1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU Ekotoxikologie – závěr přednášek nové přístupy a poznatky OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přehled závěrečné přednášky •Moderní přístupy experimentální ekotoxikologie –In vitro modely –Biomarkery a „MOA“ (mode-of-action / omics) techniky • •Modely v ekotoxikologii –SAR a QSAR –AOP / PBPK / TOXCAST – •„Nové“problémy v ekotoxikologii –Nanočástice – •Novinky a zajímavosti 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výzkum mechanismů toxicity in vitro modely a biotesty •Zjišťování účinků (Biologie, Toxikologie a Ekotoxikologie) - existuje velké množství modelů • •Účinky na celých organismech –Standardní biotesty in vivo: legislativa –„Nestandardní“ biotesty in vivo: experimentální výzkumná práce • •Pochopení a identifikace specifických mechanismů působení –In vitro modely: Orgánové / Tkáňové / Buněčné –Výhody •Mechanistické porozumění •Šetření experimentálních zvířat (etické principy „3R“) –Nevýhody •„Jen“ in vitro, chybí komplex a interakce v organismu ____2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Page 4 Počty obratlovců používaných pro hodnocení chemických látek v Evropě Commission of the European Communities, 2010 12 million animals 8.7 %: Toxicology 50 %: Regulatory testing 15 %: Fish, birds, amphibians ~ 80 000 animals 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif In vitro modely v ekotoxikologii 1 – rybí buňky •Rybí buňky in vitro –Relativně snadná izolace buněk a udržování v kultuře (na rozdíl od savčích primárních linií se rybí buňky in vitro chovají jako imortalizované) –Příklady linií •RTL-W1 (Rainbow Trout Liver - W1) •RTgill (Rainbow Trout Gill) –Využití např. pro testování akutní toxicity (snaha o nahrazení testů in vivo) •podobná citlivost s in vivo modely à validace / standardizace • Full-size image (40 K) http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1568988312001412-gr6.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Reporterové testy analýza účinků závislých na jaderných receptorech •Specificky vytvořené buněčné linie •Původně odvozené z lidských, potkaních, rybích či jiných tkání •Následná úprava („GMO“) –stabilní transfekce specifickými geny, které se v buňkách normálně nevyskytují –Luciferáza (ze světlušky), Beta-galaktosidáza –Vložení do DNA v místech, která jsou kontrolována příslušným receptorem (AhR, ER…) •Princip – viz obrázek –Měření světla z luciferázy ~ množství dioxinově aktivních látek • •Někdy označované „CALUX“ (Chemical Assissted Luciferase Expression) –jde o komerční název některých buněk, ale v mnoha laboratořích (včetně RECETOX) se užívají principiálně stejné „nekomerční“ buňky (např. H4IIE.luc / MVLD / MDAkb2) – • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stanovení toxicit závislých na intracelulárních receptorech Light Light Luciferase Nuclear Factors 1 P + AhR HSP90 HSP90 Src HSP90 HSP90 Adapted from Blankenship (1994) DRE - Luc AhR ARNT Modulation of Gene Expression ARNT Src “Activated” 2 P P Cytosolic Proteins Membrane Proteins Increased Protein Phosphorylation Ligand (TCDD) Light Light Luciferase Nuclear Factors 1 P + AhR HSP90 HSP90 Src Src HSP90 HSP90 Adapted from Blankenship (1994) DRE - Luc AhR ARNT Modulation of Gene Expression ARNT Src “Activated” 2 P P Cytosolic Proteins Membrane Proteins Increased Protein Phosphorylation 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – využití reporterových testů Hladiny estrogenních látek (stanovení pomocí MVLN testu) na Přítoku a Odtoku ČOV Brno-Modřice • Velká účinnost čištění • Výsledné kncentrace (až 5 ng/L) jsou i tak biologicky účinné ! 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Budoucnost ekotoxikologie: Big data a „omics“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://3.bp.blogspot.com/-dokK9_P3A4I/UZ38uN8AoUI/AAAAAAAAAJc/d1N8vDjsmAw/s1600/what+is+a+chemical+ reactions.jpg http://upyourtalent.com/wp-content/uploads/2012/04/white-rat.