotu, osudu a biodostupnosti kontaminantů v ŽP a expozice organismů •pochopení následků škodlivých účinků kontaminantů zejména na vyšších úrovních biologické organizace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Každý metodický přístup má svá omezení a může být interpretován pouze s ohledem na svůj informační obsah a zaměření Optimální je kombinace či prolínání obou přístupů !!! Kde lze biotesty využít ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení ekotoxicity REALIZACE BIOTESTU (přípravné cvičení) Úvod: Do rybníka, ve kterém kapři onemocněli plísní, se má jako léčivo přidávat malachitová zeleň MZ. Je třeba zjistit, zda účinná koncentrace MZ (1mg/L) nepoškodí po aplikaci populace zooplanktonu v rybníku. To by následně celkovou stabilitu ekosystému a také ekonomický přínos (chybějící zdroj potravy pro ryby, snížené přírůstky ryb atd). Zadání Pro zjištění potenciálních negativních účinků MZ využijete biotest s Daphnia magna (48 hod expozice). Diskutujte, jak konkrétně byste realizovali experimenty, které odpoví na tyto otázky: 1)Je koncentrace 1 mg/L bezpečná? 2)Jaká maximální koncentrace nebude u D. magna způsobovat letalitu? 3)Jaká koncentrace způsobí po 2 dnech uhynutí 50% jedinců D. magna? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Schema testu Ps_putida •1) Příprava organismu • • • •2) Příprava vzorku § § § § § § •3) Expozice • • • •4) Vyhodnocení § 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kroky realizace biotestu (stručně) •1) Příprava organismu §kultivační médium, standardní počty, stáří ... • •2) Příprava vzorku §ředění vzorku (mimo nádoby s organismy) – koncentrační řada ředící medium : – voda/medium – lze přímo přidávat k organismům – organické rozpouštědlo – přídavky jen malých koncentrací (0.5%) §negativní kontrola – ředicí medium § •3) Expozice §přídavky vzorku (kontrolního roztoku) k organismu, expozice (24, 96 h) • •4) Vyhodnocení §stanovení letality / růstu, srovnání vzorek – kontrola, odvození křivky dávka odpověď, statistické srovnání § 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Dávka/Koncentrace - Efekt/Odpověď Dose/Concentration Response Relationships 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Biologické účinky v závislosti na koncentraci látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému - po vstupu do prostředí dosahuje látka určitých koncentrací v prostředí - - toxický efekt je vyvolán dávkou v těle (působení koncentrace látky v těle po definovanou dobu – viz toxikodynamika) Toxikologie – práce s dávkami v těle mg/kg hmotnosti (mg/kg b.w. - body weight), mg/kg b.w./day Ekotoxikologie –spíše práce s koncentracemi v prostředí v prostředí měříme koncentrace ne dávky - Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému Příklady efektů? změna zdravotního stavu pokles příjmu potravy snížení reprodukční schopnosti mortalita - - Jak změříme „změnu zdravotního stavu“ ? Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému Příklady efektů? změna zdravotního stavu pokles příjmu potravy snížení reprodukční schopnosti mortalita - - V experimentu se hodnotí POZOROVATELNÝ (měřitelný) PARAMETR = ENDPOINT charakterizuje účinek a má k účinku jasný vztah Př. % přežívajících jedinců po působení dávky (efekt – mortalita) počty vajíček po působení dávky (efekt - reprodukční toxicita) Endpoint může být „kvalitativní“ (nemusí být kvantifikovatelný): - př. iritace na kůži ANO/NE - kategorizace NEJHORŠÍ / LEPŠÍ / NEJLEPŠÍ Vztahy Dávka - Odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nejčastější (klasická ekotoxikologie) „koncentrace“ vs. „spojitý efekt“ - Spojitá (vyhodnocuje a využívá se nejčastěji) - Nespojitá (např. mortalita +/-, kategorie iritance kůže - p) Závislost odpovědi (endpointu) na koncentraci (dávce) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Proč má křivka sigmoidní charakter ? Proč není lineární ? Účinek (např. % uhynutých) Rostoucí koncentrace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Většina dějů v přírodě má statisticky NORMÁLNÍ ROZLOŽENÍ (resp. Log-normální) (nejčastější jsou „průměrní“, méně časté jsou extrémy …) à z něj vychází u velké většiny hodnocených efektů - sigmoidní tvar křivky Statistické odvození „sigmoidní křivky“ dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Modelový experiment * 10 potkanů * Postupné injekční podávání toxinu jednotlivým zvířatům * Pomalu zvyšování koncentrace (dávky) podávané jednotlivcům à Sledování mortality Výsledek: - Někteří jedinci zemřou již při