MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKÁŘSKÁ FAKULTA Biochemický ústav Izolace a analýza lignanů Schisandra chinensis Disertační práce Brno 2009 PharmDr. Lenka Březinová Vedoucí disertační práce: Mgr. Jiří Slanina, Ph.D. 2 Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně a použila jen uvedenou literaturu. 3 Děkuji mému vedoucímu disertační práce Mgr. Jiřímu Slaninovi, Ph.D. za odborné vedení, rady a cennou pomoc po celou dobu mého studia. Děkuji Ing. Heleně Vlašínové, Ph.D. z Ústavu biologie rostlin MZLU v Brně a RNDr. Otakaru Humpovi z Národního centra pro výzkum biomolekul za pomoc a odbornou spolupráci. Dále děkuji své rodině a celému kolektivu Biochemického ústavu za podporu a pochopení. 4 OBSAH Seznam použitých zkratek.......................................................................................................... 6 1. TEORETICKÁ ČÁST.............................................................................................. 10 1.1. Úvod................................................................................................................. 10 1.2. Botanická charakteristika ................................................................................. 12 1.3. Výskyt .............................................................................................................. 14 1.4. Sběr a úprava.................................................................................................... 14 1.5. Obsahové látky................................................................................................. 15 1.6. Biologická aktivita ........................................................................................... 24 1.7. Tkáňové kultury, růstové regulátory a elicitace .............................................. 34 2. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE .................................................................................. 37 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST.................................................................................... 38 3.1. Přístroje, chemikálie, rostlinný materiál a tkáňové kultury ............................. 38 3.1.1 Přístroje ............................................................................................................ 38 3.2. Metody ............................................................................................................. 40 3.2.1 Kultivace tkáňových kultur S. chinensis .......................................................... 40 3.2.2 Extrakce............................................................................................................ 42 3.2.2.1 Extrakce vzorku kultury S. chinensis .............................................................. 42 3.2.2.2 Extrakce vzorku amberlitu .............................................................................. 42 3.2.2.3 Extrakce na tuhou fázi (SPE) .......................................................................... 42 3.2.3 HPLC stanovení ............................................................................................... 43 3.2.4 Izolace obsahových látek Schisandra chinensis .............................................. 45 3.2.5 Stanovení adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 a XAD-7 47 4. VÝSLEDKY ............................................................................................................ 49 4.1. Izolace obsahových látek Schisandra chinensis .............................................. 49 4.1.1 Izolace majoritních lignanů.............................................................................. 49 4.1.2 Izolace minoritních lignanů.............................................................................. 53 4.2. Optimalizace metody extrakce a stanovení lignanů S. chinensis pomocí HPLC63 4.2.1 Optimalizace mobilní fáze pro HPLC............................................................... 63 4.2.2 Výběr vlnové délky pro analýzu ....................................................................... 68 4.2.3 Volba rozpouštědla pro extrakci ....................................................................... 70 4.2.4 Optimalizace extrakce na pevnou fázi (SPE)................................................... 71 5 4.2.5 Optimalizace ředění vzorku k nástřiku pro HPLC analýzu................................ 74 4.2.6 Kalibrace HPLC ................................................................................................. 78 4.2.7 Návratnost lignanů ............................................................................................. 79 4.3 Adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice........................................................ 82 4.4 Analýza obsahu lignanů v tkáňových kulturách S. chinensis............................ 86 5. DISKUZE .............................................................................................................. 102 6. ZÁVĚRY................................................................................................................ 111 7. LITERATURA....................................................................................................... 112 8. PŘÍLOHY............................................................................................................... 116 6 Seznam použitých zkratek 2,4-D kyselina 2,4- dichlórfenoxyoctová A absorbance ATP adenozintrifosfát AZT azidothymidin BHT 2-,6-di-tert-butyl-4-methylfenol cAMP cyklický adenozin-3´,5´-monofosfát CNS centrální nervová soustava DA2 dopaminergní receptor DAD detektor diodového pole DDB dimethyl-4,4´-dimethoxy-5,6,5´,6´-dimethylendioxybifenyl-2,2´-dikarboxylát DNA deoxyribonukleová kyselina GSH redukovaný glutathion GST gluthation-S-transferáza HIV virus lidské imunodeficience HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie LD50 množství látky, po které uhynulo 50 % testovaných živočichů za 24 hodin po expozici LDL Low Density Lipoprotein, lipoprotein o nízké hustotě LOD limit detekce LOQ limit kvantifikace MDR cancer multidrug resistance, resistence na cytostatika NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfát NMR nukleární magnetická rezonance NO oxid dusnatý PAF faktor aktivující trombocyty P-450 cytochrom P-450 ROS Reactive Oxygen Species, reaktivní formy kyslíku SPE Solid Phase Extraction, extrakce pomocí pevné fáze SOD superoxiddismutáza TLC tenkovrstevná chromatografie 7 Seznam použitých zkratek lignanů DS deoxyschizandrin GA gomisin A GN gomisin N GSCH -schizandrin SCH schizandrin WC wuweizisu C 8 SOUHRN Disertační práce se zabývá izolací dibenzo[a,c]cyklooktadienových lignanů rostliny Schisandra chinensis pomocí semipreparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), dále optimalizováním metody extrakce lignanů a stanovením těchto sekundárních metabolitů v buněčných kulturách Schisandra chinensis in vitro. Schisandra chinensis je velmi často používanou léčivou rostlinou v zemích Dálného východu. Plody a semena této liány se používají po staletí jako tonikum a antitusikum. Účinnými sloučeninami S. chinensis jsou lignany s chemickou strukturou odvozenou od dibenzo[a,c]cyklooktadienu. Tyto lignany mají široké spektrum biologických účinků, včetně hepatoprotektivní, antioxidační a antivirové aktivity. 1 Izolace lignanů vycházela z petroletherového extraktu semen S. chinensis, ze kterého byla frakce bohatá na lignany získána extrakcí do methanolu. Methanolový extrakt byl dále frakcionován na sloupci silikagelu. Přečištěním frakcí pomocí semipreparativní HPLC na reverzní koloně byly získány lignany schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, -schizandrin a minoritní tigloylgomisin H, tigloylgomisin P, angeloylgomisin H a gomisin J. Vyizolované lignany byly testovány na Biologickém ústavu LF MU na schopnost obnovit citlivost rezistentní buněčné linie plicního karcinomu COR-L23/R exprimující ,,multidrug resistance protein 1" k cytostatiku doxorubicinu. Deoxyschizandrin a -schizandrin byly schopny statisticky významně zvýšit intracelulární akumulaci doxorubicinu a obnovit citlivost rezistentních buněk k doxorubicinu. V dalším kroku disertační práce byla vyvinuta jednoduchá, rychlá a účinná metoda pro kvalitativní stanovení lignanů ve vzorcích kultur S. chinensis, dále tato metoda byla upravena i pro stanovení obsahu lignanů v médiích a pro stanovení lignanů adsorbovaných na polymerní pryskyřice. Metoda byla optimalizována v krocích ­ výběr vhodného činidla pro extrakci lignanů z rostlinného materiálu, preseparace vzorku pomocí extrakce na tuhou fázi (SPE) a HPLC analýzy. Jako nejvhodnější činidlo pro extrakci byl vybrán methanol. Odparek z extrakce byl přečištěn pomocí extrakce na tuhou fázi SPE. Jako mobilní fáze pro kolonu Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) byl použit 50% vodný roztok acetonitrilu (objemová %) s průtokem 2 ml/min. Lignany byly kvantifikovány UV detekcí při 220 nm. Množství lignanů v plodech je poměrně nízké (přibližně 1 ­ 2 % sušiny) a je tvořeno nejméně 30 různými lignany. Obsah jednotlivých lignanů v rostlinách je velmi variabilní. 2 Tyto okolnosti značně znevýhodňují rostlinný materiál jako zdroj pro získání lignanů. 9 Buněčné kultury S. chinensis mohou představovat výhodný zdroj těchto sekundárních metabolitů. Vyvinutou metodou stanovení obsahu lignanů v kulturách S. chinensis byl vyhodnocen vliv některých elicitorů na syntézu těchto sekundárních metabolitů kulturou a také působení přídavku polymerních pryskyřic Amberlite XAD-2 a XAD-7 k médiu. Tyto kultury pocházely z Ústavu biologie rostlin Mendlovy lesnické a zemědělské univerzity v Brně. Výsledky popsané v této práci ukazují, že přídavek polymerních pryskyřic, zejména nepolárního amberlitu XAD-2, může být velmi účinný způsob pro převedení lignanů do extracelulárního prostředí a pro zvýšení biosyntézy těchto sekundárních metabolitů buněčnými kulturami S. chinensis. Amberlit XAD-2 adsorboval a zvyšoval především biosyntézu lignanu deoxyschizandrinu a amberlit XAD-7 zvyšoval u některých linií syntézu wuweizisu C. Lignany adsorbované polymerní pryskyřicí pak mohou být snadno získány bez destrukce buněčné kultury, což je výhodné vzhledem k pomalému růstu kultur. 10 1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1. Úvod Schizandra čínská ­ Schisandra chinensis (TURCZ.) BAILL. 3 , (synonyma: S. japonica, HANCE, Kadsura chinensis TURCZ., Maximowicia amurensis RUPR., M. chinensis MAXIM., česká synonyma: Klanopraška čínská, Magnolka čínská) 4 je již po mnoho staletí využívána v tradičním lékařství Dálného východu. 5 Rod Schisandra je některými autory řazen do čeledi Magnoliaceae (Šácholanovitých), jinými do samostatné stejnojmenné čeledi Schisandraceae. Obsahuje cca 25 druhů, z nichž většina je rozšířena v subtropech Asie, pouze dva druhy rostou na Jávě a jeden na jihovýchodě USA. 3 Schisandra chinensis bývá někdy nazývána japonsko-mandžuským endemitem. 6 Tento druh roste v oblasti Dálného východu, na jih od 51° stupně severní šířky ­ v Rusku, v Přímořském a částečně Chabarovském kraji, v Amurské oblasti, na jižním Sachalinu a na Kurilských ostrovech. 3 Mimo tento areál je taxon rozšířen v Japonsku, Koreji, Číně. 7 Pěstuje se i v jiných oblastech včetně Evropy, kde dokonce plodí. 8 Plocha přirozených porostů se odhaduje na 6400 ha. Schizandra zde roste ve smíšených a listnatých lesích, především na lehkých, naplavených půdách v okolí řek a potoků, obvykle ve výškách 200 ­ 500 metrů nad mořem, v severozápadní Číně až do výšky 1300 metrů nad mořem. 3 V tradiční čínské medicíně je tento druh znám již dávno a je nazýván rostlinou, která poskytuje ,,plody pěti chutí " ­ kyselé, hořké, sladké, palčivé a slané. Její léčivý a tonizující účinek byl znám již v pátém století. 9 Díky biologicky účinným látkám, které jsou obsaženy ve větší či menší míře ve všech částech rostliny, patří například v čínské tradiční medicíně do první kategorie přírodních léčiv. Hlavní sekundární metabolity jsou lignany dibenzocyklooktadienového typu. Schizandra se objevuje už v lékopisu sestaveném slavným Li Š´- čenem (1518­1593) a vydaném v roce 1596. Také lovci na Dálném východě i místní obyvatelstvo znají dobře účinky této rostliny a široce ji využívají nejen v čerstvém stavu, ale i suší na zimu. 3 Nejcennějším zdrojem biologicky účinných látek jsou semena. Bobulí se používá nejen ve farmaceutickém průmyslu, ale i jako ovoce v domácnosti, či se zpracovávají průmyslově. V praxi se nejčastěji zhotovuje ze semen a bobulí lihový extrakt v poměru 1 : 3. Je možno používat i rozemletá semena. Tyto přípravky mají povzbudivé účinky na centrální nervovou soustavu, stimulují srdce, krevní systém a dýchání, také zvyšují krevní tlak a zlepšují ostrost zraku. 3 Ve vietnamské tradiční medicíně se používá lihový extrakt k léčbě impotence a jako posilující lék po těžkých porodech. 10 Tonizující čaj a extrakty s nižší účinností se připravují 11 i z listů, stonků a mladých výhonů. 3 Z nověji zjištěných poznatků vyplývá, že biologické spektrum účinků je velmi obsáhlé. Lignany mají především velmi významné hepatoprotektivní 11 a antioxidační účinky 12 , které směřují používání drogy jako léčiva především do těchto indikací. Zmíněné účinky jsou velmi vhodně doplňovány dalšími, příznivým vlivem na trombocytární agregaci a na PAF 13 , na metabolismus cholesterolu a lipidů. 14 Disponují imunostimulačním 15 a antineoplastickým efektem 16 , antihypertenzní aktivitou 17 , protizánětlivými 18 , antiulcerózními 19 a jinými účinky. Vzhledem k šíři biologických účinků a nízké toxicitě látek je velmi vhodné rozšířit použití ať už drogy nebo jednotlivých izolovaných lignanů v Evropě. Získání čistých lignanů je poměrně složité, protože v rostlině je četné množství lignanů, ale v malém množství. Nejvyšší obsah lignanů byl nalezen v semenech cca 2 ­ 5 % suché hmotnosti, někteří autoři uvádějí až 10 %. V ostatních částech této asijské liány se vyskytují účinné látky zhruba v procentech o řád méně. A protože výtěžek semen je kolem 5 % na hmotnost čerstvých plodů, obsah lignanů, který můžeme získat z jedné standardně plodící rostliny je velice nízký. Zhruba od roku 1990 probíhají pokusy připravit tyto velmi účinné látky syntetickou cestou. Tým profesora Tanaky z japonské farmaceutické společnosti Tsumura připravil většinu majoritních lignanů s termostabilní konfigurací biarylu chemickou syntézou. Nicméně pro technické využití jsou tyto syntézy ekonomicky nevýhodné, a tak se nadále zůstává, u pěstovaní rostlin a následné izolace rostlinného materiálu pro zisk dibenzocyklooktadienových lignanů. Každá rostlina obsahuje zhruba více než 40 lignanů a obsah těchto látek je velmi variabilní, liší se region od regionu. Také se liší obsah látek u jednotlivých rostlin pěstovaných ve stejné lokalitě, což poměrně ztěžuje izolaci jednotlivých lignanů. Proto existují snahy zvýšit produkci jednotlivých lignanů v rostlině. Na Ústavu biologie rostlin Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně bylo vypěstováno několik linií buněčných kultur Schisandra chinensis s cílem zvýšení produkce lignanů, zavedení pevného postupu v pěstování těchto kultur. Schisandra chinensis je rostlinou s širokým využitím jak plodů, tak jednotlivých sekundárních metabolitů, proto se dostává v současnosti do zorného pole ve výzkumu i v praktickém využití. 6 12 1.2. Botanická charakteristika Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Klanopraška čínská, Magnolka čínská) je léčivá rostlina původem z Dálného východu. Je řazena do čeledi Magnoliaceae, jinými autory do samostatné čeledi Schisandraceae. 3 Čeleď Schisandraceae je kromě rodu Schisandra (23 druhů) 4 tvořena ještě rodem Kadsura (16 druhů). 5 Rod Kadsura se vyskytuje pouze ve východní Asii, rod Schisandra roste též převážně ve východní Asii, ovšem je možné nalézt druh schizandry který je domácí v Severní Americe a Mexiku. 7 Čeleď Schisandraceae je evolučně velmi stará. Počátky se datují od pozdního pleocenu. 8 Plody S. chinensis jsou v čínštině nazývány ,,Wu-wei-zi" (v překladu plody pěti chutí), v japonštině ,, Gomishi" a v korejštině ,, Omicha". Na západě byla čínská rostlina jménem Wuweizi pojmenována poprvé Kadsura chinensis roku 1832 v publikaci ruského botanika Nikolai. S. Turczaninova. V roce 1856, na počest jeho slavnějšího kolegy K. J. Maximowicze, ruský botanik Franz. J. Ruprecht vytvořil nový rod nazvaný Maximowiczia a pojmenoval rostlinu Maximowiczia chinensis. V roce 1866 francouzský botanik H. E. Baillon přeřadil rostlinu do rodu Schisandra a od této doby je rostlina známá pod názvem Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Druhové jméno schizandra je odvozeno z řeckého schizcin, což znamená rozetnout, rozrazit, a z andros ­ což znamená muž. 1 Schizandra čínská je vytrvalá, dřevnatějící, opadavá liána se silnými, monopodiálně se větvícími lodyhami, dosahujícími tloušťky 1 ­ 2 cm a délky 10 ­ 12 m, které vycházejí ze sympodiálních, provazčitých, šedohnědých stolonů. Tyto stolony jsou pokryty šupinovými pupeny listů a hojnými hrbolky. Kůra mladých výhonů je hladká, hnědočerná a odlupuje se. Obr. 1.: List S. chinensis 9 Listy jsou střídavé, řapíkaté, mírně dužnaté, na líci zelené a na rubu světlejší, se slabými trichomy na vystupující nervatuře. Zakládají se ve spirále a tvoří lichopřeslen. Čepel je 13 eliptická nebo opakvejčitá, na špici zaostřená, délky 5 ­ 10 cm a šířky 3 ­ 5 cm. Listové řapíky jsou červenohnědé 1 ­ 3 cm dlouhé. Okraj listu je mělce zoubkatý, viz. obrázek 1. 