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS52E4zw_1IWgj6a-zMCfagRjY0GxrrXUj7RPtc7h6W2mD _trk2 http://www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/biol_analytik_toxizitaetstests/pic/159498_gr.jpg Organism Chemical Adverse Effects Death Altered Reproduction Inhibition of Growth Tumorigenicity Skin irritation … + Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models Hazard assessment REGULATORY FOCUS (APICAL ENDPOINTS) Výsledek obrázku pro cyp19 Výsledek obrázku pro caco2 Newly added aspects What are the mechanisms (MoA – mode of action)? Can mechanisms serve for predictions? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrémní rozvoj analytických technologií à „OMICS“ http://www.omics.jp/about/img/omics_01.jpg A další „ómy“ •Lipidóm •Mikrobiom … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://systemsbiology.usm.edu/SystemsBiologyCenter/EL_ERDC/ERDC_img/Earthworm-Toxicogenomics.jpg Omics? … nejen obratlovci … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Sběr omics podporují strategické dokumenty & projekty Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy US National Academies of Sciences http://www.nap.edu/catalog/11970.html https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTAlr7MmMMxBP1Gffwd_0Gk4X2faiMuSVai0zxTF1WtiV1 DANMq https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQyQs5sVs1TzKletUOC20iLNg93Liu4X5Q_XF_I6rQWsL4 04Y83 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://3.bp.blogspot.com/-dokK9_P3A4I/UZ38uN8AoUI/AAAAAAAAAJc/d1N8vDjsmAw/s1600/what+is+a+chemical+ reactions.jpg http://upyourtalent.com/wp-content/uploads/2012/04/white-rat.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS52E4zw_1IWgj6a-zMCfagRjY0GxrrXUj7RPtc7h6W2mD _trk2 http://www.lfu.bayern.de/analytik_stoffe/biol_analytik_toxizitaetstests/pic/159498_gr.jpg Organism Chemical Adverse Effects (EC50) Death Inhibition of Growth Altered Reproduction Tumor Skin irritation … + Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models http://www.tdi.ox.ac.uk/_asset/image/tdi-barcoded-plates.jpeg/fit/300/300/FF0000 http://wallpoper.com/images/00/27/10/25/rainbows-vials_00271025.jpg + http://ehp.niehs.nih.gov/wp-content/uploads/118/4/ehp.0901392.g001.png 10^4 Chemicals HTS Chemical-biological interactions, Mechanistic Toxicological Data Hazard assessment New – Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico Methods Key task/question: How to link MECHANISTIC INFORMATION with APICAL ENDPOINTS ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Využití mechanistických dat à AOPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ecotoxicity is a consequence of sequence of events Escher, B. I., Behra, R., Eggen, R. I. L., Fent, K. (1997), "Molecular mechanisms in ecotoxicology: an interplay between environmental chemistry and biology", Chimia, 51, 915-921. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Adverse Outcome Pathways – Dráhy škodlivého účinku The EXISTING KNOWLEDGE is used to link the two anchor points: Molecular Initiating Event (MIE) and Adverse Outcome (AO) via a series of intermediate steps: Key Events Chemical Macro-Molecular Interaction Cellular Response Organ Response Organism Response Population Response Molecular Initiating Event Key Event 1 Key Event 2 Adverse Outcome Tissue Effect Key Event 3 Chemical Property Receptor/Ligand Interactions DNA Binding Protein Oxidation Gene Activation Protein Production Altered Signaling Altered Physiology Disrupted Homeostasis Altered Development / Function Lethality Impaired Development Impaired Reproduction Altered Sex Ratio Extinction Adverse Outcome Pathway Toxicity Pathway Mode of Action In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo In vivo Ankley, G. T., R. S. Bennett, et al. (2010). "Adverse outcome pathways: a conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment." Environmental Toxicology and Chemistry 29(3): 730-741. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ethinylestradiol (EE2) MIE Binding to ESTROGEN RECEPTOR https://www-pls.llnl.gov/data/assets/images/science_and_technology/life_sciences/cancer_diet/kulp1. jpg KEs - Activation Target genes - Proliferation/Apoptosis (sexual organs) - Synthesis of egg yolk (fish, amphibia) KEs - Effects - Females: reproduction regulation - Males: feminization (+ e.g. cancer promotion, development, immunomodulation) AOP Example: Fish population decline due to estrogen receptor modulation 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kidd, K.A. et al. 2007. Collapse of a fish population following exposure to a synthetic estrogen. PNAS 104(21):8897-8901 Control lake lake with EE2 EE2 - 5 ng/L (!) 7 years Adverse outcome – fish population decline 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP a regulatorní prediktivní toxikologie OECD AOP Knowledge Base 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Strategické směřování – podpora OECD http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/projects-adverse-outcome-pathways.htm 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://aopkb.org/ Key documents OECD Guidance document and a template for developing and assessing adverse outcome pathways (Series No. 184, Series on Testing and Assessment) Handbook for AOP developers 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif https://aopwiki.org/aops 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif AOP Example: MIE aromatase inhibition Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 30, No. 1, pp. 64–76, 2011 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Aromatase inhibition leading to reproductive dysfunction (in fish) https://aopwiki.org/wiki/index.php/Aop:25 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Regulatorní akceptace … pozitivní 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Related Projects & Studies & Databases •TOXNET - http://toxnet.nlm.nih.gov/ –searching databases on toxicology, hazardous chemicals, environmental health, and toxic releases •Tox21 - http://www.epa.gov/ncct/Tox21/ –10,000 chemicals –14 concentrations, 4 logs, 3 replicates –1536 well plates, 2-8 uL volumes –50+ assays •ToxCast - http://www.epa.gov/ncct/toxcast/ –App. 2000 chemicals –700+ assay, 300 signaling pathways –DATA AVAILABLE iCSS Dashboard •http://actor.epa.gov/dashboard •http://ww.epa.gov/ncct/toxcast/data.html • • • • • http://epa.gov/research/annualreport/2012/images/toxcast1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Related Projects & Studies & Databases •ToxRefDB (Toxicity Reference Database) –in vivo toxicological data –http://actor.epa.gov/toxrefdb/faces/Home.jsp •ExpoCast –information on human exposures –http://www.epa.gov/ncct/expocast/ •Human Toxome Project –information on human exposures –http://www.ewg.org/sites/humantoxome/ •Agriculture Health Study –Occupational Exposure to Pesticides – a cohort study –http://aghealth.nih.gov/ – • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Modely SAR a QSAR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR •SAR = Structure Activity Relationships –hledání vztahů mezi STRUKTUROU a AKTIVITOU látek (struktura -> eko-toxicita) –předpovědi efektů bez nutnosti experimentálních testování • •Řada přístupů –kvalitativní •přítomnost určité charakteristiky implikuje aktivitu (vlastnost) –dlouhý alifatický řetězec -> afinita k membránám – –kvantitativní (=QSAR – Quantitative SAR) •matematický popis vztahů –jednorozměrné vztahy – korelace, regresní vztahy ... –vícerozměrné modelování (PCA, PLS), neuronové sítě ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR v ekotoxikologii •Techniky QSAR původně vyvinuty pro design farmak • •Aplikace SAR, QSAR v ekotoxikologii –předpovědi environmentálně významných parametrů látek •logKow •biokoncentrace, bioakumulace •předpovědi biodegradability a metabolismu –odhady rychlosti degradace t1/2, vznikající metabolity – –předpovědi toxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Princip vývoje modelu QSAR •1) Vstupní data – ZNÁMÉ údaje –Skupina podobných látek –Známá (změřená) vlastnost – např. aktivita / toxicita –Známá fyz-chem data (stovky různých parametrů) •2) Hledání modelu ve známých datech –Např. Aktivita = a * parametr1 + b * parametr2 + c –(viz příklady dále) •3) Využití modelu pro předpověď „Aktivity“ neznámé látky –Fyz-chem parametry à dosazení do modelu à výpočet „toxicity“ – • 1 Příklad – vstupní data pro QSAR Aktivita Chemická data 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady •Předpovědi environmentálně významných parametrů chemických látek (viz také úvod přednášek) –Fyzikálně chemické parametry • Log P (log Kow) • Aqueous solubility • Melting point • Boiling point • Vapour pressure • Henry's law constant • ClogP (www.biobyte.com) • KOWWIN (esc.syrres.com) (www.epa.gov/oppt/exposure/docs/episuitedl.htm) • SLIPPER (www.ibmh.msk.su/qsar/molpro) • KlogP (www.multicase.com) • ABSOLV (www.sirius-analytical.com) • ProLogP (www.compudrug.com) • SPARC (ibmlc2.chem.uga.edu/sparc) • IA (www.interactiveanalysis.com) • ACD (www.acdlabs.com) • QikProp (www.schrodinger.com) • AP-Algorithms (www.ap-algorithms.com) • ProPred (www.capec.kt.dtu.dk) • Cerius2 (www.accelrys.com) • QMPRPlus (www.simulations-plus.com) Příklady software, různé modely a principy výpočtu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SAR, QSAR - příklady –Předpověď biokoncentrace Modely doporučované TGD (technical guidlines) při registraci nových chemických látek v EU (REACH) (není třeba testovat biokoncentraci – stačí model – šetření zvířat) logKow <6 logBCF = 0.85logKow - 0.7 logKow values 6 – 10 logBCF = -0.2 logKow2 + 2.74logKow - 4.72 –Předpověď biodegradability také někdy: QSBR - jednoduché korelace degradabilita-chemický parametr - sčítání vlivu charakteristických subdomén na degradabilitu ("+" degradace, "-" stabilita) -> suma pro celou molekulu = degradability score - vícerozměrné modelování 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Moderní výpočetní toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Adverse outcome pathways http://u.jimdo.com/www32/o/s09b2938cc0a6d68f/img/idb462b3a2365de42/1314711482/std/toxicokinetic-tox icodynamic-models-and-adverse-outcome-pathways.jpg Viz také dříve v přednáškách: Dokážeme z koncentrace látky v prostředí předpovědět (matematicky) účinky ? Základem je dokonalé porozumění 1) toxikokinetice (modely PBPK – viz dále) a 2) následně mechanismům (dynamika) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif PBPK modely PBPK (PBTK) Physiologically based pharmacokinetic (toxicokinetic) models http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/2/22/WholeBody_wiki.svg/220px-WholeBody_wiki.svg.png https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1Xr-zyM_wH8apSCpkALlZltgIBwQ4IcylkdluXxtRsQN mocsqJw Vnitřní „rozdělení“ organismu a parametrizace běžících procesů à Složitý model : Predikce koncentrací v jednotlivých tkáních 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology Koncepční model à ZOOM EE2 – toxikant ER, AR atd. – receptory VTG – vitellogenin (marker toxicity) Každá šipka: zvláštní diferenciální rovnice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Li (2011) BMC Systems Biology Výsledek: Srovnání MODEL vs. MĚŘENÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování http://journals.plos.org/ploscompbiol/article/figure/image?size=large&id=10.1371/journal.pcbi.10048 74.g001 Fig 1. The HPOL signaling network in rainbow trout as formulated in our model. Arrows and symbols on graph follow CellDesigner vs. 4.4 notation (www.celldesigner.org). GnRH is secreted from the hypothalamus into the pituitary stimulating the production of mFSH and mLH, which then leads to formation of FSH and LH, respectively. FSH, which is being continuously secreted from the pituitary, travels to the ovaries to stimulate production of E2. E2 then travels to the liver to bind with E2 receptors (R; translated from mR) to form ER. ER then stimulates the production of mVTG, which produces VTGL. Secreted VTG then travels from the liver to the