nižších dávkách (1, 2, 3) - Někteří jedinci hodně vydrží a smrt nastane až při vysokých dávkách (5-7) - Většina jedinců však s největší pravděpodobností zemře při dávce 4 (většina je „průměrných“, tj. ani extrémně citlivých ani rezistentních) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 1 Modelový experiment Postupné zvyšování koncentrace (dávky) podávané jednotlivcům : Histogram (četnost) à kumulativní četnost: sigmoidní charakter křivky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1) Parametry odvozené přímo z experimentálních dat LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L - první nejnižší koncentrace použitá v experimentu, která vyvolala významné efekty NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level - podobně: koncentrace použitá v experimentu … Nedostatky - subjektivní – závisí na zvolených koncentracích - jiný experiment à jiné výsledky (koncentrační rozmezí, ředicí faktor – rozdíly mezi koncentracemi 2x, 5x, 10x…) Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 2) další parametry odvozené z křivky dávka – odpověď ECx (x=1,5,10,25,50,75,90,99 apod.) - ne vždy je v experimentu dosaženo „přesně 5% efektu“ - parametry se počítají (z „modelované křivky“) STANDARD - Hodnoty odvozené pro 50% efekt - nejčastěji užívány pro srovnání toxicity (!) - odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou viz předchozí modelový experiment „nejvíce je průměrných“ a proto je odhad průměru nejpřesnější - Parametry LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L) LD50 – dávka (Dose) způsobující 50% letalitu (L) EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E) IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I) Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – úkol 1 Koncentrace (mg/L) Počet přežívajících % Přeživajících 0 20 100 0,05 20 100 0,1 18 90 0,2 19 95 0,4 15 75 0,8 9 45 1,6 3 15 3,2 0 0 6,4 0 0 Jaká je hodnota NOEC?, LOEC?, LC50?, LC90? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif MODEL SIGMOIDNÍ KŘIVKY - Složité matematické modely pro aproximaci - V současnosti - využití počítačové techniky à nelineární modely pro aproximace sigmoidy Jednodušší (historický) přístup (je ale třeba ho znát!) àLinearizace sigmoidy pomocí probitové metody Žádaný výsledek 1) odhad LCx 2) přesnost odhadu LCx (Interval Spolehlivosti) [Čím vyšší variabilita okolo křivky à tím menší přesnost] Jak prakticky odvodit parametry ECx ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 Probitová metoda Vychází z „normálního pravděpodobnostního rozložení“ 1) Každé hodnotě % (pravděpodobnost) přiřazena konkrétní hodnota – tzv. „probit “ (viz tabulka) 2) Probit „5“ odpovídá 50% pravděpodobnosti (50% efekt) àVztah „probit“ vs. Logaritmus koncentrace je lineární Linearizace sigmoidy Snadný odečet LC50: y=a.x +b Probit = a . Log(c) + b 50% efekt: Probit = 5 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Srovnání toxicity různých látek porovnání hodnot ICx - - Příklad Látka 1 je toxičtější - nižší ECx - při nižších koncentracích se projevují efekty Interpretace a využití křivek dávka-odpověď 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/240/3220671/3220671_pone.0024139.g002.png Srovnání toxicity různých látek Problém: různé směrnice (sklon) křivky Dávka-Odpověď à Pro interpretaci je nutno uchovat (ukázat) data celé křivky - Příklad: Na základě EC50 není rozdíl ALE látka 1 vykazuje efekty ve významně nižších koncentracích (bude mít nižší LOEC/NOEC] Využití křivky dávka - odpověď 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 BEZPRAHOVÉ působení -při klasickém hodnocení se předpokládá prahová koncentrace, při které již nelze pozorovat žádný efekt (NOEC / NOEL) -u některých látek se uvažuje o NEEXISTENCI prahu; tj. efekt se projeví při jakékoliv nenulové koncentraci (bezprahová toxicita), à stochastický účinek Bezprahově působící látky: Mutageny, genotoxické karcinogeny Koncentrace pouze zvyšuje pravděpodobnost stochastické (náhodné) události, tedy vzniku mutace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ne všechny křivky jsou „jednoduše sigmoidní“ à Nové poznatky: Endokrinní disruptory à Domácí úkol: Samostudium – PDF: Nature (2012) 490:462 à Znát odpovědi na tyto otázky: Jaké mechanismy způsobují „nemonotonní“ tvar křivky? Které látky například (znát strukturu) tyto efekty vyvolávají 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY (1) čisté látky a definované směsi látek (barvy, produkty chemické výroby ...) KONCENTRACE hmotnostní