6 Obr. 2.: Samičí květy S. chinensis 9 Biologie kvetení je poměrně složitá. V přírodě se setkáváme jak s rostlinami jednodomými, tak i dvoudomými. V některých letech se tvoří jen samčí květy, v jiných samčí i samičí, což velmi často závisí na podmínkách prostředí, především na teplotním režimu, výživě rostlin a vlhkosti půdy. Vliv má také stáří rostliny, při prvním kvetení se často tvoří pouze květy samčí, samičí květy se objevují až v letech následujících. 10 Samičí květy na obrázku 2 mají na krátkém válcovitém lůžku velký počet dvojvaječných pestíků. Při dozrávání se toto lůžko zvětší 20 ­ 50krát, a tím se vytvoří z jediného květu souplodí bobulí. Vzhledem připomíná válcovitý hrozen rybízu (Obr. 3), ten je dlouhý 2 ­ 8 cm a obsahuje 2 ­ 22 bobulí, výjimečně až 40 bobulí. Hmotnost jednoho hroznu je 7 ­ 22 g. Šťavnatá, červená bobule kulovitého tvaru má hmotnost 0,4 ­ 0,7 g a uvnitř obsahuje zpravidla dvě žlutá nebo žlutohnědá ledvinovitá semena asi 3 mm velká. 9 Obr. 3.: Plody S. chinensis 9 Samčí květy (Obr. 4) vyrůstají v úžlabí listů po 2 ­ 7 na dlouhých růžových stopkách a mají jemnou citrónovou vůni. Koruna je až 15 mm velká, složená ze 6 ­ 9 voskovitých okvětních lístků, které jsou krémově bílé, jindy narůžovělé. 9 14 Obr. 4.: Samčí květy S. chinensis 9 Schizandra se rozmnožuje semeny i vegetativně (zimními i letními řízky, dělením rostlin či odkopky). V našich klimatických podmínkách začíná rašení už počátkem dubna, kvetení koncem května až začátkem června a plody dozrávají počátkem září. Rostliny začínají plodit kolem pátého roku. 20 1.3. Výskyt Schizandra čínská je japonsko ­ mandžuským endemitem. Je rozšířena v Rusku především v Přímořském oblasti, na jihu Chabarovského kraje, v oblasti Sachalinu a na jihozápadě Amurské oblasti. 21 Mimo tento areál je taxon rozšířen v Japonsku, Koreji a Číně. 22 Obr. 5.: Oblast výskytu S. chinensis, Mandžusko-červeně podbarvená oblast 23 1.4. Sběr a úprava Plody jsou výchozím materiálem pro získání dvou drog Fructus schisandrae chinensis (v Japonsku zvané Gomishi, v Číně Wu-Wei-Zi) a Semen schisandrae oficinální v ruském lékopise. Plody jsou též zahrnuty v lékopisu Čínské lidové republiky a Japonska. Tato rostlina není obsažena v lékopise Evropské unie a na českém trhu je možné se s ní setkat v podobě 15 potravinových doplňků (čaj apod.) Plody jsou po sběru zbaveny karpoforů a suší se v sušárnách při 35 ­ 40 o C (max. 60 o C) nebo na slunci a nakonec se zbaví nečistot (sesychací poměr 1 : 5). Při druhém způsobu se z vyčištěných bobulí vylisuje šťáva, zbylý výlisek se rozdruží a dobře promyje vodou, až je odstraněn exokarp. Výtěžek semen je kolem 5 % na hmotnost čerstvých plodů. 6 Hlavními obsahovými látkami v plodech čínské provenience jsou schizandroly A a B, gomisiny B, C, schizanhenol, deoxyschizandrin, ­schizandrin a schizandrin C. 24 1.5. Obsahové látky V plodech S. chinensis byly identifikovány tyto látky: 1. dibenzo[a,c]cyklooktadienové lignany (schizandrin, gomisiny, wuweizisu C) 4 2. dibenzylbutanové lignany (pregomisin, meso-dihydroguajaretová kyselina 25 , nordihydroguajaretová kyselina 26 ) 3. monoterpeny (borneol, 1,8-cineol, citral, p-cymol a - a -pinen) 17 4. seskviterpeny (seskvikaren, -ylangen, chamigrenal, -chamigren a -chamigren, -bisabolen) 18, 19, 20 5. organické kyseliny (citrónová, jablečná, jantarová, vinná, sorbová, protokatechová a stopy šťavelové kyseliny) 4 6. další sloučeniny (thymochinol, thymochinol 5-(O)--glukopyranosid, kamferol 3-(O)-D-rutinosid 21 , 5-hydroxymethyl-2-furaldehyd, anwulalignan 22 , -sitosterol, schisandrová, isoschisandrová kyselina, 2,3-dihydroxypropyloktadekanoat 24 , citrostadienol 27 , flavonoidy ­ kvercetin a kamferol, které jsou jednou z hlavních složek v listech a stoncích 28 ) V oplodí byly navíc prokázány cukry, anthokyany a kyselina askorbová. Semena jsou další částí plodu a z hlediska použití nejdůležitější částí rostliny. Obsahují až 34 % mastného oleje. V tomto oleji jsou obsaženy lignany, silice, steroly např. citrostadienol, vitamín E a volné mastné kyseliny. Silice obsahuje řadu terpenických látek, především seskviterpeny, které jí dodávají charakteristickou vůni připomínající citrón. 6, 26 Nedávno byly mezi obsahovými látkami S. chinensis objeveny vysoce oxidované nortriterpenoidy netypických struktur nazvané wuweizidilaktony A ­ F, které mají schiartanový skeleton a dva bisnortriterpenoidy 18-norschiartanového skeletonu, které se nazývají wuweizidilaktony G a H. 29 16 1.5.1 Lignany Hlavními obsahovými látkami plodů a semen S. chinensis, zodpovědné za jejich biologickou aktivitu, jsou lignany. V současnosti je známo kolem 200 lignanů nacházejících se ve více jak 70 čeledích rostlin. Lignany se v rostlinách mohou vyskytovat ve formě glykosidů, většinou jsou však přítomny ve formě aglykonů. Nachází se hojně u nahosemenných (jehličnany) a u dvouděložných rostlin. 30 Jsou hlavními sekundárními metabolity čeledi Podophyllaceae a Schisandraceae. Byly nalezeny prakticky ve všech částech rostlin, typická je jejich přítomnost ve dřevě i kůře stromů a v pryskyřicích. 31 U některých druhů byl nejvyšší obsah lignanů nalezen v semenech. 2 Lignany jsou poměrně rozsáhlou skupinou sekundárních metabolitů cévnatých rostlin se zajímavými biologickými účinky. 16 Skládají se ze dvou fenylpropanových jednotek, které jsou spojeny přes centrální uhlíky obou postranních řetězců. Název lignany byl pro tuto skupinu přírodních látek odvozen z toho, že tyto sloučeniny byly původně považovány za meziprodukty při biosyntéze ligninu (C6-C3)n, polymeru rovněž složeného z fenylpropanových jednotek jako lignany (C6-C3)2. Dnes je zřejmé, že vzhledem ke struktuře lignanů a ligninu, pouze některé z nich mohou sloužit k tomuto účelu. 32 Lignany jsou striktně definovány jako dimery vzniklé oxidativní dimerizací dvou fenypropanových jednotek spojených centrálními uhlíky jejich propanových bočních řetězců v polohách C-8 a C-8´. 33 Spojení dvou fenylpropanových jednotek může poskytnout čtyři stechiometrické varianty a u lignanů dibenzocyklooktadienového typu poskytují ještě další dvě stereostruktury. Lignany obsahují 2 chirální uhlíky C-7 a C-8, viz. obrázek 6. Dalším asymetrickým centrem je substituovaný bifenyl. Methoxylové skupiny, které se váží na C1 a C14 (o-polohy bifenylu), ze stérických důvodů zabraňují rotaci aromatických jader kolem vazby, která spojuje obě aromatická jádra. 34 15 10 16 5 9 6 8 7 14 13 11 12 CH3 CH3 1 2 4 3 H3CO H3CO H3CO O O H3CO Obr. 6.: Vzorec lignanu -schizandrinu, číslování dibenzo[a,c]cyklooktadienového kruhu, chirální uhlíky C-7 a C-8 17 Nepolární charakter lignanů umožňuje jejich snadnou prostupnost buněčnými membránami a schopnost ovlivňovat řadu buněčných dějů. Některé lignany se používají jako léčiva. Lignan podofylotoxin je známým inhibitorem polymerace tubulinu. Etoposid a teniposid, chemicky modifikované deriváty epipodofylotoxinu, se používají jako cytostatika, způsobují zlomy v obou vláknech DNA dělících se buněk ireversibilní inhibicí topoizomerázy II. Tato léčiva působí v širokém spektru chemoterapie rakoviny. 35 Některé lignany vykazují také výraznou antivirovou, mikrobiální aktivitu. 36 U některých lignanů a jejich analogů byla prokázána účinnost proti viru HIV-1. 37 Fyziologická funkce lignanů v rostlinách zatím nebyla ještě plně identifikována. Existují ovšem důkazy, že lignany hrají nezanedbatelnou roli v chemických interakcích mezi rostlinami a houbami, rostlinami navzájem a rostlinami a hmyzem. A to buď přímo, nebo zprostředkovaně, formou synergismu s jinými účinnými rostlinnými látkami. Prekurzory lignanů jsou také meziprodukty nebo komponenty tvorby ligninu, tudíž mohou hrát určitou roli v lignifikaci a tím následně i v regulaci růstu rostlin. 34 Podle konfigurace a optické aktivity můžeme lignany rozdělit do sedmi tříd: 1. Dibenzocyklooktadieny s R konfigurací bifenylu: deoxyschizandrin, gomisin M2, gomisin K2 a gomisin K3 2. Dibenzocyklooktadieny s R konfigurací bifenylu a hydroxyskupinou na C-7: schizandrin, izoschizandrin, gomisin A, gomisin H, angeloylgomisin H tigloylgomisin H, benzoylgomisin H a gomisin T 3. Dibenzocyklooktadieny s S konfigurací bifenylu: gomisin J, gomisin N, gomisin K1, wuweizisu C, gomisin L1 a gomisin L2 4. Dibenzocyklooktadieny s S konfigurací bifenylu a hydroxyskupinou na C-6: gomisin O, epigomisin O, gomisin E, angeloylgomisin O, angeloyllisogomisin O, bezoylgomisin O, gomisin R, gomisin S a benzoylgomisin O 5. Dibenzocyklooktadieny s S konfigurací bifenylu a hydroxyskupinami na C-6 a C-7: gomisin B, gomisin C, gomisin F, gomisin F, gomisin G, angeloylgomisin Q, 18 schizantherin D, gomisin D, angeloygomisin P a tigloylgomisin P 6. Opticky aktivní dibenzocyklooktadieny vyskytující se ve formě racemátu: -schizandrin a gomisin M1 7. Dibenzylbutanové lignany: pregomisin, meso-dihydroguajaretová kyselina 38 , nordihydroguajaretová kyselina 39 Dibenzocyklooktadienové lignany s R konfigurací bifenylu jsou pravotočivé a s S konfigurací levotočivé. 16 Lignan R1 R2 R3 Deoxyschizandrin OCH3 OCH3 OCH3 (+)-Gomisin K2 OH OCH3 OCH3 (+)-Gomisin K3 OCH3 OCH3 OH 19 Lignan R1 R2 R3 R4 R5 R6 (-)-Gomisin L1 OCH3 OCH3 OH OCH3 -OCH2O(-)-Gomisin L2 OH OCH3 OCH3 OCH3 -OCH2OGomisin N -OCH2O- OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 Gomisin J OH OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH (-)-Gomisin K1 OH OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 Wuweizisu C -OCH2O- OCH3 OCH3 -OCH2OLignan R1 R2 R3 R4 R5 R6 Schizandrin OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OH H Isoschizandrin OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H OH Gomisin A -OCH2O- OCH3 OCH3 OH H Gomisin H OCH3 OCH3 OH OCH3 OH H Angeloylgomisin H OCH3 OCH3 O-Ang OCH3 OH H Tigloylgomisin H OCH3 OCH3 O-Tgl OCH3 OH H Benzoylgomisin H OCH3 OCH3 O-Bz OCH3 OH H Gomisin T OCH3 OCH3 OCH3 OH OH H 20 Lignan R1 R2 R3 R4 R5 R6 Gomisin O -OCH2O- OCH3 OCH3 H OH Gomisin R -OCH2O- -OCH2O- H OH Benzoylgomisin R -OCH2O- -OCH2O- H O-Bz Epigomisin O -OCH2O- OCH3 OCH3 OH H Angeloylgomisin O -OCH2O- OCH3 OCH3 H O-Ang Angeloylisogomisin O OCH3 OCH3 -OCH2O- H O-Ang Benzolyisogomisin O OCH3 OCH3 -OCH2O- H O-Bz Lignan R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Gomisin B -OCH2O- OCH3 OCH3 H O-Ang OH CH3 Gomisin C -OCH2O- OCH3 OCH3 H O-Bz OH CH3 Gomisin F OCH3 OCH3 -OCH2O- H O-Ang OH CH3 Gomisin G OCH3 OCH3 -OCH2O- H O-Bz OH CH3 Angeloylgomisin Q OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H O-Ang OH CH3 Angeloylgomisin P -OCH2O- OCH3 OCH3 O-Ang H CH3 OH Tigloylgomisin P -OCH2O- OCH3 OCH3 O-Tgl H CH3 OH Gomisin S OH OCH3 OCH3 OCH3 OH H CH3 H Schizantherin D -OCH2O- -OCH2O- H O-Bz OH CH3 21 Lignan R1 R2 Gomisin D OH CH3 Gomisin E CH3 H Lignan R Pregomisin OH Meso-dihydroguajaretová kyselina H Obr. 7.: Vzorce lignanů S. chinensis, Ang- angeloyl, Bz-benzoyl, Tgl-tigloyl 40 Do studia a izolace lignanů v šedesátých a sedmdesátých letech minulého století bylo zapojeno několik nezávislých týmů ­ ruský, japonský a čínský. Následkem toho mají některé sloučeniny více synonym. Jména lignanů byla většinou odvozena podle jména drogy v originálním jazyce. Podle týmu vedeného prof. Ikeyou jsou nazývány ,, Hoku-gomishi" nebo ,,Kita-gomishi" v japonštině (např. gomisin) a ,,Wu-wei-zi" např. (wuweizisu C). 39 První lignan S. chinensis schizandrin byl izolován v roce 1961 Kočetkovem ze semen. 46 22 1.5.2 Obsah lignanů v rostlinných orgánech V odborné literatuře se setkáváme s rozdílnými informacemi o obsahu lignanů v S. chinensis. První údaje o množství lignanů podali ruští autoři na základě použití TLC nebo pomocí málo specifických fotometrických metod. Samoljenko a Sprunov nalezli nejvyšší obsah lignanů ve stoncích 5 %, v kořenech 4 % a zralých plodech 3 %. 42 Naopak čínští autoři uvádějí obsah lignanů v semenech stanovený metodou HPLC kolem 18 ­ 19 % a ve stoncích 10 %. Najikama et al. zjistili, že plody obsahují přibližně 2 % lignanů. 43 V plodech rostlin z Jižní Koreje nebo Číny byly stanoveny jako hlavní lignany schizandrin a gomisin A. Ve vzorcích S. chinensis pocházejících z japonské provenience byl majoritní vedle schizandrinu též deoxyschizandrin. Majoritní lignany (schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, -schizandrin, gomisin N, wuweizisu C) jsou obvykle získávány z plodů rostlin importovaných z Číny. Plody z Japonska a Koreje obsahují především schizandrin, gomisin A, gomisiny B a C, gomisin K3, deoxyschizandrin, -schizandrin, wuweizisu C. 6 V následující tabulce Tab. 1 je uveden přehled synonym lignanů. 23 Tab. 1.: Přehled hlavních lignanů a některých minoritních lignanů S. chinensis (Turcz.) Baill a jejich synonym Lignan Synonymum Izolace Schizandrin schisandrin, schisandrol A, wuweizi alcohol A, wuweizichun A Ikeya et al. 44 , Kochetkov et al. 45 , 46 Chen et al. 47 Gomisin A schisandrol B, wuweizi alcohol B, wuweizichun B Ikeya et al. 44 Deoxyschisandrin dezoxyschizandrin, schizandrin A, wuweizisu A, dimethylgomisin J Kochetkov et al. 48 , Ikeya et al. 49 ()--Schizandrin schizandrin B, deoxygomisin A, wuweizisu B Kochetkov et al. 45 , 48 Gomisin N Ikeya et al. 50 Wuweizisu C schizandrin C Chenet al. 47 , Ikeya et al. 51 Isoschizandrin Ikeya et al. 19 Gomisin B schisantherin B, schizandrer B, wuweizi ester B Ikeya et al. 44 Gomisin C schisantherin A, schizandrer A, wuweizi ester A Ikeya et al. 44 Gomisin D Ikeya et al. 52 Gomisin E Ikeya et al. 49 Gomisin F Ikeya et al. 44 Gomisin G Ikeya et al. 44 Gomisin H norschizandrin Ikeya et al. 53 Angeloylgomisin H Ikeya et al. 53 Benzoylgomisin H Ikeya et al. 53 Tigloylgomisin H Ikeya et al. 53 Gomisin J Ikeya et al. 38 Gomisin K1 Ikeya et al. 54 Gomisin K2 Ikeya et al. 54 (+)-Gomisin K3 schisanhenol, schizantherol Ikeya et al. 54 Gomisin L1 Ikeya et al. 55 Gomisin L2 Ikeya et al. 55 Gomisin M1 Ikeya et al. 55 Gomisin M2 Ikeya et al. 55 Gomisin O Ikeya et al. 49 Angeloylgomisin O Ikeya et al. 28 Angeloylisogomisin O Ikeya et al. 28 Benzoylgomisin O Ikeya et al. 28 Benzoylisogomisin O Ikeya et al. 28 Epigomisin O Ikeya et al. 49 Angeloylgomisin P schisantherin C Ikeya et al. 56 Tigloylgomisin P Ikeya et al. 56 Angeloylgomisin Q Ikeya et al. 67 Gomisin R Ikeya et al. 51 Gomisin S Ikeya et al. 58 Gomisin T Ikeya et al. 58 Schisantherin D Ikeya et al. 51 Pregomisin Ikeya et al. 38 24 1.6. Biologická aktivita Literatura udává dva typy odborných článků o biologické aktivitě S. chinensis. Existuje velké množství publikací zabývající se účinkem plodů schizandry, zejména pak jejich lihových extraktů. Dále existuje velké množství článků, které se zabývají přímo biologickou aktivitou jednotlivých vyizolovaných lignanů. Z tohoto důvodu jsem se rozhodla biologickou aktivitu S. chinensis v teoretické části rozdělit do dvou částí nazvaných: Biologická aktivita plodů S. chinensis a biologická aktivita lignanů S. chinensis. 1.6.1 Biologická aktivita plodů S. chinensis Plody schizandry jsou součástí mnoha polykomponentních přípravků tradiční čínské medicíny. Nejznámějším přípravkem obsahujícím extrakt ze schizandry je Sheng Mai San. Je to polykomponentní přípravek tradiční čínské medicíny, obsahuje rostliny Panax ginseng, Schisandra chinensis, Ophiopogon japonicus. Sheng Mai San je používaný při vyčerpání organismu, ztrátě tělesné energie, především u pacientů s ischemickou chorobou srdeční. 59 Myoprotektivní působení plodů S. chinensis bylo potvrzeno na srdci potkanů, u něhož bylo navozeno ischemické poškození. 60 Antioxidační účinky extraktu byly srovnatelné s účinkem stejné dávky účinného antioxidantu -tokoferolu. Ochrana myokardu tímto přípravkem je významně vázána na přítomnost látek s antioxidačním účinkem. Lignany magnolky čínské disponují těmito účinky nejen in vitro, ale i in vivo. 61 Schizandra je také součástí rostlinného přípravku S-113m obsahujícího Panax ginseng, Schisandra chinensis a Biota orientalis. Tento přípravek byl navržen pro zlepšení procesu učení a paměti (byl testován na myších typu SAMP, typ myší které byly náchylné k urychlenému stárnutí). Výsledky testů ukazují, že přípravek může být využit v humánní praxi při ovlivňování fyziologického stárnutí a při deficitech paměti spojených s věkem. 62 Plody S. chinensis jsou spolu s pikolinátem chrómu součástí polykompozitního přípravku (dále ještě obsahuje Lycii fructus, Ophiopogon japonicus), který je doporučován k léčbě zhoršené glukózové tolerance. Po třítýdenním užívání se objevuje výrazné zlepšení orálního glukózového tolerančního testu. 63 Plody jsou dále součástí přípravku Chisan ADAPT-232, který se skládá ze standardizované směsi extraktů z Rhodiola rosea, Schisandra chinensis a Eleutherococcus senticosus. Tento patentovaný přípravek již prošel závěrečnými klinickými studiemi 25 a používá se s úspěchem jako adjuvant při léčbě akutní nespecifické pneumonie. Svým složením přispívá ke zvýšení kvality života nemocných a k uzdravení. 64 Bylo též popsáno působení extraktu proti Helicobacter pylori. 65 Schisandra chinensis je součástí přípravku ESP-102, standardizovaného extraktu ve složení Angelica gias, Saururus chinensis a Schisandra chinensis. Tento přípravek byl stejně jako S-113m navržen pro zlepšení procesu učení a ke zlepšení paměti. Byl per os (p. o.) podáván myším, u kterých bylo indukováno zhoršení paměti skopolaminem. Léčba tímto přípravkem výrazně snižovala skopolaminem vyvolané výpadky paměti. 66 Samotný vodný extrakt z plodů působil proti amnézii vyvolané cykloheximidem u myší. 67 Magnolka je spolu s dalšími osmi rostlinami součástí korejské medicíny Dae Jo Whan (DJW). Tento přípravek je užíván při léčbě ischemické choroby srdeční. DJW vykazuje antitrombotický efekt inhibicí PAF-faktoru aktivujícího destičky. Tento extrakt by mohl být v budoucnosti využit pro léčbu onemocnění na kterých se podílí PAF. 68 ImmunoGuard je standardní fixní kombinace rostlin Eleuterococcus senticosus, Schisandra chinensis a Glycyrrhiza glabra, u tohoto přípravku byla provedena druhá fáze klinické studie. Bylo prokázáno, že extrakt snížil trvání, četnost a závažnost ataků u FMF pacientů (familiární středozemská zimnice), jejímiž příznaky jsou břišní a hrudní bolesti, teploty, myalgie a artritida. 