ovaries via the plasma (VTGP) where it is absorbed by follicles in stages 3 through 6 (the proportion of follicles in these stages are denoted by Sj, j = 3, 4, 5, and 6) during vitellogenesis, the rate of which is affected by FSHP, to promote oocyte growth (OAvg). Oocyte growth then progresses the oocytes through the stages using a Weibull distribution created from OAvg together with OVar. In the later stages LHP stimulates the oocytes to produce DHP. Finally, oocytes undergo final maturation (SFOM) and combined with DHP, determine when the fish ovulates PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kvantitativní mechanistické modelování http://journals.plos.org/ploscompbiol/article/figure/image?size=large&id=10.1371/journal.pcbi.10048 74.g003 Fig 3. HPOL model predictions for (A) pituitary levels of FSHβ subunit mRNA, (B) pituitary levels of LHβ subunit mRNA, (C) Hepatic levels of E2 receptor mRNA and (D) Hepatic levels of VTG mRNA Observed data (dark grey circles; mean ±TG mRn = 3) PLoS Comput Biol. 2016 Apr 20;12(4):e1004874. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nano-eko-toxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif NANOČÁSTICE •„NANO“ – relativně nová oblast, řada praktických využití •ALE: unikátní vlastnosti –Vlastnosti nanočástic (včetně toxicity) nelze odvodit z vlastností částic z téhož materiálu o větších rozměrech a ani z vlastností chemikálie, ze které je materiál tvořen • •Definice –Nanočástice (nanoparticles): alespoň jeden rozměr <100 nm –Nanočástice přírodního původu - „ultrafine particles“ přítomné v přírodních aerosolech nebo jako vedlejší produkt lidské činnosti (prach, dým, kouř apod.) –Vyráběné nanomateriály (manufactured, engineered NM) –Nanoaerosoly: aerosoly jednotlivých volných nanočástic nebo nanostrukturních částic (= aglomerátů nanočástic nebo nanovláken) – přírodního původu nebo vyráběných 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní charakteristiky vyráběných NM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady - nanočástice https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR52Y7PdqKN5Z97ZhIFGfyoY41Qv9l41niNcuE3T-F9sWy IjSKMpA http://nano.anl.gov/images/bifunctional_nanoparticle.jpg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR9LiHxdv4f1xLBnJm7j0ey82mAIkrqpx6dVbyiFdDTwcR n5G35 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTRyUwtGdjXOTAe8emSb0Ngkn0R-l8krCeEyFVPeK8-f5Y rg322ug https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS1YFciG79F0BpdYj74qJmGI-zgvfT7pAazIR4bDRuhmll hzbqG https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQzw3I5Xb7Vq_3twyU5AzgXl6TZPl1WvVm-RGpTGUQSGNu BdlDu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif (Eko)toxicita nanočástic – specifické vlastnosti http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0165993611003748-gr1.jpg (Neznámé) parametry částic, které mohou mít vliv na toxicitu Složení (chemické) Povrch (velikost, tvar) Náboj Stabilita Agregace částic Interakce s chemikáliemi Interakce s ionty Vliv na osud látek Přímá toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Nanočástice à mechanické vlivy = toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Novinky … stresová biologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Barevnější samci sýkor à Atraktivnější pro samice … à Lepší kvalita spermatu (karotenoidy brání proti oxidativnímu stresu) https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQbhIkN6LbSYHEyRM5L5f20X9xjp7wEr-XtnuPAK_otW_c gy7vt 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Čmeláci a pesticidy –Velice významní opylovači –Specifická biologie oproti včelám • kolonie s velmi malým počtem jedinců –Současné aplikace různých pesticidů na sousedních polích •V praxi není koordinace mezi farmáři: koexpozice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vliv pesticidů na čmeláky – polní studie: aplikovány povolené dávky - 2 individuální látky „I“ a „LC“ - současná expozice „M“ (mixed) Celkové ztráty dělnic v průběhu experimentu