nebo molární – mg/L, ug/L, mmol/L (=mM), nmol/L (=nM) apod. ! Znát přepočty koncentrací ! (2) vzorky z prostředí a jejich extrakty (výluhy apod.) - KONCENTRACE původní matrice př. Voda …. EC50 = 1% (100x ředěná voda vyvolává 50% efekt) - KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...) Výsledkem hodnocení toxicity jsou tedy „KONCENTRACE“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TOXICITA SMĚSÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vzorky v prostředí = KOMPLEXNÍ SMĚSI - Látky ve směsích mají ve srovnání s čistými – izolovanými – látkami odlišné biologické vlastnosti (vč. toxicity) - - Látky se mohou v efektech ovlivňovat ADITIVITA / SYNERGISMUS / ANTAGONISMUS - Připomínka: model „Dynamic Energy Budget“ (tři hlavní procesy v biotě a jejich ovlivnění toxickými látkami) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (1) ADITIVITA - nejčastější princip v realitě směsí - základní princip kumulativní toxicity = Aditivní model - nejčastější u látek s "nespecifickým" mechanismem toxicity (polární narkoza) Př. látka 1 vyvolá v koncentraci c1, efekt 25% látka 2 vyvolá v koncentraci c2, efekt 30% směsný roztok L1 a L2 v koncentracích c1 a c2 vyvolá efekt 55% (25 + 30) Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (2) ANTAGONISMUS - látky ve směsi vzájemně inhibují toxický efekt - efekt po působení směsi je menší než podle předpovědi aditivního modelu - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi, spíše vzácný Příklady Současné působení neurotoxinů s různým mechanismem (princip "protijedů") – Veratridin (otevření membránových kanálů pro Na+/K+) - Saxitoxin (inhibice kanálů) Vyšší tvrdost vody (Ca, Mg) snižuje toxicitu těžkých kovů (Cu, Cd apod.) (Kompetice toxických kovů vs. Ca/Mg na žábrech o přenašeče à vyšší tvrdost: menší příjem toxických kovů à menší toxicita (antagonismus) Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (3) SYNERGISMUS - látky ve směsi se vzájemně potencují - efekt po působení směsi je vyšší než podle předpovědi aditivního modelu - často u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi Příklad Toxicita pro Ryby: současné působení detergentu (snížení povrchového napětí na membránách žaber) a polární látky (např. inhibitoru mitochondriální respirace) (samotný jed obtížně vstupuje do buňky ALE v přítomnosti detergentu à rychlý vstup, významný toxický efekt) Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vyhodnocení toxického působení látek v binárních směsích - tzv. isobologramy - Příklady: Aditivita Synergismus 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Praktické hodnocení toxicity směsí za předpokladu ADITIVITY 1) skupiny látek se stejným mechanismem toxicity („aditivita koncentrací“) 2) mezi skupinami („aditivita efektů“) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad Jaká bude pravděpodobně toxicita vzorku vody pro řasy, pokud v něm byly nalezeny uvedené toxické látky? Chemikálie a koncentrace ve vodě Skupina Mechanismus toxicity Atrazin – 0,1 ug/L trazin – vazba na PQ v PSII Simazin – 0,2 ug/L triazin – vazba na PQ v PSII 2,4-D – 3 ug/L močovina - rozpojení PSII MCPA – 1 ug/L močovina - rozpojení PSII Chlorfenol – 500 ug/L neutrální HC - polární narkoza Víte, že … EC50 jsou přibližně následující: triazinové herbicidy 0,5 ug/L deriváty močoviny 6 ug/L chlorfenol 2 mg/L … směrnice křivky dávka-odpověď je pro všechny skupiny látek cca „1“ (zdvojnásobení dávky vyvolá u každé skupiny přibližně dvojnásobný efekt) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Expozice (čas) vs. toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem „Kritická rezidua látky v organismu“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem „Kritická rezidua látky v organismu“ http://www.glerl.noaa.gov/res/Task_rpts/Images/2004/epland06-2f8.png •S prodlužující se expozicí přirozeně roste toxicita, ALE •Toxicita neroste s časem nekonečně (resp. hodnota LC50 neklesá nekonečně) •Podle modelů CBR lze odvodit nejnižší reálnou hodnotu LC50 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vztah mezi toxicitou (koncentrací) a časem (2) - Nesouvislá, sekvenční expozice - •Organismy nejsou chemickým látkám vystaveny kontinuálně –Expozice jednorázová –Expozice vícenásobná, dlohodobá atd. – •Čas a působení „směsí“ –1) Expozice látce A à změna fyziologie, zvýšení/snížení citlivosti –2) Následná expozice látce B à vyšší (neočekávaná) toxicita (viz Nature (2012) 490:462) http://www.bozpinfo.cz/obrazek/bumba_probit_analyza_001.gif