69 Asi nejvíce je prostudována hepatoprotektivní aktivita plodů S. chinensis. V 70. letech minulého století začaly být plody v Číně intenzivně využívány ke snížení patologicky zvýšených hladin transamináz u pacientů postižených chronickou virovou hepatitidou. Mechanismus snížení hladin transamináz je vysvětlován jako aktivita stabilizující membrány. Může zde existovat útlum aktivity jaterní GST. 70 Ko a spol. prokázáli, že antioxidační aktivita vede ke snížení poškození jaterní tkáně, protože se zde projevuje pozitivní ovlivnění metabolismu glutathionu. 61 Petroletherový extrakt plodů zvyšoval množství glutathionu v hepatocytech potkanů, u kterých bylo navozeno poškození tkáně podáváním tetrachlormethanu. 71 Antihepatotoxický účinek petroletherového extraktu byl podstatně vyšší než při podání stejné koncentrace -tokoferolu. Extrakt plodů zvyšuje kapacitu jaterního antioxidačně detoxikačního systému. To lze pozorovat na zvýšení hladin jaterního GSH, stejně tak na aktivitách glutathionreduktázy a glutathion-S-transferázy. 72 Extrakt z plodů byl podán potkanům, u kterých bylo navozeno poškození jater. Byla sledována rychlost I. oxidativní fáze metabolismu xenobiotik za použití antipyrinu. Bylo zjištěno, že podávání 26 extraktu 30 minut před užitím léčiva (antipyrin) výrazně zrychluje kinetiku léku (zvýšení eliminace léčiva z organismu) v poškozených játrech. 73 Dále bylo prokázáno, že extrakt působí inhibičně na účinek metabolitů halotanu (inhalační anestetikum). 74 A proto o něm lze uvažovat jako o ochranné složce přípravku vůči hepatitidám navozeným některými inhalačními anestetiky. 75 Premedikace myší lignanovou směsí zvyšuje odolnost organismu vůči aflatoxinu B1 a zabraňuje hepatocelulárnímu poškození navozenému kademnatými ionty. 76, 77 U plodů magnolky byly nalezeny antioxidační účinky stejně jako u jiných adaptogenů. Extrakt z plodů podávaný perorálně myším může zvýšit aktivitu SOD v erytrocytech. Řada magnolkových lignanů prokázala nejen útlum lipidové peroxidace v membránách buněk, ale zvyšují také schopnost organismu eliminovat aktivní kyslíkové radikály zvýšením aktivity SOD a katalázy. 12 Je známo, že nadměrná fyzická zátěž zvyšuje obsah oxidu dusnatého a hydrokortisonu v krvi a ve slinách. Při studiu adaptogenního účinku schizandry byl podán extrakt z plodů několika skupinám atletů (boxeři, zápasníci, vzpěrači) v dvojitě zaslepené studii kontrolované placebem. Na počátku testu s atlety zvyšoval extrakt koncentraci NO a hydrokortisonu v krevní plazmě a ve slinách, podobně jako tomu docházelo u atletů s nadměrnou fyzickou zátěží. Tyto výsledky korelovaly se zvýšenou fyzickou výkonností atletů užívajících adaptogen ve srovnání s atlety, kteří dostávali placebo. Naproti tomu po podání adaptogenu nezvýšila nadměrná zátěž koncentraci NO a hydrokortisonu ve slinách u sportovců užívajících adaptogen. U sportovců, kteří dostávali placebo, došlo po nadměrném fyzickém cvičení ke zvýšení koncentrace NO ve slinách. Tyto výsledky ukázaly, že test na koncentraci NO může být použit jak pro hodnocení fyzické zátěže, tak ochranného účinku adaptogenu vůči stresu. 6 V Koreji je již dlouho užíván vodný extrakt z plodů magnolky pro podporu cév, cévního metabolismu u postmenopauzálních žen. Extrakt je zodpovědný za vasorelaxaci. Vasorelaxace je závislá na koncentraci vodného extraktu S. chinensis. Testy byly provedeny na aortě potkana, která byla kontrahována noradrenalinem. Tento poznatek může přispívat k poznání dalších mechanismů kardiovaskulárně-protektivního efektu plodů schizandry. 78 27 1.6.2 Biologická aktivita lignanů S. chinensis * Hepatoprotektivní působení Gomisin A inhibuje experimentálně navozené jaterní poškození, které bylo vyvoláno mikroorganismem Propionibacterium acnes a lipopolysacharidovým endotoxinem. Stabilizuje buněčné membrány jaterního parenchymu, dokonce v případě cytotoxických látek zabraňuje uvolňování jaterních adherentních buněk, stabilizuje membránu jaterních parenchymálních buněk v přítomnosti cytotoxických látek. Zdá se, že může inhibovat akutní jaterní selhání. 11 Tento lignan zabraňuje tkáňovým změnám, jako je degenerace a nekróza hepatocytů, zánětlivá buněčná infiltrace a nadměrné ukládání lipidů. Gomisin A je hepatoprotektivum s antitoxickými a antihyperlipidemickými (snižuje podíl triglyceridů) vlastnostmi, usnadňující jaterní syntézu proteinů. 24 Gomisin A stimuluje regeneraci jater po částečné hepatektomii zvýšením aktivity protoonkogenu c-myc a ornitindekarboxylázy, což jsou významné znaky časných stadií jaterní regenerace. 79 Významně inhibuje výskyt ložiskových změn pro placentární gluthathion-S-transferázu v játrech potkanů, kterým byl podáván hepatokarcinogenní 3´-methyl-4-dimethylaminobenzen. Lignan snížil koncentraci azobarviva v játrech a zvýšil jeho vylučování žlučí. 80 Gomisin A má velmi pozitivní vliv na celkovou funkci jater. Po perorálním podání se zvyšuje odtok žluči, koncentrace žlučových kyselin je v ní však snížena a zvyšuje se průtok krve játry. 81 Hepatoprotektivita schizandrinu B je spojena se zvýšením redoxního stavu jaterního gluthationu jak v cytosolu, tak v mitochondriích, a zvýšením aktivity mikrosomální GST. Ochranný účinek schizandrinu B byl větší než u běžných antioxidantů, u kterých je polarita blízká lignanům (-tokoferol, BHT). Schizandrin B na rozdíl od tokoferolu nevykazuje prooxidační vlastnosti. Methylendioxidová skupina na dibenzocyklootadionovém kruhu u schizandrinu B je důležitá v jeho schopnosti zvýšit mitochondriální GSH. Podávání schizandrinu B p. o. potkanům v dávce 1 mmol/kg chrání proti menadionem (syntetický analog vitamínu K3) vyvolanému jaternímu poškození. Prokazatelně klesají hodnoty jaterních transamináz. 82, 83 Syntetický analog schizandrinu ­ DDB (dimethyl-4,4´-dimethoxy-5,6,5´,6´dimethylendioxybifenyl-2,2´-dikarboxylát) je nejaktivnější látkou z dibenzocyklooktadienových lignanů z hlediska hepatoprotektivních účinků. V současné době je v Číně široce používané hepatoprotektivum. Snižuje hladinu jaterních transamináz. Mechanismus snížení hladin transamináz je vysvětlován jako aktivita stabilizující membrány, 28 ačkoliv zde může snižovat i aktivitu jaterních GST. Působí též ochranně proti jaternímu poškození způsobenému aflatoxinem b1. 70 Lignany S. chinensis gomisin B, C, G a N a -schizandrin vykazují inhibiční efekt na N-demethylační aktivitu zprostředkovanou cytochromem P-450 3A4. Mezi těmito sloučeninami vykazuje gomisin C potenciálně největší inhibiční efekt, silnější než známý inhibitor CYP3A4 ketokonazol. Gomisin C mimo jiné inhibuje též cytochromy CYP1A2 a CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6. Nedávné studie naznačují, že gomisin C je nejenom kompetetivní inhibitor CYP3A4, ale též jej ireverzibilně inaktivuje. 84 * Antioxidační účinky Z pokusů in vitro vyplynulo, že antioxidační účinek je především spojen se zamezením lipoperoxidace. Lignany byly sledovány z hlediska antioxidační aktivity (schopnost inhibice Fe3+ /cysteinem indukované lipidové peroxidace) a zdá se, že jsou účinnější než -tokoferol. Nejvýraznější antioxidační účinek vykázal gomisin K3. 12 Gomisin K3 vykazoval též cytoprotektivní účinek proti poškození mitochondrií potkaního srdce způsobené cytostatikem adriamycinem. Klinické použití tohoto cytostatika je právě omezeno jeho kardiotoxicitou. 85 Lignany byly též podrobeny pokusu, kde byla sledována antiradikálová aktivita schizandrolu A a schizandrolu B na reaktivní kyslíkové radikály produkované lidskými polymorfonukleárními leukocyty, na hydroxylové radikály a superoxidové anionty a tato aktivita byla porovnávána s dvěma nejznámějšími antioxidanty ­ vitamínem C a E. Obě látky měly větší vliv na hydroxylové radikály než zmíněné vitamíny C a E, v případě superoxidových aniontů byla jejich aktivita vyšší než u vitamínu E, ale nižší než u vitamínu C. 86 Existují studie o tom, že antiradikálová aktivita je v případě kyslíkových radikálů závislá na konfiguraci bifenylů, lignany s S-konfigurací mají tuto aktivitu vyšší než tytéž lignany s R-konfigurací. 87 Lignany prokázaly antioxidační aktivitu v myoblastických buňkách (C2C12) in vitro. Dva lignany obsahující fenolické skupiny gomisin J a GR-12 (GR-12 je lignan podobné struktury, nepochází však ze schizandry) předcházely peroxidem indukované smrti buněk. V pokusu byla též použita jednoduchá sloučenina 4-,4´-dihydroxybifenyl, která je složkou gomisinu J, tato sloučenina byla také účinná v ochraně před peroxidem vodíku indukované apoptózy. Mechanismus této ochrany in vitro může vést k objasnění molekulárních mechanismů antioxidačního působení lignanů. 88 29 * Antineoplastický efekt Byl zkoumán efekt deoxyschizandrinu, schizandrinu-B, schizandrinu C, gomisinu A, B ,C a syntetického analogu schizandrinu ­ DDB u samic potkana na jaterní mikrozomální monooxigenázu in vitro. Mezi těmito lignany schizandrin B, schizandrin C, gomisin A a BDD výrazně zvyšovaly koncentraci jaterního cytochromu P-450, NADPH-cytochrom-c-reduktázy a demethylační aktivity. Tímto mechanismem mají schopnost zvýšit aktivitu dalších detoxikačních enzymů, dále jsou schopny zvýšit proliferaci endoplasmatického retikula v hepatocytech a urychlit regeneraci jater. Ovšem, je známo, že methylendioxy skupina lignanů je schopna se ireversibilně vázat na cytochrom P-450 a tím pak může dojít ke zpomalení tvorby reaktivních produktů, vznikajících při metabolismu hepatotoxinů. 16 Gomisin A inhibuje karcinogenezi navozenou 12-(0)-tetradekanoylforbol acetátem a 7,12-dimethylbenz[a]antracenem. Gomisin A, gomisin J, wuweizisu C pokud jsou aplikovány na kůži tlumí schopnost rakovinotvorného 12-(0)-tetradekanoylforbol-13-acetátu vyvolávat zánět, vývoj a tvorbu kožních tumorů. Předpokládá se, že zabránění růstu nádorů gomisinem A přímo souvisí s jeho protizánětlivými účinky. Gomisin A snižuje mutagenitu fenobarbitalu a snižuje kovalentní vazbu fenobarbitalových metabolitů na DNA. Perorální podání gomisinu A inhibuje nárůst žlučových kyselin v séru, obzvlášť deoxycholové kyseliny a nárůst preneoplastických lézí navozených 3´-methyl-4-dimethylaminobenzenem. 6 V nedávné době bylo zjištěno, že lignany schizandry vykazovaly antiproliferativní efekt u různých druhů zkoušených nádorových buněk. Metoxy skupina na C-2, C-3, C-12, a C-13, hydroxy skupina na C-7 (Obr. 6) a S konfigurace bifenylu a navázaný angeloyl může mít za následek tento pozitivní antiproliferativní účinek. Dále studie ukázala, že mechanismus pozitivního účinku schizantherinu C u buněk karcinomu jater typu A549 souvisí s inhibicí buněčného cyklu ve fázi G0/G1. 89 * Antiulcerózní působení Isoschizandrin vykázal inhibiční efekt u perorálního podávání na žaludeční vředy způsobené stresem u experimentálních zvířat. Gomisin A způsobil u potkanů inhibici gastrických kontrakcí a stresem indukovaných gastrických ulcerací. Stejně tak působí i schizandrin, u něhož byl navíc shledán inhibiční účinek na žaludeční sekreci. 19 30 * Neurotropní aktivita Na psech bylo zjištěno, že semena v dávce 0,1 ­ 0,5 g/kg způsobila útlum a následně excitaci, dávka 0,5 g/kg způsobuje útlum a dávky kolem 1 g/kg naopak vyvolají silnou excitaci s nespavostí. Tato výrazná neurotropní aktivita byla prokázána u schizandrinu. Ten zpomaluje procesy tvorby podmíněných reflexů. Schisandrol A tlumí činnost CNS. Inhibice způsobená tímto lignanem v CNS se vztahuje k dopaminergnímu systému a zvýšení metabolického obratu dopaminu, nemá přímou souvislost s dopaminovými receptory. 4 Schizandra antagonizuje efekt látek ovlivňující CNS jako jsou barbituráty, halotan, aminazin atd. 90 Aktivující efekt schizandry na CNS byl pozorován pouze za přítomnosti agonisty dopaminových receptorů DA2. Cholinergní systém je též ovlivněn lignany. 91 Schizanheol a schizandrin B byly schopny chránit před peroxidovým poškozením starý a ischemický mozek u potkanů. Kompletně inhibovaly porušení a rozpad mozkových mitochondrií tak dobře, jako redukci fluidity membrán indukovanou Fe3+ /cysteinem. 92 Perorální podávání schizaneolu a schizandrinu B vyvolalo zvýšení cytosolové glutathionperoxidázy mozku. Schizandrin p. o. 5 ­ 10 mg denně zlepšuje mozkové aktivity jako koncentraci, koordinaci, citlivost a vytrvalost. 93 * Inhibitor P-glykoproteinu Výzkumy z posledních dvou let přinesly zjištění, že -schizandrin se ukázal být účinným inhibitorem P-glykoproteinu, který zapříčiňuje vznik rezistence na cytostatika. Rezistence na cytostatika ­ ,,cancer multidrug resistance" (MDR) je jednou z nejčastějších překážek, která brzdí úspěšnou chemoterapii. Zvýšená exprese P-glykoproteinu patří mezi nejčastější příčiny původní i získané MDR. P-glykoprotein je ATP-dependentní transmembránový přenašeč, který velmi efektivně převádí intracelulární léčiva do extracelulárního prostoru a udržuje subletální intracelulární koncentraci použitých cytostatik. Tyto cytostatika jsou pak v nižší koncentraci v buňce neúčinná. 94 P-glykoprotein má široké spektrum substrátové specifity ­ anthracykliny, epipodofylotoxiny, taxany, vinca alkaloidy a jiné. Jedna z efektivních cest, jak překonat rezistenci na cytostatika, je blokovat tzv. " pumpovaní" cytostatika ven z buňky. Jako první známý inhibitor P-glykoproteinu byl objeven verapamil (blokátor kalciového kanálu). Schizandrin A a B a schizantherin z pěti testovaných lignanů vykazovaly schopnost blokovat P-glykoprotein. Přídavek těchto látek byl schopen udržet hladiny paklitaxelu a vinkristinu v buňkách buněčných linií s vyvolanou MDR rezistencí. -schizandrin a jeho analogy 31 s nízkou toxicitou a malým množstvím nežádoucích účinků mohou reprezentovat zcela novou třídu inhibitorů P-glykoproteinu. 95 Gomisin A je lignan, u kterého byla prokázaná slabá aktivita ve schopnosti samostatně inhibovat P-glykoprotein. Předpokládá se, že gomisin A pozměňuje substrátové interakce, ale sám se nemění a na rozdíl od substrátových inhibitorů, gomisin A inhibuje ATP-ázu. Závěrem Chi-Keung a spol. konstatovali, že gomisin A se může na P-glykoprotein vázat současně se substráty a pozměňovat P-glykoprotein substrátové interakce. Díky svojí nízké toxicitě se může řadit k potenciálním slibným inhibitorům P-glykoproteinu. 96 Stejná aktivita byla posléze zjištěna i u schizandrinu, který zabraňuje rezistenci na cytostatika ovlivněním P-glykoproteinových substrátových komplexů. 97 * Vliv na PAF Pregomisin a chamigrenal izolované z plodů S. chinensis vykazovaly antagonistickou aktivitu vůči PAF. 98 PAF má schopnost vyvolat vznik trombů, ale též hraje roli v dalších patologických procesech, mimo jiné vzniku astmatu a žaludečních vředů. Byl sledován vztah struktury a účinku lignanů a jejich derivátů jako antagonistů PAF. Silnou aktivitu vykázaly látky bez esterové skupiny na C-6 a hydroxylu na C-7 nebo též methylendioxidového seskupení ­ s konfigurací bifenylu R. Schizandroly A, B, C vykazovaly antagonistickou aktivitu vzhledem k vazbě PAF na receptory trombocytů králíků. Nejsilnějším antagonistou PAF receptorů se ukázal být schizandrin A. 13 * Aktivita proti viru HIV Chen et. al. zjistili, že gomisin J a jeho halogenované deriváty, zejména deriváty obsahující bróm, jsou potencionální inhibitory replikace viru HIV-1 v submikromolekulárních koncentracích. Halogenované deriváty gomisinu J působily i na AZT rezistentní formu HIV-1 a vykázaly synergický efekt s AZT. Ve srovnání přírodního lignanu gomisinu J s jeho brómovými, chlórovými a jodovými deriváty v pozicích C4 a C9 zvyšují halogenované deriváty inhibiční aktivitu HIV-1 reverzní transkriptázy stejně jako cytoprotektivní účinek. 99 Další dibenzocyklooktadienové lignany schizantherin D a gomisin N působí v buněčné kultuře nakažených buněk H9 proti replikaci viru HIV-1. Gomisin N byl účinnější, než schizantherin D. Výzkum struktury ukázal, že pozice substituentů a typ substituentu na fenolické hydroxylové skupině je důležitější než počet halogenů navázaných na aromatickém jádře. U přírodních cyklooktadienových lignanů pozice a substituce hydroxyskupin má význam pro zvýšení aktivity vůči viru HIV. 100 32 * Vliv na různé enzymové systémy Lignany schizandry jsou také efektivní při ovlivňování diabetických onemocnění, působí jako inhibitory aldosareduktázy. Byl zjišťován vztah struktury a účinku lignanů magnolky na inhibici cAMP-fosfodiesterázy. Inhibici cAMP-fosfodiesterázy a tím schopnost zvýšit intracelulární koncentraci cAMP vykázal především gomisin N a dibenzylbutanové lignany: nordihydroguajaterová kyselina a meso-dihydroguajaterová kyselina. 101 * Metabolismus cholesterolu a lipidů Lignany (gomisiny A, B, J, K3, L2, N, benzoylisogoimisin O, angeloylgomisin H, tigloylgomisin P, schizandrin, wuweizisu C a schizantherin) byly též testovány z hlediska inhibice Acyl-CoA: cholesterol-acyltransferázy (ACAT). Nejaktivnější ze skupiny testovaných látek byl gomisin N. 102 Podávání schizandrinu B p. o. myším v dávkách 0,05 ­ 0,8 g/kg zvýšilo hladinu triglyceridů v plazmě až o dva řády v závislosti na dávce. Při dávce 0,8 g/kg byla snížena hladina LDL. Podávání těchto dávek schizandrinu B p. o. myším může být využito i k modelovému navození akutní hypertriglycerolemie. 14 * Protizánětlivý účinek Magnolkové lignany mají schopnost inhibovat v terapeuticky využitelných dávkách 5-lipooxygenázu (5-LOX) a působit tak protizánětlivě. Gomisin A byl testován z hlediska zásahu do kaskády arachidonové kyseliny. Výsledky ukázaly, že gomisin A inhiboval biosyntézu leukotrienů zamezením uvolňování arachidonové kyseliny. Tento efekt na metabolickou kaskádu arachidonové kyseliny může být částečně spojen s inhibičním efektem látky na jaterní poškození. 18 * Antihypertenzní aktivita Gomisiny N, J, H a G účinkovaly jako antagonisté vápníkového kanálu typu L u prasat a mohly by tak mít potenciální schopnost snižovat patologicky zvýšený krevní tlak. 17 * Ovlivnění pokožky Při testech fotosenzitivity a fotoprotektivity za využití fotochemiluminiscenčního testu lignany Schisandra chinensis působily jako protektory v nízkých koncentracích a ve vysokých koncentracích jako stabilizéry. 6 33 * Anthelmentické a insekticidní účinky Extrakt z plodů, připravený horkou vodou, má anthelmentický účinek na Clonorchis chinensis. 103 Gomisin B a N vykazují insekticidní aktivitu vůči hmyzu Drosophila melanogaster. Gomisin N a wuweizisu C, které jsou inhibitory chitinsyntázy II, mají také slabý antifungální účinek. 104 1.6.3. Metabolismus, toxicita a kontraindikace obsahových látek S. chinensis Metabolismus lignanů byl zatím popsán jen u některých zástupců těchto sekundárních metabolitů např. schizandrinu nebo gomisinu A. Nui a spol. sledovali metabolickou transformaci schizandrinu in vitro pomocí mikrozomální frakce (indukované fenobarbitalem) obsahující enzymový systém generující NADPH. Byla taktéž zjištěna metabolická biotransformace látky in vivo. Na zdravých dobrovolnících bylo prokázáno, že po příjmu 15 mg schizandrinu p. o. byla nejvyšší koncentrace schizandrinu v plazmě za 15 ­ 30 minut a v moči za hodinu. 105 U potkanů bylo v žluči identifikováno 7 metabolitů schizandrinu a u psů dokonce 14 metabolitů. Při p. o. a i. v. podání u myší byl stanoven obsah schizandrinu v plicích, v játrech, srdci a mozku. V mozku bylo nejvyšší množství zjištěno v hypotalamu, v corpus striatum a hipocampu, naopak nižší hodnoty byly nalezeny v mozkové kůře a mozečku. Tyto rozdíly v obsahu schizandrinu v mozku se pravděpodobně vztahují k neurotropní a antikonvulzivní aktivitě schizandrinu. 106 Během metabolismu schizandrinu dochází k demethylacím jedné nebo dvou methoxyskupin na aromatických jádrech. Z organismu se schizandrin vylučoval ve formě glukuronidů nebo sulfátů. 107 Matsuzaki a spol. zjistili, že sérová koncentrace gomisinu A klesá dvoufázově a poločas vylučování každé dávky je zhruba 70 minut. Ve žluči bylo prokázáno 7 metabolitů gomisinu A, v moči 8. Více než 80 % látky je u potkana vázáno na sérové proteiny. Toto zjištění se zdá být důležité v případě, že je současně podáváno léčivo s vysokou afinitou k sérovým proteinům. 11 Akutní toxicita sušeného extraktu S. chinensis 4 : 1, standardizovaného na koncentraci 2% schizandrinu u potkanů je nízká (LD50 > 21 g/kg, p. o.). Dávka 5 g/kg po p. o. podání myším nevyvolává letální efekt. Orální a intravenózní LD50 petroletherového extraktu plodů S. chinensis (s obsahem 10 % schizandrinu) byly 10,5 a 4,4 g/kg. Pokud se myším podá p. o. petroletherový extrakt standardizovaný na 40 % schizandrinu je LD50 výrazně nižší 34 a to 2,8 g/kg. Ethanolový extrakt podávaný p. o. myším v dávkách 0,6 až 1,2 g/kg po 10 dní vykazuje jen střední toxické účinky, jako je pokles aktivity, zježení chlupů, apatii a vzestup celkové tělesné hmotnosti. Naopak krevní obraz a činnost hlavních orgánů nejsou změněny. Schizandrin B byl podáván laboratorním potkanům p. o. v dávce 2 g/kg a nebylo zaznamenáno žádné úmrtí. Při dávkování 200 mg/den po dobu 30 dnů nebyl zpozorován žádný výrazný váhový úbytek, též nebyly zaznamenány ani jiné krevní a histologické změny. 93 Celá droga je kontraindikována při zvýšené nervové dráždivosti, zvýšené aktivitě CNS s nespavostí, hypertenzi (zejména při těžších formách), epilepsii, časném stadiu kašle s nachlazením, poruchách srdce a peptickém vředu. V těhotenství je nutný dozor a souhlas lékaře. 1 1.7. Tkáňové kultury, růstové regulátory a elicitace * Kultury Rostlinné kultury řadíme podle stupně organizace a diferenciace do následujících kategorií: orgánové kultury, kalusové kultury, buněčné kultury a protoplastové kultury. Dále je možno dělit kultury na suspenzní a statické. Suspenzní kultury navíc vyžadují zařízení na míchání a provzdušňování média. 108 Růst kultur je většinou indukován umístěním explantátů na médium s relativně vysokou koncentrací auxinu (1 ­ 10 mg/l) v přítomnosti nižší koncentrace cytokininu. Při odběru rostlinných částí je také významná roční doba a roli zde hrají hladiny endogenních fytohormonů v rostlinách. Využití explantátových kultur in vitro v průmyslové produkci sekundárních metabolitů je široké. Umožňuje jednak množení rostlin významných pro své sekundární metabolity, dále selekci kultivarů s vysokou produkcí sekundárních metabolitů nebo produkci sekundárních metabolitů samotnými tkáňovými kulturami. 109 Nevýhodou rostoucí kalusové kultury je závislost na exogenně dodávaném auxinu a cytokininu neboť nejsou schopny je samy syntetizovat. Velkokapacitní kultivace izolovaných rostlinných buněk, pletiv i orgánů s cílem produkce farmakologicky účinných látek v současnosti umožňuje získávat medicínsky významné látky (některá cytostatika, chemoterapeutika apod.). Využívá se též elicitací, které jsou ekonomicky výhodnou metodou a je při ní využito ochranných mechanizmů rostlin ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů. Pasážová kultura je potenciálně nesmrtelná, 35 ale postupně se cytogeneticky mění. Obvykle v ní vzrůstá podíl polyploidních a aneuploidních buňek. 110 * Růstové regulátory Koordinace růstových procesů v rostlinách není možná bez dokonalého řídícího mechanismu, v němž hlavní úlohu hrají rostlinné hormony (fytohormony). Existuje pět základních skupin fytohormonů: auxiny, cytokininy, giberliny, kyselina abscisová a ethylén. Dále pak existuje několik skupin látek s regulační aktivitou, které jsou fytohormonům podobné: jasmonáty, polyaminy, oligosacharidy a některé fenolické sloučeniny. Každý fytohormon může působit na buňky v různých orgánech a výsledek tohoto působení může být velmi nejednotný, je totiž závislý na vývojovém stavu. Přesto lze každé skupině přiřadit celou řadu společných účinků. 111 Auxiny: Patří mezi ně nativní kys. indolyloctová (IAA) a syntetické kyseliny indolylmáselná (IBA) a dichlorfenoxyoctová (2,4-D) a další. Přítomnost auxinu v kultivačním médiu je nutná pro indukci kalusu. Nejlépe v tomto směru působí 2,4-D, která vyvolává tvorbu kalusu i u těch explantátů, u kterých jsou ostatní růstové regulátory neúčinné. U mnoha druhů je pro indukci kalusu a především pro jeho dlouhodobější kultivaci nezbytná kombinace auxinu s cytokininy. 112 Cytokininy: Jejich hlavní účinek na dělení buněk je zřejmě způsoben stimulací tvorby proteinů a podmíněn přítomností auxinu. Koordinace působení cytokininů s auxiny je zřejmá nejen při již zmíněném dělení buněk, ale hlavně při jejich diferenciaci. 111 Mezi cytokininy patří benzylaminopurin (BAP), 6-dimethylaminopurin (IPA), furfurylaminopurin (kinetin). Kinetin a BAP jsou syntetického původu. Používají se ke stimulaci buněčného dělení. Morfogenetická reakce v explantátové kultuře je značně závislá na vzájemném poměru auxinu a cytokininu v médiu. Iniciace tvorby kořenů, kalusu a embryogeneze je stimulována, je-li poměr auxinu k cytokininu vysoký. 109 Jasmonáty: Patří mezi ně kyselina jasmonová (JA) a její methylester. Jejich koncentrace se v rostlině zvyšuje působením vnějších vlivů, jako je poranění, mechanický tlak, rostlinné patogeny a osmotický stres. JA inhibuje některé růstové procesy a je důležitou signální látkou chránící rostlinu před útokem patogenu. Nejdéle známý účinek jasmonátu je urychlení stárnutí listových segmentů a růstově inhibiční vlastnosti. Působí jako signál na patogeny, nebo jejich elicitory a na poranění. Ve všech případech stoupá po působení těchto faktorů endogenní obsah JA a methyljasmonátu, které se šíří rostlinou, nesou informaci o působení vnějšího faktoru a zprostředkovávají reakci rostliny na něj. 113 36 Polyaminy: Jde o jednoduché organické sloučeniny s více aminoskupinami v molekule. V rostlinách se nejčastěji vyskytuje putrescin, spermidin a spermin. Hrají významnou úlohu v obraně rostlin proti stresům. Je to dáno hlavně jejich ochranným účinkem na membrány a na DNA. Jsou schopny stabilizovat buněčné pH a zvyšují vnitrobuněčnou osmolaritu. 112 * Elicitace Elicitace je metoda využívající působení elicitoru na rostliny. Elicitor je substance, která v rostlině působí stres. Tímto signálem je aktivován obranný mechanismus, kterým je zvýšena hladina sekundárních metabolitů. Především jde o jejich syntézu, nikoli o elicitorem indukované uvolnění. Tvorba sekundárních metabolitů po působení elicitoru se vyskytuje především v buňkách, které se nacházejí na konci růstové fáze, jejich tvorba probíhá v buňkách suspendovaných v růstovém médiu i v kalusu. Sekundární metabolity se nacházejí v buňkách i v médiu. Výhodou elicitace je, že ji můžeme opakovat, aniž by došlo k poškození kultury. 109 Elicitory biologického původu jsou sloučeniny, které působí jako aktivátory enzymů v pletivech rostlin. Používá se komplexních inaktivovaných kultur mikroorganismů ­ bakterií a hub. Ty po přidání působí jako stresový faktor, např. Agrobacterium tumefaciens nebo kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Jasmonáty jsou signálními molekulami a v rostlinné buňce zprostředkovávají odpověď na stres. V případě jejich exogenní aplikace mohou působit též jako elicitor. 110 V některých případech může nastat elicitace nedostatkem dusíku. Při nedostatku dusíku dochází k úbytku bílkovin a chlorofylu. Tím dochází ke zpomalení fotosyntézy a růstu. Dále jako abiotické elicitory mohou působit změny osmotického potenciálu, změny pH, UV záření, chlad a jiné. 114 37 2. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE 1. Izolace lignanů Schisandra chinensis. 2. Optimalizovat metodu extrakce a kvantitativního stanovení lignanů Schisandra chinensis za použití extrakce na pevnou fázi (SPE) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). 3. Analyzovat obsah lignanů ve vzorcích tkáňových kultur Schisandra chinensis. 4. Analyzovat obsah lignanů ve vzorcích tkáňových kultur Schisandra chinensis s přídavkem rostlinných hormonů auxinu, polyaminů a s přídavkem adsorbentů polymerních pryskyřic s cílem sledovat a vyhodnotit, zda tímto zásahem byla produkce těchto sekundárních metabolitů pozitivně ovlivněna. 38 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Přístroje, chemikálie, rostlinný materiál a tkáňové kultury 3.1.1 Přístroje Kapalinový chromatograf analytická sestava: pumpa LCP 4000 (Ecom s.r.o., ČR), dávkovač se smyčkou 20 l, model Sample injector D, Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm (Merck, Darmstadt, Německo), UV detektor LCD 2040 (Ecom s.r.o., ČR), předkolona SecurityGuard TM (Phenomenex, USA), kolona 40 (Laboratorní přístroje Praha, ČR), počítač s mikroprocesorem Intel Pentium /R/ 4 CPU, Clarity (Dataapex Praha, ČR), Kapalinový chromatograf semipreparativní sestava: pumpa LCP 4100 (Ecom s.r.o., ČR), dávkovač se smyčkou 5000 l, kolona Separon TM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm (Tessek Ltd, Praha, ČR), byla též používána kolona Separon SGX C 18 10m, 250 x 25 mm, (Tessek Ltd, Praha, ČR), UV detektor LCD 2040 (Laboratorní přístroje Praha, ČR), počítač s mikroprocesorem Intel Pentium /R/ 4 CPU, Clarity (Dataapex Praha, ČR), Měření spekter a absorbancí bylo provedeno pomocí spektrofotometru Shimadzu UV-1601 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonsko) řízeného softwarem UVPC (Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Riverwood Drive, USA) v křemenné kyvetě optické délky 1 cm nebo v jednorázových plastových kyvetách Plastibrand o objemu 1,5 ml určených i pro měření v UV oblasti. Všechny použité roztoky byly temperovány na 25 °C. Kyvetový prostor byl udržován na teplotě (25,0 0,1) °C pomocí temperovanéno ovladače pozic kyvet CPS-240A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonsko). K odplyňování roztoků byla používána ultrazvuková lázeň firmy Powersonic, typ PS02000A. Vzorky a rostlinný materiál byly váženy na laboratorních vahách Sartorius typ R1609 (Gotingen, Německo). 39 NMR spektra lignanů byla změřena v Národním centru pro výzkum biomolekul, Přírodovědecké fakulty, MU v Brně. S využitím NMR spektrometru Bruker DRX 500 (prac. frekvence pro 1 H 500,13 MHz, pro 13 C 125,7 MHz), měřící sonda QNP 5 mm; a NMR spektrometru Bruker AVANCE 300 (300,13 MHz resp. 75,48 MHz), sonda QNP 1 H/ 13 C 5 mm s gradienty magnetického pole v ose Z. 3.1.2 Chemikálie * Amberlite XAD-2 (Sigma-Aldrich, USA, katalogové číslo 10357) * Amberlite XAD-7 (Sigma-Aldrich, USA, katalogové číslo 13361-U) * Aceton p. a. (ML Chemica, ČR) * Acetonitril HPLC ultra gradient grade (J. T. Barker, katalogové číslo 75-05-8) * Methanol p. a. (Lachema, Brno, ČR katalogové číslo 67561) * Ethylacetát p. a. (Lachema, Brno, ČR) * Methanol HPLC gradient grade (Fluka-Chemika, SIGMA katalogové číslo F65548) * Chloroform p. a. (ML Chemica, ČR, katalogové číslo 67663) * Schizandrin, gomisin A, gomisin N a wuweizisu C (lignany vyizolovány z listů a semen Schisandra chinensis na Biochemickém ústavu Lékařské fakulty v Brně) Materiál pro SPE extrakci a sloupcovou chromatografii: Pro SPE extrakci byl použit přístroj SPE 12-Position Vacuume Manifold Set-Complete Ea, (Phenomenex, USA). Na SPE extrakci byly použity kolonky Strata C18-E 100 mg/ml (55 m, 70 A), (Phenomenex, USA). Pro kolonovou chromatografii byly použity sorbenty: Silikagel (Lachema) o zrnitosti 40­100 m a 100­400 m, Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko), alkylovaný silikagel Separon TM SX C18 (Tessek, Praha) o zrnitosti 60 m. 40 3.1.3 Rostlinný materiál a tkáňové kultury S. chinensis Semena a plody S. chinensis byly získány z více zdrojů. Lignany (schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, gomisin N, wuweizisu C) byly izolovány ze semen S. chinensis, které byly dovezeny firmou Herbaton s.r.o. (Klov, Slovensko) z Vladivostoku v roce 1992. Další semena a plody, listy a stonky pro kvantitativní stanovení lignanů pocházely z rostliny pěstované ve Středisku léčivých rostlin, Lékařské fakulty, Masarykovy univerzity v Brně, sběr sezóna 1993, 2004 a 2005. Kultury byly kultivovány na Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně pod vedením Ing. Heleny Vlašinové, Ph.D. Semena byla zpracována na MZLU na Murashige and Skoog médiu (1962, MS) s derivátem přírodních cytokininů 0,005 M thidiazuronem (TDZ). Následně byla zygotická embrya kultivována na médiu WV5 (Duchefa, Haarlem, Nizozemsko) se syntetickým auxinem 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinou (2,4-D), nebo byly přidány přírodní elicitory polyaminy putrescin, spermin a spermidin v koncentracích (od 250 ­ 750 mg/l) 112 Na MZLU byly k pokusům použity zejména tyto kultury S. chinensis: LA58 ­ přídavek auxinu 2,4-D, LA4 ­ přídavek auxinu 2,4-D, LA52 ­ 2,4-D, cytokinin TDZ, LAT10 ­ 2,4-D, cytokinin TDZ, LATI ­ 2,4-D, cytokinin TDZ. 3.2. Metody 3.2.1 Kultivace tkáňových kultur S. chinensis Vždy dvě linie kultur o váze (nelyofilizováno) 1,5 g byly kultivovány v 50 ml média. 1,5 g kultury bylo naneseno na speciální raft s propustnou membránou v polyethylenové kultivační nádobě (Magenta GA 7 6 x 6 cm, Sigma-Aldrich, USA), viz. obrázky 8 a 9. Tento raft volně splýval s hladinou média, ve kterém byl volně rozptýlen amberlit v množství 1 g (XAD-2 nebo XAD-7) ve formě malých bílých kuliček. Chemické složení pryskyřic je uvedeno v tabulce Tab. 2. 41 Tab. 2.: Chemické složení polymerních pryskyřic Amberlite XAD-2 a Amberlite XAD-7 Adsorbent Amberlite XAD-2 Amberlite XAD-7 Složení adsorbentu polystyren polyakrylester Polarita adsorbentu nepolární středně polární Obr. 8.: Rozložená soustava pro pěstování kultur S. chinensis. Raft v Petriho misce, (Ing. Helena Vlašinová, Ph.D.) Obr. 9.: Složená soustava pro pěstování kultur, (Ing. Helena Vlašinová, Ph.D.) 42 3.2.2 Extrakce 3.2.2.1 Extrakce vzorku kultury S. chinensis Vzorky byly dosušeny v exsikátoru a zhomogenizovány. Bylo odváženo předem stanovené množství cca 50 mg a přeneseno do Erlenmayerovy baňky o objemu 25 ml. Vzorky S. chinensis byly extrahovány 3 x 5 ml methanolu p. a. po třech, po třech a po šesti hodinách na třepačce (200 ot/min) v termostatu při 45 °C. Všechny tři extrakty byly zfiltrovány do předem odvážené Erlenmayerovy baňky 25 ml, filtrační papír a nálevka byly promyty ještě 2 ml methanolu. Celkové množství 17 ml methanolového extraktu bylo odpařeno na vodní lázni a použito k přípravě pro SPE. 3.2.2.2 Extrakce vzorku amberlitu Amberlity XAD-2 a XAD-7 byly do laboratoře dodávány ve zmrazeném stavu. Byly kvantitativně přeneseny do Soxlethova extraktoru a byly extrahovány kontinuálně methanolem 24 hodin. Extrakt byl odpařen a použit k přípravě pro SPE. 3.2.2.3 Extrakce na tuhou fázi (SPE) Rychlá separace pod vakuem byla provedena na 12ti místném SPE manifóldu s kolonami Strata C18-E (55 m, 70A) 100 mg/ml. Nejprve byly promyty kolonky 1 ml methanolu a 2 ml deionizované vody. Do baňky s odparkem z methanolové extrakce byly přidány 2 ml 10% methanolu. Toto množství proteklo kolonou. Eluát byl zachycen do čisté zkumavky a byl odpařen do sucha v kovovém bloku při 70 °C pod dusíkem. Vzorek odparku byl následně použit pro kontrolu na HPLC (frakce I.), protože vodou se vymyly z kolony především jen látky polárního charakteru. Pak byly přidány do téže Erlenmayerovy baňky 2 ml 40% methanolu. Eluát byl zachycen do čisté zkumavky a odpařen pod dusíkem. Tato frakce byla zanalyzována na HPLC (frakce II.) a lignany se v ní nenacházejí, nacházejí se zde opět polární látky. Dále byly do Erlenmayerovy baňky přidány 2 ml čistého methanolu. Eluát, který protekl kolonou, byl zachycen a odpařen (frakce III). Zde se již nacházely lignany. Kolona byla ještě promyta 2 ml čistého methanolu, eluát byl také jímán a odpařen. Ve čtvrté frakci se nepolární lignany téměř nevyskytují, všechny byly vymyty prvními 2 ml methanolu ve tětím kroku. Aby byl zjištěn obsah lignanů v tkáňových kulturách byla pro analýzu vybrána třetí frakce. Frakce IV. je kontrolní frakce a potvrzuje, že lignany už jsou nejsou eluovány. 43 Média byla do laboratoře dodávána ve zmrazeném stavu. Objem média (20 ml) protekl přes kolonu Strata C18-E. Pak byl proveden postup SPE extrakce viz. výše. Tab. 3.: Přehled frakcí získaných pomocí SPE Frakce V (ml) % methanol I. 2x1 10 II. 2x1 40 III. 2x1 100 IV. 2x1 100 3.2.3 HPLC stanovení 3.2.3.1 Analýza extraktů, kultur, médií a amberlitů Vzorky byly analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na monolitické reverzně fázové koloně Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm. Jako mobilní fáze byl použit 66% (objemová %) roztok methanolu v deionizované vodě nebo 50% roztok acetonitrilu v deionizované vodě. Detekce byla provedena při vlnové délce 220 nm. Průtok mobilní fáze byl nastaven na 2 ml/min. Příprava vzorku k HPLC analýze: K odparku III. frakce z SPE bylo přidáno 150 l methanolu. Toto množství bylo přeneseno do mikrozkumavek Eppendorf (1,5 ml) a centrifugováno po dobu 2 min při 6000 ot/s. Z tohoto vzorku bylo odebráno 60 l vzorku do mikrozkumavky a bylo smíšeno s 40 l deionizované vody. Z takto připraveného vzorku bylo analyzováno 20 l. 3.2.3.2 Kalibrace Kvantitativní analýza schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu, -schizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C byla provedena optimalizovanou metodou. Kalibrační graf vyjadřoval závislost ploch píků na koncentraci lignanu. Pro všechny lignany byla získána lineární kalibrační závislost (y = a.c + b). Výsledky byly posuzovány metodou lineární regrese s faktorem 1/c2 . Tato metoda byla vybrána, protože poskytuje větší přesnost výsledků u velmi nízkých koncentrací roztoků standardů. Tyto nízké koncentrace se ve stejných řádech objevují i ve zkoumaných vzorcích tkáňových kultur S. chinensis. 44 Zásobní roztoky lignanů byly připraveny ke kvantitativní analýze o koncentraci 1 mg/ml v methanolu. Kalibrace byla provedena roztoky schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu, -schizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C o koncentracích 0,3, 1, 3, 10, 30 g/ml připravenými ze zásobního roztoku 1 mg/ml. Tyto roztoky byly naředěny 80% methanolem. Mobilní fází pro kalibraci byl roztok 50% acetonitrilu, průtok byl nastaven na 2 ml/min a UV detekce 220 nm. Dále byly posuzovány pro tuto metodu regresní faktory jednotlivých lignanů: Základním údajem o rozmývání složek vzorku při transportu kolonou (které se projevuje šířkou píku) je počet teoretických pater kolony N (1), kde Y0.5 je šířka píku v polovině výšky v mm, DR vzdálenost maxima píku od linie nástřiku v mm, tR je eluční čas v sekundách a Ys0.5 je šířka píku v polovině výšky vyjádřená také v časových jednotkách (sekundy). N = 5,545 . (DR/Y0,5)2 = 5,545 . (tr/ Ys0,5)2 (1) Faktor asymetrie As (2), který je vyjádřen jako poměr šířky píku vzestupné (tP) k sestupné části píku (fP) v 10 % výšky píku. Asymetrie píku je nežádoucí, souvisí s účinností kolony a má negativní vliv na integraci píku. As = tp/fp (2) Retenční čas tr (3), tm mrtvý retenční čas, což je retenční čas složky (inertu), která není v koloně zadržována a pohybuje se stejnou rychlostí jako mobilní fáze. tr = t m (1+k) (3) Poměr látkového množství solutu ve stacionární fázi k jejímu látkovému množství ve fázi mobilní udává kapacitní faktor k (4), kde (nA)S a (nA)M jsou látková množství složky A ve stacionární a mobilní fázi, VS a VM jsou objemy stacionární a mobilní fáze. Kd je distribuční konstanta, což je poměr rovnovážných koncentrací této složky [A] ve dvou koexistujících fázích. Kapacitní poměr je tudíž mírou retence solutu v koloně, tzn. čím větší je hodnota k, tím více je solut v koloně zadržován a proto je eluován později. k = (nA)S/ (nA)M = Kd . Vs / Vm (4) 45 Pro hodnocení, jak jsou píky od sebe odděleny, se používá veličiny rozlišení. Rozlišení Rs (5), kde t(r1) a t(r2) jsou retenční časy složek 1, 2 a Y1 a Y2, jež odpovídají šířce píků na úrovni nulové linie (ve stejných jednotkách). Rs = t(r2) ­ t(r1)/ 0,5(Y1+Y2) (5) Citlivost jako směrnice kalibrační křivky, linearita, mez detekce (LOD ­ limit of detection) (6) a mez stanovitelnosti (LOQ ­ limit of quantification) spolu úzce souvisí. Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu. Podle usance se v separačních metodách mez detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie. Spodní mez stanovitelnosti (LLOQ ­lower limit of quantification) je určen jako nejnižší koncentrace kalibračního standardu, který může být stanoven s přesností a variabilitou méně než 20 %. Podle usance se v separačních metodách mez detekce vyjadřuje jako trojnásobek šumu základní linie a mez stanovitelnosti jako desetinásobek šumu základní linie. Hn je šum na základní linii a m je směrnice kalibrační křivky. LOD = 3. hn/m (6) 3.2.4 Izolace obsahových látek Schisandra chinensis Lignany byly izolovány pomocí izolačního postupu, který ve své disertační práci zahájil Mgr. Jiří Slanina, Ph.D., ve kterém bylo extrahováno 354 g semen S. chinensis původem z Vladivostoku. Výsledkem této práce bylo získání lignanů schizandrinu gomisinu A, deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C. Na jejich izolaci byly použity petroletherové frakce a, b, c a benzenová d, e z následujícího izolačního postupu. Úkolem mojí disertační práce bylo získat další lignany a také popřípadě minoritní lignany z dalších frakcí. K tomu byla použita především semipreparativní HPLC. 3.2.4.1 Izolační postup Pomletá semena (349 g) byla extrahována za horka petroletherem v Soxhletově extraktoru po dobu 2 dnů. Oddestilováním petroletheru bylo získáno 122 g tmavě žlutého odparku olejovité konzistence, který byl dále extrahován pětkrát 100 ml a 15krát 50 ml methanolu. Methanolové extrakty byly spojeny a po oddestilování methanolu byl získán žlutý viskózní 46 odparek (47 g), který byl naadsorbován na 90 g silikagelu a chromatografován přes dalších 10 g silikagelu. Petroletherem byly eluovány frakce a (18,8 g), b (4,0 g), c (2,5 g), benzenem frakce d (4,7 g), e (2,8 g), f (2,3 g), g (2,4 g), h (2,0 g), diethyletherem frakce i (7,3 g), j (1,3 g), k (0,3 g) a ethanolem frakce l (0,6 g). Pomocí TLC a HPLC byl ve frakcích analyzován obsah lignanů. Opakovanou chromatografií na sloupci silikagelu bylo z frakcí a, b, získáno 358 mg wuweizisu C s výtěžkem 0,1 % a z frakcí c, d 103 mg gomisinu N s výtěžkem 0,03 %. Frakce d (4,7 g) byla chromatografována na koloně se 100 g silikagelu v systému rozpouštědel s rostoucí polaritou petrolether ­ benzen ­ diethylether. Frakce z eluovaných směsí petrolether ­ benzen a čistým benzenem 1 : 3 byly bohaté na směs -schizandrinu a gomisinu N v poměrech 1 : 2,5 až 1 : 4,2. Krystalizací z těchto frakcí bylo získáno 274 mg gomisinu N. Matečné louhy po krystalizaci obsahovaly směs -schizandrinu a gomisinu N přibližně v poměru 1 : 1, ze kterých se nedařila další krystalizace. Proto byla tato směs dále dělena pomocí semipreparativní HPLC a bylo získáno 62 mg -schizandrinu a další množství gomisinu N. Frakce e (2,8 g) byla chromatografována na koloně s 84 g silikagelu v systému rozpouštědel s rostoucí polaritou benzen ­ diethylether - ethanol. Frakce eluované 2 ­ 4 % diethyletherem v benzenu (celkem 447 g) byly dále děleny pomocí semipreparativní HPLC. Výsledkem semipreparativní HPLC byl zisk 105 mg deoxyschizandrinu. Frakce f, g, h (celkem 6,7 g) byly spojeny a chromatografovány na koloně s 90 g silikagelu v systému rozpouštědel s rostoucí polaritou benzen ­ diethylether ­ ethanol. Frakce eluované 5% diethyletherem v benzenu byly spojeny (2 988 mg) a rozpuštěny v methanolu. Z methanolového roztoku při teplotě ­ 20 °C vykrystalizovalo 338 mg gomisinu A. Frakce eluované 10 ­ 20% diethyletherem v benzenu byly spojeny (2 310 mg) a chromatografovány na koloně se 100 g silikagelu za použití mobilní fáze ethylacetát ­ petrolether. Frakce eluované 45 ­ 50% ethylacetátem v petroletheru byly spojeny a po semipreparativní HPLC bylo získáno 212 mg schizandrinu. 3.2.4.2 Semipreparativní HPLC izolace majoritních lignanů Moje úloha v tomto izolačním postupu spočívala ve vypracovaní semipreparativní metody izolace a následně izolací lignanů touto metodou z frakcí z izolačního postupu, viz. 3.2.4.1. Vzorky byly separovány pomocí semipreparativní HPLC s semipreparativní kolonou Separon TM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm za použití předkolony Separon SGX C18 10 m (8 x 80 mm) a dávkovače se smyčkou 5000 l. 50 mg vzorku bylo rozpuštěno v 1 ml methanolu pak byl přidán 1 ml deionizované vody. Toto množství bylo zfiltrováno přes teflonový filtr Separon TM (Tessek). Takto připravený 47 vzorek byl nanesen pomocí dávkovače s 5 ml smyčkou do HPLC systému, kde mobilní fázi tvořil 65% methanol. Detekce byla provedena při 254 nm a průtok byl nastaven na 2 ml/min. Optická dráha kyvety byla 1,3 ­ 1,4 mm a její objem byl 55 l. Na základě dělení píků byly vzorky jímány zhruba po minutových intervalech do připravených čistých zkumavek. Z každého vzorku bylo kontrolně odebráno 20 l a toto množství bylo současně zanalyzováno na analytické koloně Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm s mobilní fází 68% methanol a průtokem 2 ml/min. Podle výsledků získaných z analytické HPLC byly vzorky stejného složení spojeny dohromady. Frakce byly odpařeny pod dusíkem a případně připraveny ke krystalizaci. Pokud čistota vzorku zjištěná analytickou HPLC nebyla více jak 99,5 %, vzorky se dále dělily na semipreparativním HPLC až do 100% čistoty podle výše uvedeného postupu. Pomocí analytické HPLC byly metodou přístřiku identifikovány jednotlivé lignany. 3.2.4.3 Semipreparativní HPLC izolace minoritních lignanů Při čištění směsí lignanů schizandrinu a gomisinu A byly na chromatogramu viditelné i další píky, které naznačovaly, že směs kromě schizandrinu a gomisinu A obsahuje další látky, s největší pravděpodobností lignany. Jednalo se o minoritní lignany tigloylgomisin H, gomisin J, angeloylgomisin H a tigloylgomisin P, což bylo potvrzeno NMR analýzou. Tyto látky byly zachytávány pomocí semipreparativního HPLC do čistých zkumavek, jejich čistota byla ověřena standardním postupem pomocí metody analytického HPLC. Frakce se stejným složením lignanů byly opět odpařeny. Vzorek (10 mg) z každé vyizolované látky byl poskytnut pro stanovení přesného chemického složení pomocí nukleární magnetické rezonance. 3.2.5 Stanovení adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 a XAD-7 Polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 a XAD-7 by měly mít podle svého chemického složení schopnost vázat na svůj povrch nepolární lignany. Byla sledována teoretická schopnost vázat lignany v závislosti na množství adsorbentu. 48 * Purifikace polymerních pryskyřic K 10 g XAD-7 bylo přidáno 10 ml methanolu. Takto připravená suspenze se třepala na třepačce při 200 ot/min v termostatu při 47 °C. Při této teplotě byl Amberlite XAD-7 zfiltrován a tento postup byl pro úplné vyčištění polymerní pryskyřice od navázaných balastních látek opakován 10krát. Stejný postup byl aplikován i u Amberlite XAD-2. * Stanovení adsorpční schopnosti Amberlite XAD-2 a XAD-7 v závislosti na množství přidané polymerní pryskyřice. 12,5 mg obou typů amberlitu bylo suspendováno v 500 l methanolu. Následně bylo přidáno 500 l deionizované vody. K takto připravenému vzorku bylo přidáno 200 l roztoku lignanů v koncentraci (1 mg/ml), který byl 20krát zředěn 60% methanolem. Pokles absorbance byl měřen v pravidelných časových intervalech při vlnové délce 220 nm. Mezi měřením byly vzorky umístěny v třepačce při 200 ot/min v termostatu při 25 °C. V druhém případě byla dávka polymerní pryskyřice snížena na polovinu (6,25 mg) ve snaze zjistit, zda postačí poloviční množství k navázání celkového množství lignanu jak tomu bylo u většiny testovaných lignanů v předchozím případě s množstvím amberlitu 12,5 mg. Postup spektrofotometrického stanovení byl proveden stejným způsobem jako u předchozího stanovení. 49 4. VÝSLEDKY 4.1. Izolace obsahových látek Schisandra chinensis 4.1.1 Izolace majoritních lignanů Frakce pocházející z izolačního postupu z experimentální části (3.2.4.1), u kterých se nedařila separace na silikagelových kolonách, byly separovány pomocí semipreparativní HPLC, viz. obrázek 10 ­ 15. 50 mg vzorku směsi z frakce f, g, h s obsahem schizandrinu a gomisinu A označené C1 ­ C5, bylo rozpuštěno v 2 ml 65% methanolu a frakcionováno pomocí semipreparativní HPLC. Jako mobilní fáze byl použit 68% methanol. Tyto parametry však nevedly k dobrému rozdělení směsi (Obr. 10) Následovalo rozpuštění vzorku v 50% methanolu a jako mobilní fáze byl použit 64% methanol, zde už docházelo k lepšímu dělení směsi, viz. obrázek 11. Pak byl vzorek rozpuštěn v 50% methanolu a koncentrace methanolu v mobilní fázi byla snížena na 63% methanol. Výsledkem byla účinnější separace lignanů, viz. obrázek 12. Frakce byly jímány do připravených zkumavek zhruba po minutových intervalech na základě nejúspěšnějšího dělení lignanů, viz. obrázek 12. Postupnou úpravou složení mobilní fáze byly separovány i další matečné louhy po krystalizaci frakcí e a d, viz. obrázky 13 ­ 15. Z každé frakce bylo kontrolně odebráno 20 l, toto množství bylo zároveň analyzováno na analytické koloně Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm, s mobilní fází 68% methanol, s průtokem 2 ml/min a UV detekcí 220 nm. Podle výsledků analytické HPLC byly vzorky s obdobným obsahem lignanů spojeny dohromady. Spojené frakce byly zahuštěny ke krystalizaci pod dusíkem. Pokud čistota získaných lignanů zjištěná analytickou HPLC nebyla cca 99,5 %, vzorky se dále dělily na semipreparativním HPLC vždy podle výše uvedeného postupu. 50 [min.] Time 10 20 30 40 50 [V] Voltage 0 2 4 6 8 10 Obr. 10.: Chromatogram 50 mg vzorku C1 rozpuštěného v 2 ml 68% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm, mobilní fáze 65% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 254 nm), směs schizandrinu+ gomisinu A + tigloylgomisinu H [min.] Time 10 20 30 40 50 60 [V] Voltage 0 2 4 6 8 10 Obr. 11.: Chromatogram 50 mg vzorku C1 rozpuštěného v 2 ml 50% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm, mobilní fáze 64% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 254 nm), směs schizandrinu pík 1 + tigloylgomisinu H pík 2 + gomisinu A pík 3 1 2 3 51 [min.] Time 10 20 30 40 50 60 [V] Voltage 0 2 4 6 8 10 Obr. 12.: Chromatogram 50 mg vzorku C1 rozpuštěného v 2 ml 50% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 mm, průměr 8 mm, mobilní fáze 63% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 254 nm), směs schizandrinu pík 1 + tigloylgomisinu H pík 2 + gomisinu A pík 3 [min.] Time 20 30 40 50 60 70 80 [V] Voltage 0 2 4 6 8 Obr. 13.: Chromatogram 25 mg vzorku směsi a gomisinu A a gomisinu J rozpuštěného v 1 ml 50% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm, mobilní fáze 63% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 254 nm), gomisinu A pík 2 + gomisinu J pík 1 3 2 1 1 2 52 [min.] Time 0 10 20 30 40 [V] Voltage 0 2 4 6 8 10 Obr. 14.: Chromatogram 20 mg vzorku deoxyschizandrinu rozpuštěného v 1 ml 75% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 x 8 mm, mobilní fáze 80% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 254 nm),deoxyschizandrin pík 1 [min.] Time 10 20 30 40 [mV] Voltage 20 40 60 80 100 Obr. 15.: Chromatogram 5 mg vzorku -schizandrinu a gomisinu N, rozpuštěného v 1 ml 74% methanolu (preparativní kolona SeparonTM SGX C18 7 m, 250 x 25 mm, mobilní fáze 75% methanol, průtok 4 ml/min, detekce UV 254 nm), -schizandrin pík 1 + gomisin N pík 2 1 1 2 53 Čištěním směsí s převahou schizandrinu a gomisinu A (906 mg) a separací směsí s převahou deoxyschizandrinu (867 mg) pocházejících z frakce e, bylo získáno množství lignanů uvedené v tabulce Tab. 4. Směs z frakce d obsahující -schizandrin a gomisin N v přibližném poměru 1 : 1 (236 mg) byla dělena na preparativní koloně Separon TM SGX C18 7 m, 250 x 25 mm. Směs byla rozdělena na několik částí. Tyto části byly po 10 mg rozpuštěny v 1 ml 74% methanolu a opakovaně děleny na semipreparativní HPLC. Mobilní fází byl 75% methanol s průtokem 4 ml/min. UV detektor byl nastaven na 254 nm. Získaná hmotnost a čistota -schizandrinu jsou uvedeny v tabulce Tab. 4. Tab. 4.: Množství lignanů v získané přečištěním směsí lignanů pomocí semipreparativní HPLC v 99,5% a 98% čistotě čistota Lignan 99,5% 98% schizandrin 212 mg gomisin A 115 mg deoxyschizandrin 96 mg 47mg -schizandrin 62 mg 4.1.2 Izolace minoritních lignanů Při čištění směsí lignanů schizandrinu a gomisinu A byly na chromatogramu vidět i další píky, které naznačovaly, že směs kromě schizandrinu a gomisinu A obsahuje další lignany. Tyto látky byly vidět ve formě menších píků na obrázcích 11 ­ 13. Píky byly zachytávány po průchodu detektorem do čistých zkumavek, jejich čistota byla ověřena HPLC analýzou. Frakce s obdobným složením sloučenin byly spojeny a odpařeny pod dusíkem a část (10 mg) každého vyizolovaného lignanu byla poskytnuta pro stanovení chemické struktury nukleární magnetickou rezonancí. Minoritní lignany byly vyizolovány z frakce s označením AFF (1,09 g) z předchozí izolace, která vznikla spojením frakcí f, g, h a obsahovala velké množství lignanů. Tato frakce byla nejprve frakcionována na připraveném sloupci z alkylovaného silikagelu, s cílem zakoncentrovat lignany před semipreparativní HPLC, a také aby se ochránila semipreparativní kolona před kontaminací velmi nepolárním sloučeninami. Směs byla nanesena na reversní kolonu s obsahem 10 g alkylovaného silikagelu Separon SGX C18 s velikostí částic 60 m. Kolona byla kondiciována 60 ml methanolu a 30 ml 40% methanolu. 1,09 g frakce AFF bylo naneseno rozpuštěné v 30 ml 40% methanolu. Kolona byla následně promyta 30 ml 50, 60, 70, 80, 90 a 100% methanolu. Frakce eluované 60, 70, 80% methanolem obsahují tigloylgomisin H, angeloylgomisin H a gomisin J. Tyto lignany byly získány stejným 54 postupem jako předchozí lignany, několikanásobným přečištěním pomocí semipreparativní HPLC. Vzorky byly rozpuštěny v 50% methanolu a mobilní fází byl 63% methanol. Z frakce AFF bohaté na schizandrin a gomisin A bylo získáno toto množství lignanů (Tab. 5). Tab. 5.: Množství vyizolovaných minoritních lignanu v 99,5% čistotě. čistota Lignan 99,5 % tigloylgomisin H 66,5 mg gomisin J 18,9 mg angeloylgomisin H 77,3 mg tigloylgomisin P 13,5 mg Další minoritní lignan byl získán z frakce e, z izolace popsané v kapitole 3.2.4.1. Matečné louhy po krystalizaci deoxyschizandrinu z frakce e obsahovaly ve větším množství lignan s retenčním časem cca 3 minuty (Obr. 16). 242 mg této frakce bylo rozpuštěno v 6 ml 50% methanolu a naneseno na kolonku C18 (Supelclean LC-18SPE tubes 3 ml s obsahem 500 mg sorbentu C18). Kolona byla promyta 6 ml 50, 60, 70, 80, 90, 2 x 100% methanolem. Jednotlivé frakce byly analyzovány pomocí HPLC a 60% (44 mg), 70% (57,17 mg), 80% (19,3 mg) frakce obsahují lignan tigloylgomisin P. Tyto frakce byly postupně naneseny v 50% methanolu na semipreparativní kolonu, jako mobilní fáze byl použit 63% methanol. UV detektor byl nastaven na 254 nm a průtok byl 2,5 ml/min. Frakce obdobného složení byly spojeny a odpařeny pod dusíkem. Lignan tigloylgomisin P byl získán v množství 13 mg, z tohoto množství byly odeslány 2 mg na NMR analýzu. [min.] Time 2 4 6 8 [V] Voltage 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 17.3 ss3 17.3 AEF-2 Obr. 16.: Chromatogram frakce e ­ modrá a standardu deoxyschizandrinu ­ červená (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), tigloylgomisin P ­ pík 1, deoxyschizandrin ­ pík 2 1 2 55 Vyizolované lignany byly poskytnuty k analýze na NMR. Data byly vyhodnoceny a bylo identifikováno 6 lignanů -schizandrin, angeloylgomisin H, tigloylgomisin H, tigloylgomisin P, gomisin J a deoxyschizandrin. NMR parametry a srovnání s publikovanou literaturou uvádějí tabulky Tab. 6 ­ 13. NMR spektra lignanů jsou přiložena v přílohách 1-13. Lignany schizandrin a gomisin A byly ztotožněny se standardy těchto lignanů získaných z předchozích izolací. 16 Tab. 6.: 1 H NMR (300,13MHz, CDCl3) spektrum vyizolovaného -schizandrinu, chemický posun v ppm *- námi provedená izolace, (Ikeya ) - Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 30 (1), 1982, 132-139, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml) H -schizandrin * (ppm) -schizandrin (ppm) Ikeya H-4 6,55 (1H, s, Ar-H) 6,56 (1H, s, Ar-H) H-11 6,49 (1H, s, Ar-H) 6,49 (1H, s, Ar-H) H6- 2,47 (1H, m) 1 2,5 (1H, dd, J= 13,5 Hz, J=2 Hz), H6- 2,55 (1H, m) 1 2,56 (1H, dd, J=13,5 Hz, J=7,4 Hz) H9- 2,25 (1H, m) 1 2,25 (1H, dd, J=13,2 Hz, J=9,5 Hz) H9- 2,04 (1H, m) 1 2,04 (1H, d, J=13,2 Hz ) O-CH3 3,90 (3H, s) 3,9 (3H, s) O-CH3 3,93 (6H, s) 3,9 (6H, s) O-CH3 3,52 (3H, s) 3,55 (3H, s) H-7 1,81 (1H, s) 1,85 (1H, m) H-8 1,9 (1H, s) 1,85 (1H, m) O-CH2-O 5,96 (2H, dd, J= 1,52 Hz, J=5 Hz) 5,93 (2H, s) CH3-7 0,99 (3H, d, J=7,18 Hz) 0,97 (3H, d, J=6,5 Hz) CH3-8 0,74 (3H, d, J=7,14 Hz) 0,74 (3H, d, J=6,5 Hz) 1 ­ chemické posuny těchto 1 H signálů byly odečteny z H,C korelace HMQC 15 10 16 5 9 6 8 7 14 13 11 12 CH3 CH3 1 2 4 3 H3CO H3CO H3CO O O H3CO Obr. 17.: Vzorec -schizandrinu, vodíky H1 ­ H14 číslování dibenzo[a,c]cyklooktadienového kruhu 56 Tab. 7.: Srovnání 1 H NMR (500,13MHz, CDCl3) spektra angeloylgomisinu H, chemický posun v ppm, *- námi provedená izolace, (Ikeya) - Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 27 (7), 1979, 1576-1582, rozpuštěno v CDCl3, c (5,1 mg/ 0,55 ml) H angeloylgomisin H* (ppm) angeloylgomisin H (ppm) Ikeya H-4 6,70 (1H, s, Ar-H) 6.67 (1H, s, Ar-H) H-11 6,56 (1H, s, Ar-H) 6,56 (1H, s, Ar-H) H6- 2,76 (1H, m) 2,75 (1H, d, J=13,5 Hz) H6- 2,35 (1H, m) 2,30 (1H, d, J=13,5 Hz) H9- 2,42 (1H, m) 2,37 (1H, dd, J=13,5 Hz, J=7 Hz) H9- 2,72 (1H, m) 2,75 (1H, dd, J=13,5 Hz, J=2 Hz) OCH3 3,55 (3H, s) 3,53 (3H, s) OCH3 3,83 (6H, s) 3,83 (6H, s) OCH3 3,89 (3H, s) 3,88 (3H, s) OCH3 3,91 (3H, s) 3,9 (3H, s) H8 1,89 (1H, m) 1,83 (1H, m) OH-7 1,83 (1H, s) 1,83 (1H, s) CH3-7 1,23 (3H, s) 1,23 (3H, s) CH3-8 0,83 (3H, d, J= 7 Hz) 0,83 (3H, d, J=7 Hz) angeloyl 1,76 (6H, m, angeloyl-CH3 (C2,C3)) 1,73 (6H, m, angeloyl-CH3 (C2,C3)) H3´ angeloyl 5,89 (1H, m) neuvedeno CH3 CH3 OH O O CH3 O CH3 O CH3 O O CH3 CH3 CH3 O CH3 Obr. 18.: Vzorec angeloylgomisinu H, vodíky H1 ­ H14 číslování dibenzo[a,c]cyklooktadienového kruhu, viz. obrázek 17 57 Tab. 8.: Srovnání 1 H NMR (300,13MHz, CDCl3) spektra tigloylgomisinu H , chemický posun v ppm,*- námi provedená izolace, (Ikeya) - Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 27 (7), 1979, 1576-1582, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml) H tigloylgomisin H* (ppm) tigloylgomisin H (ppm) Ikeya H-4 6,69 (1H, s, Ar-H) 6,68 (1H, s, Ar-H) H-11 6,56 (1H, s, Ar-H), 6,57 (1H, s, Ar-H), H6- 2,73 (1H, m) 2,75 (1H, d, J=13,5 Hz) H6- 2,34 (1H, m) 2,30 (1H, d, H-6, J=13,5 Hz) H9- 2,42 (1H, m) 2,35 (1H, dd, J= 13,5 Hz, J=7 Hz) H9- 2,72 (1H, m) 2,75 (1H, dd, J=13,5 Hz, J=2 Hz) OCH3 3,50 (3H, s) 3,50 (3H, s) OCH3 3,83 (6H, s) 3,83 (6H, s) OCH3 3,89 (3H, s) 3,89 (3H, s) OCH3 3,91 (3H, s) 3,91 (3H, s) H8 1,91 (1H, m) 1,93 (1H, m) OH-7 1,86 (1H, s) 1,93 (1H, s) CH3-7 1,25 (3H, s) 1,23 (3H, s) CH3-8 0,85 (3H, d, J=7 Hz) 0,84 (3H, d, J=7 Hz) tigloyl 1,70 (6H, m, CH3 (C2,C3)) 1,70 (6H, m, CH3 (C2,C3)) H3´tigloyl 6,83 (1H, m) 6,78 (1H, m) Obr. 19.: Vzorec tigloylgomisinu H, vodíky H1 ­ H14 číslování dibenzo[a,c]cyklooktadienového kruhu, viz. obrázek 17 CH3 CH3 OH O O CH3 O O CH3 O O O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 58 Tab. 9.: Srovnání 1 H NMR spektra (500,13 MHz, CDCl3) tigloylgomisinu P, chemický posun v ppm, *- námi provedená izolace, (Ikeya) ­ Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 38, 1990, 1408, rozpuštěno v CDCl3, c (1,9 mg/ 0,55 ml) H tigloylgomisin P* (ppm) tigloylgomisin P (ppm) Ikeya H-4 6,89 (1H, s, Ar-H) 6,89 (1H, s, Ar-H) H-11 6,50 (1H, s, Ar-H), 6,50 (1H, s, Ar-H), H6- 5,53 (1H, s) 5,59 (1H, s) H9- 2,18 (1H, m) 2,18 (1H, dd, J=13,7 Hz, J=1,5 Hz) H9- 2,08 (1H, m) 2,07 (1H, dd, J=13,7 Hz, J=9,3 Hz) OH-7 2,09 (1H, s) neuvedeno H-8 1,89 (1H,m) 1,88 (1H, m) O-CH3 3,91 (3H, s) 3,91(3H, s) O-CH3 3,89 (3H, s) 3,88 (3H, s) O-CH3 3,83 (3H, s) 3,82 (3H, s) O-CH3 3,62 (3H, s) 3,62 (3H, s) O-CH2-O 5,98 (2H, s ) 5,98 (2H, s) CH3-7 1,10 (3H, s) 1,10 (3H, s) CH3-8 1,11 (3H, d, J=6,6 Hz) 1,11 (3H, d, J=6,6 Hz) CH3(tigloyl) 1,88 (6H, dd, J=1,10 Hz, J=7,08 Hz) 2 (6H, m, CH3 (C2,C3)) H3´tigloyl 6,97 (1H, m) neuvedeno Obr. 20.: Vzorec tigloylgomisinu P, vodíky H1 ­ H14 číslování dibenzo[a,c]cyklooktadienového kruhu, viz. obrázek 17 CH3 CH3 H3CO O H3CO H3CO O O OH O O CH3 CH3 H CH3 59 Tab. 10.: Srovnání 1 H NMR spektra (500,13 MHz, CDCl3) gomisinu J, v jednotkách chemického posunu ppm, *- námi provedená izolace, (Ikeya) ­ Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 38, 1990, 1408, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml) H gomisin J* (ppm) gomisin J ( ppm) Ikeya H-4 6,64 (1H, s, Ar-H) 6,63 (1H, s, Ar-H) H-11 6,64 (1H, s, Ar-H) 6,63 (1H, s, Ar-H) Ar-OH 5,70 (1H, s) 5,91 (1H, s) Ar-OH 5,67 (1H, s) 5,91 (1H, s) H6- 2,47 (1H, m) 1 H6- 2,56 (1H, m) 1 H9- 2,25 (1H, m) 1 H9- 2,04 (1H, m) 1 2,0 -2,7 (4H, m) O-CH3 3,94 (3H, s) O-CH3 3,93 (3H, s) 3,94 (6H, s) O-CH3 3,53 (6H, s) 3,5 (6H, s) H-7 1,89 (1H, m) 1,5-2,4 (1H, m) H-8 1,80 (1H, m) 1,5-2,4 (1H, m) CH3-7 0,99 (3H, d, J=7,2 Hz) 0,99 (3H, d, J=7 Hz) CH3-8 0,75 (3H, d, J=7,1 Hz) 0,75 (3H, d, J=7 Hz) 1 ­ chemické posuny těchto 1 H signálů byly odečteny z H,C korelace HMQC Obr. 21.: Vzorec gomisinu J 15 10 16 5 9 6 8 7 14 13 11 12 CH3 CH3 1 2 4 3 H3CO H3CO H3CO OH H3CO OH 60 Tab. 11.: 1 H NMR (300,13MHz, CDCl3) spektrum vyizolovaného deoxyschizandrinu, chemický posun v ppm *- námi provedená izolace, (Ikeya )- Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 27 (1), 1979, 2695- 2709, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml) H deoxyschizandrin * (ppm) deoxyschizandrin (ppm) Ikeya H-4 6,55 (1H, s, Ar-H) 6,55 (1H, s, Ar-H) H-11 6,54 (1H, s, Ar-H) 6,55 (1H, s, Ar-H) H6 2,59 (1H, dd, J= 13,5 Hz, J=7,5 Hz) H6 2,51 (1H, dd, J= 13,5 Hz, J=1,9 Hz) 2,58 (2H, m) H9- 2,25 (1H, dd, J= 13,2 Hz, J=9,5 Hz) 2,27 (1H, dd, J=13,5 Hz, J=9 Hz) H9- 2,06 (1H, dd, J= 13,2 Hz, J=1 Hz) 2,02 (1H, d, J=13,5 Hz, J=1 Hz) O-CH3 3,90 (3H, s) O-CH3 3,89 (3H, s) O-CH3 3,89 (3H, s) O-CH3 3,87 (3H, s) 3,90 (12H, s) O-CH3 3,59 (3H, s) O-CH3 3,59 (3H, s) 3,58 (6H, s) H-7 1,82 (1H, m) 1,82 (1H, m) H-8 1,92 (1H, m) 1,92 (1H, m) CH3-7 1,01 (3H, d, J=7,10 Hz) 0,98 (3H, d, J=7 Hz) CH3-8 0,75 (3H, d, J=7,07 Hz) 0,73 (3H, d, J=7 Hz) 61 Tab. 12.: Srovnání 13 C NMR spektra tigloylgomisinu P, v jednotkách chemického posunu ppm, *- námi provedená izolace, (Ikeya) - Ikeya H.,: Chem. Pharm. Bull. 28, 1980, 3357, 1408, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml), s- singlet (C), d-dublet (CH), t- triplet (CH2), q-quartet (CH3) 13 C ppm * CHn ppm (Ikeya) rozdíl 1 151,09 C 151,1 s 0,01 2 141,09 C 141,1 s 0,01 3 152,34 C 152,4 s 0,06 4 106,22 CH 106,2 d -0,02 5 133,04 C 133,1 s 0,06 6 77,63 CH 77,6 d -0,03 7 75,23 C 75,2 s -0,03 8 46,62 C 46,6 s -0,02 9 36,7 CH2 36,7 t 0 10 136,69 C 136,7 s 0,01 11 103 CH 103 d 0 12 149,45 C 149,5 s 0,05 13 135,61 C 135,6 s -0,01 14 141,54 C 141,5 s -0,04 15 122,92 C 122,9 s -0,02 16 119,58 C 119,6 s 0,02 17-CH3 18,78 CH3 18,8 q 0,02 18-CH3 17,49 CH3 17,5 q 0,01 OCH3-1 60,59 CH3 60,6 q 0,01 OCH3-14 59,95 CH3 59,9 q -0,05 OCH3-2 60,91 CH3 60,9 q -0,01 OCH3-3 55,93 CH3 55,9 q -0,03 O-CH2-O 101 CH2 101 t 0 tigloyl 166,64 C 166,6 s -0,04 tigloyl 128,77 C 128,8 s 0,03 tigloyl 137,55 CH 137,5 d -0,05 tigloyl 12,22 CH3 12,2 q -0,02 62 Tab. 13.: Srovnání 13 C NMR spektra gomisinu J, v jednotkách chemického posunu ppm, *- námi provedená izolace, (Ikeya) ­ Ikeya H.: Chem. Pharm. Bull. 28, 1980, 2414, 1408, rozpuštěno v CDCl3, c (4 mg/ 0,55 ml), s- singlet (C), d-dublet (CH), t- triplet (CH2), q-quartet (CH3) 13 C ppm * CHn ppm (Ikeya) rozdíl 1 150,24 C 150,3 0,06 2 137,69 C 137,8 0,11 3 147,53 C 147,6 0,07 4 113,13 CH 113,3 0,17 5 134,88 C 134,9 0,02 6 38,86 CH2 38,9 0,04 7 33,76 C 33,8 0,04 8 40,96 C 41 0,04 9 35,35 CH2 35,3 -0,05 10 140,2 C 140,2 0 11 110,05 CH 110,2 0,15 12 148,72 C 148,8 0,08 13 137,4 C 137,5 0,1 14 150,36 C 150,5 0,14 15 121,44 C 121,5 0,06 16 122,47 C 122,5 0,03 17 21,68 CH3 21,7 0,02 18 12,55 CH3 12,6 0,05 OCH3-1,14 60,04 CH3 60,1 0,06 OCH3-2,13 61 CH3 61 0 Tab. 14.: Srovnání bodů tání vyizolovaných lignanů s publikovanou literaturou Lignan bod tání °C bod tání °C/literatura tigloylgomisin P 123,3 amorfní 55 gomisin J 149,5 149-150 57 angeloylgomisin H 57,6 amorfní 54 tigloylgomisin H 81,2 amorfní 54 -schizandrin 125 126,5-128 49, 52 gomisin A 96-98 88-89 41 63 U třech vyizolovaných lignanů gomisinu A, gomisinu J a -schizandrinu se naměřené body tání sloučenin blížily publikovaným údajům (Tab. 14). U dalších tří lignanů je uvedeno, že byly vyizolovány jako amorfní prášek. 4.2. Optimalizace metody extrakce a stanovení lignanů S. chinensis pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie 4.2.1 Optimalizace mobilní fáze pro HPLC Jako standardní vzorek pro optimalizaci mobilní fáze sloužila směs šesti lignanů ­ schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu, -schizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C o koncentraci 4 g/ml. Byla vybrána dvě organická rozpouštědla, methanol a acetonitril, v různých ředěních s deionizovanou vodou, viz. tabulka Tab. 15. Chromatogramy vzorku standardu ve všech zkoušených mobilních fázích jsou vidět na obrázcích 22 ­ 27. Tab. 15.: Složení testovaných mobilních fází na koloně Chromolith Performance RP ­ 18e, (100 x 4,6 mm), průtok 2 ml/min Methanol : voda Acetonitril : voda A 72 : 28 A 60 : 40 B 68 : 32 B 55 : 45 C 66 : 40 C 50 : 50 [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage -50 0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5 6 Obr. 22.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 72% methanol, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C 64 [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage -50 0 50 100 150 200 1 2 3 4 5 6 Obr. 23.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 68% methanol, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1-schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage 0 50 100 150 1 2 3 4 5 6 Obr. 24.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C 65 [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage -50 0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5 6 Obr. 25.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 60% acetonitril, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage -50 0 50 100 150 200 1 2 3 4 5 6 Obr. 26.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 55% acetonitril, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C 66 [min.] Time 0 5 10 15 20 25 [mV] Voltage -50 0 50 100 150 200 1 2 3 4 5 6 Obr. 27.: Chromatogram směsného standardu o c-4 g/ml (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 50% acetonitril, průtok 2 ml/min, 220 nm) píky: 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 6 - wuweizisu C V tabulkách Tab. 16 až 21 jsou uvedeny chromatografické parametry všech zkoušených mobilních fází. Tab. 16.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 72% methanol, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,6 0,01 1,94 0,10 2242 278 gomisin A 1,45 0,02 1,86 0 2312 240 2,67 0,07 deoxyschizandrin 2,97 0,03 1,64 0,06 3397 58 9,40 0,15 -schizandrin 4,36 0,04 1,38 0,04 3898 264 5,75 0,15 gomisin N 4,70 0,05 1,33 0 3968 207 1,17 0,03 wuweizisu C 6,58 0,07 1,62 0,05 4404 166 5,43 0,07 Tab. 17.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 68% methanol, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,38 0 1,81 0,27 2374 gomisin A 1,86 0 1,78 0 3005 14 3,89 0,04 deoxyschizandrin 4,62 0,01 1,56 0,05 3799 226 12,69 0,28 -schizandrin 7,18 0,02 1,55 0,09 4342 188 6,97 0,18 gomisin N 7,79 0,02 1,31 0,14 4292 21 1,34 0 wuweizisu C 11,28 0,03 1,49 0,05 4638 139 6,15 0,07 67 Tab. 18.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 66% methanol, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,84 0,04 1,74 0,06 2489 115 gomisin A 2,72 0,06 1,69 0 3022 108 5,15 0,01 deoxyschizandrin 8,27 0,18 1,56 0,14 4212 77 15,71 0,19 -schizandrin 13,44 0,30 1,39 0 4661 115 7,99 0,03 gomisin N 14,69 0,32 1,33 0,01 4920 399 1,54 0,03 wuweizisu C 21,74 0,43 1,50 0,31 5049 66 6,85 0,11 Tab. 19.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 60% acetonitril, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,23 0 1,83 0 232 18 gomisin A 1,38 0 1,57 0 2945 20 1,51 deoxyschizandrin 3,74 0,01 1,57 0,05 5326 52 15,17 0,36 -schizandrin 4,67 0,01 1,57 0,06 5147 21 3,98 0,07 gomisin N 5,03 0,01 1,27 0,03 5469 21 1,33 0 wuweizisu C 6,05 0,01 1,61 0,00 5425 25 3,42 0,02 Tab. 20.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 55% acetonitril, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,35 0,01 1,83 0 2809 42 gomisin A 1,57 0,01 1,81 0,17 3059 27 2,01 0,04 deoxyschizandrin 4,97 0,02 1,60 0,03 5202 199 17,54 0,22 -schizandrin 6,46 0,02 1,71 0,15 5413 41 4,77 0,04 gomisin N 6,99 0,03 1,37 0,07 5486 198 1,46 0,01 wuweizisu C 8,71 0,04 1,59 0,05 5416 129 4,10 0,05 68 Tab. 21.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) s mobilní fází 50% acetonitril, retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=3) Lignan tR (min) s. d Asymetrie s.d. N s. d. RS s. d. schizandrin 1,65 0,01 1,86 0 3110 383 gomisin A 2,01 0,01 1,88 0 3486 33 2,78 0,09 deoxyschizandrin 7,54 0,03 1,64 0,15 5177 39 19,99 0,07 -schizandrin 10,30 0,03 1,45 0,13 5620 128 5,71 0,04 gomisin N 11,21 0,03 1,50 0,03 5579 269 1,59 0,04 wuweizisu C 14,53 0,04 1,53 0,20 5716 28 4,79 0,04 Nejvhodnější mobilní fáze pro HPLC analýzu lignanů je z testovaných mobilních fází 50% acetonitril. Počet teoretických pater kolony N je nejvyšší a rozlišení Rs=1,59, kritického páru izomerů -schizandrinu a gomisinu N, je také nejvyšší u mobilní fáze 50% acetonitril (Tab. 21). Druhou nejlepší fází je 66% methanol. Asymetrie píku se nejvíce blíží k jedné, rozlišení Rs píků -schizandrinu a gomisinu N je 1,54 (Tab. 18). Na základě posouzení těchto faktorů byl vybrán pro analýzu vzorků kultur 50% acetonitril. 4.2.2 Výběr vlnové délky pro analýzu Maximum absorbance lignanů je přibližně při vlnové délce 220 nm. Např. maximum absorbance gomisinu A je 218 nm, viz. obrázek 28. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 200 250 300 350 400 450 500 Vlnová délka (nm) Absorbance Obr. 28.: Závislost absorbance na vlnové délce u gomisinu A, c (1mg/ml), 100% methanol . 69 Vzorek semen byl měřen při vlnové délce 220 nm a 254 nm, což je druhé absorpční maximum většiny lignanů. Toto měření bylo provedeno pro dvě vybrané mobilní fáze, 50% acetonitril ­ obrázek 30, 66% methanol ­ obrázek 29. [min.] Time 5 10 15 [V] Voltage 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 Obr. 29.: Porovnání absorbancí 220 a 254 nm pro detekci vzorku semen S. chinensis (kolona Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV modrá - 254 nm, červená - 220 nm) píky: 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 5 - wuweizisu C [min.] Time 5 10 15 [V] Voltage 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 2 3 4 5 6 Obr. 30.: Porovnání absorbancí 220 a 254 nm pro detekci vzorku semen S. chinensis (kolona Chromolith Performance RP-18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 50% acetonitril, průtok 2 ml/min, detekce UV modrá - 254 nm, červená - 220 nm) píky: 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N, 5 - wuweizisu C Při vlnové délce 220 nm je dosaženo větší odezvy detektoru a tím větší citlivosti detekce lignanů. K větší detekci dochází jak u 66% methanolu jako mobilní fáze, tak také dochází k větší odezvě detektoru u mobilní fáze 50% acetonitril. 70 4.2.3 Volba rozpouštědla pro extrakci Pro extrakci nepolárních lignanů byla vybrána tato organická rozpouštědla: aceton, acetonitril, chloroform, ethylacetát a methanol. Do Erlenmayerovy baňky o objemu 25 ml bylo odváženo přibližně 50 mg zhomogenizovaných, rozdrcených listů S. chinensis a bylo přidáno 5 ml zvoleného rozpouštědla. Postup extrakce je uveden v experimentální části, viz. 3.2.2.1. Odparek byl zpracován na SPE a analyzován pomocí HPLC. Zbylý vyluhovaný materiál v Erlenmayerových baňkách byl vždy u všech vzorků pro kontrolu doextrahován methanolem (3 x 5 ml methanolu 3, 3 a 6 hodin v termostatu při 45 °C na třepačce). Methanolový extrakt byl odpařen, odparek byl přečištěn pomocí SPE a analyzován na HPLC. Toto měření bylo kontrolní, aby bylo zjištěno, zda se všechny lignany vyextrahovaly již při první extrakci. Tabulka Tab. 22 uvádí jako příklad srovnání účinnosti extrakce gomisinu A všemi organickými rozpouštědly. Tab. 22.: Srovnání účinnosti extrakce listů S. chinensis zvolenými organickými rozpouštědly, srovnání účinnosti extrakce u gomisinu A. rozpouštědlo m extraktu (%) a, b výtěžek gomisinu A (%) a, b výtěžek gomisinu A (%) a, c aceton 15,5 3,24 10-3 0,22 10-3 acetonitril 21,0 3,16 10-3 0,24 10-3 chloroform 10,0 2,48 10-3 0,26 10-3 ethylacetát 32,2 3,61 10-3 0,48 10-3 methanol 33,0 3,75 10-3 0,18 10-3 a % suché hmotnosti vzorku b extrakce organickým rozpouštědlem (aceton, acetonitril, chloroform, ethylacetát, methanol) c doextrahování methanolem po zvoleném rozpouštědle Z tabulky Tab. 22 vyplývá, že nejhmotnější extrakt poskytl methanol. Zároveň množství doextrahovaného gomisinu A při kontrolním doextrahování methanolem je velmi malé (0,18 10-3 %), což dokazuje, že lignany jsou vyextrahovány ve velkém množství. Ethylacetátový extrakt má druhou největší hmotnost, ale hmotnost extraktu při následném doextrahování methanolem je poměrně vysoká (0,48 10-3 %). Z těchto důvodů se nejvíce ideální jeví methanol jako vhodné extrakční rozpouštědlo, protože je jím na poprvé vyextrahováno největší množství lignanů (Obr. 31). 71 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 aceton acetonitril ethylacetát chloroform methanol mV.s Obr. 31.: Srovnání plochy píku gomisinu A vyextrahovaného různými organickými rozpouštědly. Modrá ­ extrakce organickým rozpouštědlem, fialová ­ kontrolní doextrahování rostlinného materiálu methanolem. 4.2.4 Optimalizace extrakce na pevnou fázi (SPE) K odparku (z extrakce methanolem) byl přidány 2 ml deionizované vody (metoda 1), nebo 2 ml 10% methanolu (metoda 2) s cílem zjistit, jaké rozpouštědlo je nejvhodnější pro první krok extrakce na tuhou fázi. Následně byla provedena SPE extrakce a HPLC analýza, viz. body 3.2.2 a 3.2.3. Výsledky jsou vyneseny v tabulce Tab. 23. Obě metody poskytly přibližně stejný statistický výsledek. Metoda 2, přidání 2 ml 10% methanolu, vykázala vyšší výtěžek schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu a gomisinu N, proto byla vybrána pro celkový postup SPE extrakce. Tab. 23.: Srovnání účinnosti dvou metod extrakce lignanů pomocí SPE, metoda 1 - s 2 ml deionizované vody, metoda 2 ­ s 2 ml 10% methanolu.Výsledky jsou uvedeny jako plochy píků lignanů směrodatná odchylka (n=4) plocha píku (mV.s) metoda schizandrin s. d. gomisin A s. d. deoxyschizandrin s.d. gomisin N s. d. 1 7550,78 4,3 9806,52 6,8 2121,99 2,05 4075,97 5,2 2 7741,55 3,6 9907,52 4,2 2218,34 3,09 4377,25 5,1 SPE extrakce byla provedena podle optimalizovaného postupu v experimentální části, viz. 3.2.2.3. Frakce I. ­ obrázek 32, frakce II. ­ obrázek 33, frakce III. ­ obrázek 34, frakce IV. ­ obrázek 35. 72 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min.] 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Voltage[1E3mV] Obr. 32.: Chromatogram vzorku S. chinensis I. frakce SPE (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min.] 0 1 2 3 4 Voltage[1E3mV] Obr. 33.: Chromatogram vzorku S. chinensis II. frakce SPE (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) 73 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min.] 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Voltage[1E3mV] 1 2 3 4 Obr. 34.: Chromatogram vzorku S. chinensis III. frakce SPE (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) pík 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min.] -25 0 25 50 75 100 Voltage[mV] Obr. 35.: Chromatogram vzorku S. chinensis IV. frakce SPE (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) Lignany se nacházejí pouze ve frakci III. Extrakci na pevnou fázi se zbaví vzorek polárních látek, které jsou viditelné na obrázku 32 a 33 a mohly by rušit stanovení lignanů, především gomisinu A a schizandrinu, které vykazují díky svým hydroxylovým skupinám jistou polaritu a mají velmi krátké retenční časy. Frakce III. obsahovala více než 98 % jednotlivých lignanů. Obsah lignanů ve frakcích I., II. a IV. byl převážně pod limitem detekce. Frakce III. byla dále použita k HPLC analýze. Po přečištění pomocí SPE zůstane zhruba 2,8 % celkové navážky vzorku (Tab. 24) s téměř 100% obsahem lignanů. 3 4 5 74 Tab. 24.: Obsah lignanů ve frakcích z SPE v % a efektivita přečištění vzorku pomocí SPE extrakce, s. d. ­ směrodatná odchylka (n=4) Frakce SPE % původní hmotnosti s. d. % lignanů I. ­ 10% methanol 23,6 5,8 0 II. ­ 40% methanol 3,0 0,5 0 III. ­ 100% methanol 2,8 1,5 99,5 IV. ­ 100% methanol 0,8 0,3 0,5 4.2.5 Optimalizace ředění vzorku k nástřiku pro HPLC analýzu Dalším krokem byl výběr vhodného rozpouštědla pro přípravu vzorku na HPLC analýzu. Extrakt ze semen obsahující schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, -schizandrin a gomisin N o koncentraci cca 1 mg/ml byl naředěn deionizovanou vodou a 10% až 100% methanolem. Byl sledován jaký způsob ředění vzorku pro HPLC analýzu je nejvhodnější. Ředění vzorků: 50 l vzorku (10% methanol) + 450 l deionizované vody nebo 10, 20, 40, 60, 80 a 100% methanolu [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 100 200 300 400 500 600 700 1 2 3 4 5 Obr. 36.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný vodou (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N 75 [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 200 400 600 800 1 2 3 4 5 Obr. 37.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 10% methanolem (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm),pík 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 200 400 600 1 2 3 4 5 Obr. 38.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 20% methanolem (kolona Chromolith Performance RP­18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N 76 [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 100 200 300 400 500 600 700 1 2 3 4 5 Obr. 39.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 40% methanolem (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 - -schizandrin, 5 - gomisin N [min.] Time 5 10 15 [mV] Voltage 0 200 400 600 800 1 2 3 4 5 Obr. 40.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 60% methanolem (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1- schizandrin, 2- gomisin A, 3 ­ deoxyschizandrin, 4 ­ -schizandrin, 5-gomisin N 77 [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 100 200 300 400 500 600 1 2 3 4 5 Obr. 41.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 80% methanolem (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 ­ -schizandrin, 5-gomisin N [min.] Time 5 10 15 20 [mV] Voltage 0 50 100 150 200 250 300 350 1 2 3 4 5 Obr. 42.: Chromatogram extraktu ze semen, vzorek ředěný 100% methanolem (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1- schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - deoxyschizandrin, 4 ­ -schizandrin, 5-gomisin N Na chromatogramech různě ředěného extraktu semen je vidět špatné dělení vzorků, pokud je vzorek rozpuštěn v deionizované vodě, 10 a 20% methanolu, viz. obrázek 36 ­ 38. Výrazně nepolární lignany, jakými jsou v tomto případě -schizandrin (4) a gomisin N (5), jsou rozmyté a nejasně stanovitelné. Naopak pokud vzorek rozpustíme v methanolu, tak jsou špatně rozdělené lignany s hydroxylovou skupinou jako jsou gomisin A (2) a schizandrin (1) (Obr. 42). Nejlepší dělení lignanů vykazuje 60% a 80% methanol. Pro nástřik vzorku bylo 78 zvoleno rozpuštění v 80% methanolu, protože v tomto případě dochází k lepší rozpustnosti nepolárních lignanů. 4.2.6 Kalibrace HPLC Pro vypracovanou HPLC metodu stanovení lignanů S. chinensis byl stanoven způsob kalibrace. Kalibrační přímka (y = ac + b) byla zkonstruována proložením plochy píku (y) a koncentrace analyzovaného lignanu (c). Korelační koeficient (R2 ) je ve všech případech větší než 0,999, což indikuje velmi dobrou linearitu ve zkoušeném koncentračním rozpětí. Chromatografické parametry lignanů pro mobilní fázi 50% acetonitril na používané monolitické koloně Chromolith Performance RP 18e, 100 x 4,6 mm jako jsou: retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků (As) jsou zobrazeny v následující tabulce Tab. 25. Lignany, pro které byly tyto parametry stanoveny jsou vidět v chromatogramu na obrázku 43. Výsledky ukazují, že tato metoda vykazuje vhodnost zvolené analytické kolony, akceptovatelné rozlišení a může být použita pro stanovení množství lignanů ve vzorcích rostlinného materiálu i v tkáňových kulturách. Stanovení lignanů optimalizovanou metodou poskytuje dobré rozlišení Rs a asymetrie As se nejvíce blíží 1. Tab. 25.: Parametry separace lignanů na koloně Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm,) standard 6 lignanů (4 mg/l) pro mobilní fázi 50% acetonitril: retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků (As), Lignan tr (min) N k Rs Asymetrie As schizandrin 1,65 3110 2,06 - 1,86 gomisin A 2,01 3486 2,80 2,78 1,88 deoxyschizandrin 7,54 5177 14,7 19,99 1,64 -schizandrin 10,30 5620 20,7 5,71 1,45 gomisin N 11,21 5579 22,6 1,59 1,50 wuweizisu C 14,53 5716 30,0 4,79 1,53 Z meze stanovitelnosti (LOQ ­ limit of quantification) byla stanovena spodní hranice meze stanovitelnosti LLOQ (lower limit of quantification). LLOQ odpovídá nejnižší stanovitelné hranici koncentraci standardu, při které je přesnost stanovení vysoká a variabilita menší než 20 %. Popsaná metoda má LLOQ 0,1 mg/l pro schizandrin a gomisin A, 0,3 mg/l pro deoxyschizandrin, -schizandrin a gomisin N a 1 mg/l pro wuweizisu C (Tab. 26). 79 Tab. 26.: Linearita a kalibrace validované metody stanovení lignanů pro kolonu Chromolith Performance RP ­ 18e, (100 x 4,6 mm), mobilní fáze 50% acetonitril, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm, LOD-limit detekce , LOQ-limit kvantifikace, Lignan LOD (ng) LOQ (ng) Rozpětí kalibrace(mg/l) Směrnice a Úsek b Korelační koeficient(R2 ) schizandrin 0,4 1,2 0,1 ­ 30 245,2 + 1,363 0,99948 gomisin A 0,5 1,5 0,1 ­ 30 238,1 + 2140 0,99948 deoxyschizandrin 2,0 7 0,5 ­ 30 225,5 - 8,991 0,99943 -schizandrin 2,7 9 0,5 ­ 30 258,4 - 4,360 0,99956 gomisin N 2,8 9 0,5 ­ 30 283,7 + 3,445 0,99978 wuweizisu C 3,9 13 1,0 ­ 30 241,0 + 4,312 0,99934 Obr. 43.: Chromatogram extraktu ze semen S. chinensis obsahující stanovované lignany (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) 4.2.7 Návratnost lignanů Při extrakci vzorku methanolem dochází k určitým ztrátám lignanů (zachycení na filtračním papíru, stěnách Erlenmayerových baněk atd.). Čím více kroků v extrakci a analýze je, tím je větší riziko poklesu koncentrace lignanů v extraktu a nepřesnosti výsledku. Návratnost lignanů byla zjištěna tak, že byla vybrána rostlina, která neobsahuje látky typu lignanů. Takovou rostlinou byl Cynara cardunculus L. (artyčok kardový), který obsahuje fenolické sloučeniny ­ estery kyseliny kávové a flavonoidy. Jako rostlinný materiál [min.] Time 0 5 10 15 20 [V] Voltage 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 schizandrin gomisin A deoxyschizandrin gama-schizandrin gomisin N wuw eizisu C 80 pro průkaz návratnosti byly použity listy sbírané v roce 2000, které pocházejí z Centra léčivých rostlin LF MU na Kraví hoře v Brně. S 50 mg listů C. cardunculus byla provedena extrakce methanolem, SPE extrakce a HPLC analýza, viz body (3.2.1 - 3.2.3). Tento vzorek (Obr. 44) byl analyzován z důvodů kontroly, jestli se v artyčoku nenacházejí sloučeniny, které by mohly interferovat s analýzou lignanů. K 50 mg navážky listů C. cardunculus bylo přidáno 50 l standardu schizandrinu, gomisinu A, gomisinu N a wuweizisu C + 4,83 ml methanolu. Dále byla provedena extrakce methanolem, SPE extrakce a HPLC analýza, viz. (3.2.1 ­ 3.2.3). Chromatogram vzorku listů Cynara cardunculus a standardů lignanů je vidět na obrázku 45. Příprava standardů schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu, -schizandrinu, gomisinu N: 50 l standardu o koncentraci (1 mg/ml) + 950 l 40% methanolu. Příprava standardu wuweizisu C: 20 l standardu o koncentraci (1 mg/ml) + 980 l 40% methanolu. Retenční čas a plocha píku jsou porovnány v tabulkách Tab. 27, 28 a 29. Tab. 27.: Návratnost schizandrinu (50 g/ml) a návratnost gomisinu A (50 g/ml), t-retenční čas, (n = 4), s. d. ­ směrodatná odchylka, VK- variační koeficient Schizandrin Gomisin A Vzorek t (min) plocha (V.s) s. d VK t (min) plocha (V.s) s.d. VK C. cardunculus + standard 1,94 10121,58 319,99 3,46 3,37 7749,11 580,782 8,52 standard 1,9 10317,62 3,08 7642,13 Tab. 28.: Návratnost deoxyschizandrinu (50 g/m)l a -schizandrinu (50 g/ml), t-retenční čas, s. d. ­ směrodatná odchylka, (n = 4), VK- variační koeficient Deoxyschizandrin -schizandrin Vzorek t (min) plocha (V.s) s.d. VK t (min) plocha (V.s) s.d. VK C. cardunculus + standard 11,06 7688,13 258,45 7,51 17,45 5764.19 158,42 4,89 standard 11,10 7829,05 17,49 6991,40 Tab. 29.: Návratnost gomisinu N (50 g/ml a wuweizisu C (20 g/ml), t-retenční čas, s. d. směrodatná odchylka, (n = 4), VK- variační koeficient Gomisin N Wuweizisu C Vzorek t (min) plocha (V.s) s.d. VK t (min) plocha (V.s) s.d. VK C. cardunculus + standard 18,72 6413,66 933,15 13 28,69 2632,83 51,95 2,04 standard 18,75 6859,53 28,56 2925,37 81 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Time [min.] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Voltage[1E3mV] Obr. 44.: Chromatogram listů C. cardunculus (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm) 0 5 10 15 20 25 30 Time [min.] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Voltage[1E3mV] 1 2 3 4 Obr. 45.: Chromatogram listů C. cardunculus s přidanými standardy ­ vzorek 2 (kolona Chromolith Performance RP ­ 18e, 100 x 4,6 mm, mobilní fáze 66% methanol, průtok 2 ml/min, detekce UV 220 nm), pík 1 - schizandrin, 2 - gomisin A, 3 - gomisin N, 4 - wuweizisu C Byly stanoveny procenta hmotnosti přidaných standardů ­ návratnost metody stanovení a bylo prokázáno, že ztráty lignanů zvolenou optimalizovanou metodou extrakce jsou malé (Tab. 30). U gomisinu N byla návratnost během všech operací 101,4 %. U nepolárního lignanu wuweizisu C byla návratnost nejmenší 89,9 %. Opakovatelnost metody byla stanovena na základě 10krát opakované analýzy jednoho vzorku kultury v průběhu dne (Tab. 30). Opakovatelnost metody zjištěná analýzou jednoho 82 vzorku kultury v různých dnech je v tabulce vyjádřena jako opakovatelnost ,, interday" a byla změřena v 1 den začátku pokusu a pak 3 den, 5 den a 7 den. Tab. 30.: Srovnání absolutní návratnosti stanovovaných lignanů, opakovatelnost ,,intraday" měřena během dne po 30 minutách, opakovatelnost ,,interday" měřena v průběhu několika dní (1 den, 3 den, 5 den a 7 den od založení pokusu) Lignan Absolutní návratnost a s. d. (%) (n=4) Opakovatelnost ,,intraday" (%) (n=10) Opakovatelnost,,interday" (%) (n=4) schizandrin 98,1 5,5 2,5 8,3 gomisin A 101,4 2,8 2,0 2,9 deoxyschizandrin 98,2 4,2 2,5 9,7 -schizandrin 93,1 3,1 3,2 11,6 gomisin N 93,5 3 2,7 11,1 wuweizisu C 89,9 7 4,5 13,1 a návratnost lignanů = průměrná plocha píků / plocha standardu * 100 % Výsledky opakovatelnosti metody v průběhu jednoho dne v jedné sérii vzorku dosahují velmi dobrého rozpětí od 2 ­ 4,5 %, v průběhu několika dní dosahují rozpětí 2,9 ­ 13,1 %. 4.3 Adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice Polymerní pryskyřice by mohly mít na základě svého chemického složení schopnost vázat nepolární lignany. Proto byl stanoven cíl srovnat, jak moc bude určité množství vybrané polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 (na bázi polystyrenu) a Amberlite XAD-7 (na bázi poakrylesteru) vázat standardy lignanů deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C. Tyto lignany byly vybrány z důvodu nejvyššího výskytu v kulturách S. chinensis. Bylo naváženo 12,5 mg amberlitu, jenž byl suspendován v 500 l methanolu + 500 l deionizované vody. K takto připravenému vzorku bylo přidáno 200 l standardu (deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C) o koncentraci 50 g/ml v 60% methanolu. Vzorky byly umístěny do uzavíratelných plastových mikrozkumavek Eppendorf. V pravidelných časových intervalech byl změřen pokles absorbance při 220nm. Vzorek kontroly byl připraven suspendací 12,5 mg amberlitu v 500 l methanolu + 500 l deionizované vody, k vzorku bylo přidáno 200 l 60% methanolu. 83 K prvním pokusům byl vybrán lignan výrazně nepolární lignan wuweizisu C. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 t (min) % XAD-2 a WC kontrola Obr. 46.: Procentuální pokles absorbance wuweizisu C s amberlitem XAD-2 v závislosti na čase. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120 t (min) % XAD-7 a WC kontrola Obr. 47.: Procentuální pokles absorbance wuweizisu C s amberlitem XAD-7 v závislosti na čase Jak je vidět na obrázcích 46 a 47, je wuweizisu C dobře adsorbován na oba typy amberlitů. V obou případech je pokles absorbance o více jak 80 %, což dokazuje, že amberlit lignan na sebe adsorbuje. Tento pokus byl proveden i se zbývajícími standardy pokles absorbance je vidět na obrázcích 48 a 50. Dále byl tento pokus proveden i s polovičním množstvím amberlitu (6,25 mg). 84 4.3.1 Adsorbce lignanů na Amberlite XAD-2 0,0 40,0 80,0 120,0 0 40 80 120 t (min) % Obr. 48.: Procentuální pokles absorbance v závislosti na čase u deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C s 12,5 mg amberlitu XAD-2 v čase 120 minut (modrá ­ deoxyschizandrinu, fialová gomisin N, wuweizisu C ­ zelená), (n=5) 0 40 80 120 0 40 80 120 t (min) % Obr. 49.: Procentuální pokles absorbance v závislosti na čase u deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C s 6,25 mg amberlitu XAD-2 v čase 120 minut (modrá ­ deoxyschizandrinu, fialová gomisin N, wuweizisu C ­ zelená), (n=5) 85 4.3.2 Adsorbce lignanů na Amberlite XAD-7 0,0 40,0 80,0 120,0 0 40 80 120 t (min) % Obr. 50.: Procentuální pokles absorbance v závislosti na čase u deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C s 12,5 mg amberlitu XAD-7 v čase 120 minut (modrá ­ deoxyschizandrin, fialová gomisin N, zelená ­ wuweizisu C), (n=5) 0 40 80 120 0 40 80 120 t (min) % Obr 51.: Procentuální pokles absorbance v závislosti na čase u deoxyschizandrinu, gomisinu N a wuweizisu C s 6,25 mg amberlitu XAD-7 v čase 120 minut (modrá ­ deoxyschizandrin, fialová gomisin N, zelená ­ wuweizisu C), (n=5) Z výsledků vyplývá, že amberlit XAD-2 je schopen v množství 6,25 mg vázat 50 g deoxyschizandrinu ze 77 %, gomisinu N z 75,9 % a wuweizisu C z 80 %, viz. obrázek 49. Amberlit XAD-7 je schopen adsorbovat v tomto množství u lignanu deoxyschizandrinu pouze 30 % (Obr. 51) a u gomisinu N pouze 65,7 % přítomných lignanů. Naopak 12,5 mg amberlitu XAD-7 váže nepolární wuweizisu ze 100 % (Obr. 50). 86 Polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 a XAD-7 suspendovány v 50% roztoku methanolu jsou schopny za daných podmínek adsorbovat přibližně 80 % lignanů v roztoku. To vede k teoretické domněnce, že kdyby byly tyto adsorbenty přidány do média pro kultivaci kultur, mohly by lignany naadsorbovat a potenciálně tak buněčnou kulturu donutit v důsledku nedostatku sekundárních metabolitů zahájit jejich syntézu de novo. 4.4 Analýza obsahu lignanů v tkáňových kulturách S. chinensis 4.4.1 Elicitační faktory a sledování jejich vlivu na zvýšení produkce sekundárních metabolitů K embryogenním kulturám S. chinensis byly na Mendlově lesnické a zemědělské univerzitě v Brně (MZLU) přidány elicitory polyaminy ­ putrescin, spermidin a spermin v koncentracích (od 250 ­ 750 mg/l). Po 14 dnech kultivace byly tyto kultury lyofilizovány, zváženy a byl stanoven obsah lignanů v sušině pomocí námi zavedené a optimalizované metody extrakce, SPE extrakce a HPLC analýzy ­ experimentální část 3.2.2 a 3.2.3. Kalusové kultury S. chinensis byly kultivovány týmem spolupracovníků pod vedením Ing. Heleny Vlašínové, Ph.D. Výsledky byly přepočítány na obsah lignanů v 50 g kultury (Tab. 31). Tab. 31.: Vliv polyaminu putrescinu (Put), sperminu (Spm) a spermidinu (Spd) v koncentracích (250 ­ 750 mg/l) na produkci jednotlivých lignanů v embryogenním kalusu S. chinensis, kontrola kultivace bez polyaminů, SCH - schizandrin, GA - gomisin A, DS - deoxyschizandrin,GN - gomisin N, WC - wuweizisu C, SUMA - součet hmotnosti všech detekovaných lignanů SCH GA DS GN WC SUMA elicitor vzorek g g g g g g kontrola PA-1 0 0 0 0 0 0 PA-3 0 0 0,05 0 0 0,05 PA-7 0 0 0,10 0 0 0,10 PA-9 0 0 0,04 0,12 0 0,16 Put 250 PA-12 0 0 0 0,11 0 0,11 PA-14 0 0 0 0,11 0 0,11 PA-15 0 0 0,60 0,13 0 0,19 Put 500 PA-16 0 0 0,08 0,39 0 0,46 PA-17 0,01 0 0,06 0,25 0 0,31 PA-18 0 0 0,09 0,32 0 0,41 Put 750 PA-21 0,03 0 0 0 0 0 PA-23 0 0 0,10 0 0 0,10 Spd 250 PA-28 0 0 0 0 0 0 PA-27 0 0 0,27 0,14 0 0,27 Spd 750 PA-35 0 0 0 0 0 0 PA-34 0 0 0 0 0 0 PA-33 0 0 0 0,09 0 0,09 Spm 250 PA-36 0 0 0 0 0 0 PA-37 0 0 0 0 0 0 PA-38 0 0 0 0 0 0 87 PA-1 PA-3 PA-7 PA-9 PA-12 PA-14 PA-15 PA-16 PA-17 PA-18 PA-21 PA-23 PA-28 PA-27 PA-35 PA-34 PA-33 PA-36 PA-37 PA-38 schizandrin gomisinA deoxyschizandringomisinN wuweizisu C 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 g Obr. 52.: Celkový obsah lignanů v 50 g kultury pod vlivem polyaminů putrescinu a spermidinu, sperminu v koncentracích (250 ­ 750 mg/l, ), žlutá ­ schizandrin, fialová ­ gomisin A, modrá ­ deoxyschizandrin, oranžová ­ gomisin N, červená ­ wuweizisu C) Z výsledků vyplývá, že polyamin putrescin přidaný do média v koncentraci 250 mg/l významně zvýšil obsah deoxyschizandrinu více jak 6krát (Obr. 52) a v koncentraci 500 mg/l zvýšil obsah gomisinu N přibližně 3krát, aniž by došlo k ovlivnění obsahu ostatních lignanů a růstu kultury. Opačný byl účinek putrescinu o koncentraci 750 mg/l, při této koncentraci došlo k poklesu obsahu všech lignanů včetně gomisinu N (i proti kontrole kultivované bez polyaminu). Přídavek polyaminů spermidinu v koncentraci 250, 750 mg/l a sperminu v koncentraci 250 mg/l neovlivnil obsah lignanů. 4.4.2 Studium účinnosti adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice Při vyhodnocování působení elicitorů na buněčnou kulturu S. chinensis bylo prokázáno, že lignany jsou v malém množství uvolňovány do kultivačního média. To vedlo k myšlence přidat do média určeného pro kultivaci buněk S. chinensis určitý typ adsorbentu ­ polymerní pryskyřice a pozorovat, zda budou schopny na svůj povrch navázat nepolární lignany a zda bude kultura po odejmutí lignanů syntetizovat nové množství sekundárního metabolitu. K tomuto pokusu byly vybrány tři embryogenní linie kultur LA58, LA4 a LA52 kultivované na MZLU a dvě polymerní pryskyřice nepolární Amberlite XAD-2 a středně polární Amberlite XAD-7 postup kultivace, viz. 3.2.1. 88 * Linie LA58 Embryogenní linie LA58 byla rozdělena podle proměnlivého zbarvení kultury od nejsvětlejší části, která je označena číslem 1, přes středně tmavou část ­ 2, po nejtmavší část ­ 3. Snahou tohoto dělení bylo zjistit, zda se v odlišném zabarvení, způsobeném pravděpodobně bakteriální infekcí, nevyskytují rozdíly v obsahu lignanů. Kultury byly kultivovány na neředěném médiu (Tab. 32) a na dvakrát zředěném médiu (Tab. 33). Tab. 32.: Rozdíl obsahu lignanů v g ve vzorcích kultury linie LA58 (neředěné médium) 1-3 zabarvení kultury od světlé po hnědou, SCH -schizandrin, GA - gomisin A, DS - deoxyschizandrin, SUMA - součet hmotnosti všech detekovaných lignanů, obsah lignanů v g je přepočítán na celkovou hmotnost kultury hmotnost SCH GA DS SUMA LA58 mg g g g g 1kontrolní kultura 52,54 0,16 0,05 0,05 0,26 1kultura s XAD-2 47,93 0,05 0 0 0,05 1kultura s XAD-7 39,71 0,04 0,04 0 0,08 2 kontrolní kultura 69,02 0 0,41 0,28 0,69 2 kultura s XAD-2 49,6 0,05 0,05 0,25 0,35 2 kultura s XAD-7 25,29 0 0 0 0 3 kontrolní kultura 57,87 0,35 0,17 0 0,52 3 kultura s XAD-2 31,26 0,06 0 0 0,06 3 kultura s XAD-7 36,19 0,04 0 0 0,04 Hmotnost ­ celková hmotnost sušiny kultury po kultivaci v mg Tab. 33.: Rozdíl obsahu lignanů v g ve vzorcích embryogenní linie LA58 (dvakrát ředěné médium), 1-3 zabarvení kultury od světlé po hnědou, SCH-schizandrin, GA-gomisin A, SUMA-hmotnost všech detekovaných lignanů. hmotnost SCH GA SUMA LA58 mg g g g 1kontrolní kultura 46,04 0,05 0 0,05 1kultura s XAD-2 45,17 0 0 0 1kultura s XAD-7 25,25 0 0 0 2 kontrolní kultura 49,85 0,05 0,05 0,10 2 kultura s XAD-2 40,04 0 0 0 2 kultura s XAD-7 44,5 0,04 0,04 0,18 3 kontrolní kultura 61,46 0,06 0 0,06 3 kultura s XAD-2 53,91 0 0 0 3 kultura s XAD-7 24,03 0,02 0 0,02 89 1kontrola 1XAD-2 1XAD-7 2kontrola 2XAD-2 2XAD-7 3kontrola 3XAD-2 3-XAD-7 schizandrin gomisin A deoxy schizandrin 0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5 g Obr. 53.: Obsah lignanů schizandrinu, gomisinu A, deoxyschizandrinu v kultuře LA58 (neředěné médium) v kontrolní linii a s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD-2, 1 - světlá kultura, 2 - středně světla kultura, 3 - tmavá část kultury 1kontrola 1XAD-2 1XAD-7 2kontrola 2XAD-2 2XAD-7 3kontrola 3XAD-2 3-XAD-7 schizandrin gomisin A 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 g Obr. 54.: Obsah lignanů schizandrinu, gomisinu A ve vzorcích kultury LA58 (dvakrát ředěné médium) v kontrolní linii a s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD-2, 1 - světlá kultura, 2 - středně světla kultura, 3 - tmavá část kultury V kultuře LA58 (neředěné médium) byly detekovány pouze lignany gomisin A, schizandrin a deoxyschizandrin. V linii LA58 (dvakrát ředěné médium) byl detekován pouze schizandrin a gomisin A. Ve vzorcích kontrolních kultur bylo třikrát až čtyřikrát více lignanů, než v kulturách inkubovaných s přídavkem polymerních pryskyřic, což naznačuje, že většina lignanů ve vzorcích s amberlity by mohla být převedena do extracelulárního prostředí 90 navázáním na amberlity. Z obrázků 53 a 54 je vidět, že není rozdíl v obsahu mezi barevností kultury a obsahem lignanů. Proto nebyly další linie kultur děleny podle barvy. Po dvojitém zředění média obsah lignanů klesl v některých případech až 10krát, viz. obrázek 54 a tabulka Tab. 33. Je to viditelné zvláště u vzorků kontrol. V následujících tabulkách Tab. 34 a 35 je uveden celkový obsah lignanů vyprodukovaných kulturou LA58 kultivovanou na neředěném i ředěném médiu (celkový obsah lignanů = kultura K + amberlit A + médium M). Tab. 34.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LA58, neředěné médium Lignany: SCH - schizandrin, GA - gomisin A, DS - deoxyschizandrin, GN - gomisin N, WCwuweizisu C, SUMA - součet hmotnosti všech detekovaných lignanů, obsah lignanů v g je přepočítán na celkovou hmotnost kultury hmotnost SCH GA DS GN WC SUMApřídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g kultura 179,43 0,5 0,6 0,3 0 0 1,4kontrola médium 0 0 0 0 0 0 kultura 128,79 0,2 0,1 0,3 0 0 0,6 médium 0 0 0 0,2 0 0,2 XAD-2 XAD-2 1,2 9,6 9,8 0,8 24,1 45,5 kultura 101,19 0,1 0 0 0 0 0,1 médium 0 0,1 0,1 0,7 0,1 1 XAD-7 XAD-7 2,5 2,9 1,7 2,5 115,1 124,7 Tab. 35.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LA58, dvakrát ředěné médium hmotnost SCH GA DS GN WC SUMApřídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g kultura 157,35 0,2 0,1 0 0 0 0,3kontrola médium 0 0 0 0 0,1 0,1 kultura 139,12 0 0 0 0 0 0 médium 0 0 0 0 0,2 0,2 XAD-2 XAD-2 0,5 0,6 1,9 0,2 2,9 6,1 kultura 93,78 0,1 0 0 0,1 0 0,2 médium 0 0 0 0,1 0,4 0,5 XAD-7 XAD-7 2,8 0,6 1,1 0 11,8 16,3 91 SchK0 SchK2 SchK7 SchA2 SchA7 SchM0 SchM2 SchM7 schizandrin gomisin A deoxy schizandrin gomisin N wuweizisu C 0 20 40 60 80 100 120 g Obr. 55.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii v linii kultury LA52, kontrolní kultura (SchK0) a kultura s přídavkem amberlitu XAD-7, XAD-2 (SchK2, SchK7), amberlity (SchA2, SchA7) a média (SchM0, SchM2, SchM7) V celkovém součtu g vyprodukovaných lignanů se ukázalo, že bez přítomnosti polymerní pryskyřice buňky linie LA58 obsahovaly velmi malé množství lignanů cca 1,4 g oproti 126 g lignanů celkem u kultury s amberlitem XAD-7, viz. obrázek 55 a tabulka Tab. 34. Zásadním zjištěním je, že přídavek obou amberlitů ve srovnání s kontrolou výrazně zvyšoval produkci lignanů v testované kultuře. A tyto lignany byly z 95 % navázány na polymerní pryskyřici. U linie LA58 byl efekt mimořádný, množství celkových lignanů bylo 30 ­ 130krát větší oproti kontrole. U dvakrát zředěného média u linie LA58 byl celkový součet obsahu lignanů výrazně menší zhruba o 2/3. 95 % lignanů bylo také navázáno na amberlity jako u neředěného média, viz. tabulka Tab. 35. Vzorek kontrolní kultury bez amberlitu obsahoval minimální množství lignanů 0,3 g. 92 * Linie LA4 Tab. 36.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LA4, neředěné médium hmotnost SCH GA DS GN WC SUMApřídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g kultura 130,29 0,2 0,3 0,9 3,9 0,7 6,0kontrola médium 0 0 0 0,1 0,2 0,3 kultura 156,27 0,9 4,3 1,5 5,6 1,5 13,8 médium 0 0 0 0,3 0,1 0,4 XAD-2 XAD-2 0 0 37,5 0,5 3,4 41,4 kultura 162,12 1,1 3,7 2,0 7,4 2,25 16,4 médium 0 0 0 0 0,2 0,2 XAD-7 XAD-7 0 0 1,4 0,4 6,9 8,7 Tab. 37.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LA4, dvakrát ředěné médium hmotnost SCH GA DS GN WC SUMApřídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g kultura 159,67 0,1 1,9 0,8 3,5 0,6 6,9kontrola médium 0 0 0 0 0,3 0,3 kultura 139,96 0,3 0,2 0,8 2,9 0,9 5,1 médium 0 0 0 0 0,2 0,2 XAD-2 XAD-2 0,5 0 38 0,6 1,3 40,4 kultura 144,67 0,4 11,9 1 3,3 0,7 17,3 médium 0 0 0 0,1 0 0,1 XAD-7 XAD-7 1,1 0 0,3 0,5 2,4 4,3 93 SchK0 SchK2 SchK7 SchA2 SchA7 SchM0 SchM2 SchM7 schizandrin gomisin A deoxy schizandrin gomisin N wuweizisu C 0 5 10 15 20 25 30 35 g Obr. 56.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii v linii kultury LA4, kontrolní kultura (SchK0) a kultura s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD-2 (SchK2, SchK7), amberlity (SchA2, SchA7) a média (SchM0, SchM2, SchM7) Amberlit XAD-2 přidaný k LA4 byl účinnější ve zvýšení produkce lignanů především díky tomu, že zvyšoval produkci deoxyschizandrinu a to přibližně 40krát (Obr. 56). U linie LA4 byl stanoven vysoký obsah lignanů i v kontrolní kultuře celkově 6 g. V kulturách pod vlivem pryskyřic bylo také zjištěno zvýšené množství lignanů 13,8 g (XAD-2) a 16,4 g (XAD-7), viz. tabulka Tab. 36. To je rozdílné oproti linii LA58, která obsahovala malé množství lignanů v kulturách. U linie LA4 kultivované na dvakrát zředěném médiu došlo k výrazné adsorpci deoxyschizandrinu na amberlit XAD-2, viz. tabulka Tab. 37. 94 * Linie LA52 Tab. 38.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LA52, neředěné médium hmotnost SCH GA DS GN WC SUMApřídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g kultura 138,69 0,4 2,8 3,4 21,7 2,1 30,4kontrola médium 1,5 0,7 0,1 0,4 0,3 3 kultura 150,78 3 21,4 12,1 70,1 6,4 113 médium 0,1 0,3 0,4 0,2 0,4 1,4 XAD-2 XAD-2 0,1 0 36 0,8 5 41,9 kultura 131,05 0,9 13,7 9,7 56 4,1 84,4 médium 0 0 0,1 0,1 0,3 0,5 XAD-7 XAD-7 0,1 0 1,1 1,3 3,4 5,9 SchK0 SchK2 SchK7 SchA2 SchA7 SchM0 SchM2 SchM7 schizandrin gomisin A deoxy schizandrin gomisin N wuweizisu C 0 10 20 30 40 50 60 70 80 g Obr. 57.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii v linii kultury LA52, kontrolní kultura (SchK0) a kultura s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD- 2 (SchK2, SchK7), amberlity (SchA2, SchA7) a média (SchM0, SchM2, SchM7) Kultura LA52 obsahovala vysoké množství všech lignanů, především gomisinu N, který byl lokalizován převážně intracelulárně. V kulturách s amberlitem XAD-2 se oproti kontrole zvýšil obsah lignanů cca 5krát a v kulturách s amberlitem XAD-7 zhruba 2,7krát, což je podstatně méně než u ostatních linií. Na amberlitu bylo navázáno menší množství lignanů (vyjma deoxyschizandrinu) než u předchozích dvou buněčných linií. U linie LA52 nebyl založen pokus s dvakrát zředěným médiem. 95 V následujících tabulkách Tab. 39 ­ 41 je stanoveno množství lignanů vyskytujících se intracelulárně, tj. v kultuře. Toto množství je zvýšené zejména u kontrol, které neobsahovaly přidané amberlity k médiu. Dále je zde zmíněn celkový extracelulární výskyt lignanů (amberlit + médium) Tab. 39.: Extracelulární a intracelulární rozložení lignanů v linii kultury LA58 Lignany: SCH - schizandrin, GA - gomisin A, DS - deoxyschizandrin,GN - gomisin N, WC - wuweizisu C, SUMA - součet hmotnosti všech detekovaných lignanů SCH GA DS GN WC SUMA kultura podmínky g g g g g g kontrola intra 0,5 0,6 0,3 0 0 1,4 XAD-2 intra 0,2 0,1 0,3 0 0 0,6 XAD-7 intra 0,1 0,1 0 0 0 0,2 kontrola extra 0 0 0 0 0 0 XAD-2 extra 1,2 9,6 9,8 0,9 24,2 45,7 LA58 neředěné médium XAD-7 extra 2,5 3 1,8 3,2 115,1 125,6 kontrola intra 0,2 0,1 0 0 0 0,3 XAD-2 intra 0 0 0 0 0 0 XAD-7 intra 0,1 0,1 0 0,2 0 0,4 kontrola extra 0 0 0 0 0,1 0,1 XAD-2 extra 0,5 0,6 1,9 0,2 3,1 6,3 LA58 dvakrát ředěné médium XAD-7- extra 2,8 0,6 1,1 0,1 12,3 16,9 Z tabulky Tab. 39 je vidět, že zhruba 95 % všech lignanů je vázáno extracelulárně. Amberlit XAD-7 zvyšoval podíl extracelulárního deoxyschizandrinu mnohem méně než amberlit XAD-2. Přídavek obou pryskyřic zvyšoval podíl extracelulárního wuweizisu C. XAD-7 zvýšil množství wuweizisu C na 115,11 g oproti 0 g stanovených u kontroly. Tab. 40.: Extracelulární a intracelulární rozložení lignanů v linii kultury LA4 SCH GA DS GN WC SUMA kultura podmínky g g g g g g kontrola intra 0,3 0,4 1,1 5,1 0,9 7,8 XAD-2 intra 0,9 4,3 1,5 5,9 1,5 14,1 XAD-7 intra 1,2 4,2 2,3 8,4 2,6 18,7 kontrola extra 0 0 0 0,1 0,2 0,3 XAD-2 extra 0 0 36 0,8 3,5 41,8 LA4 neředěné médium XAD-7- extra 0,1 0 1,4 0,5 7,2 9,2 kontrola intra 0,1 1,8 0,8 3,4 0,6 6,7 XAD-2 intra 0,2 0,2 0,8 2,7 0,8 4,7 XAD-7 intra 0,6 18,7 1,5 5,1 1,2 27,1 kontrola extra 0 0 0 0 0,3 0,3 XAD-2 extra 0,6 0 38 0,6 1,6 40,8 LA4 dvakrát zředěné médium XAD-7 extra 1,1 0 0,3 0,6 2,4 4,4 96 Přídavek amberlitu XAD-2 do kultivačního média linie LA4 výrazně zvýšil podíl extracelulárních lignanů. Celkově bylo lokalizováno 41,8 g extracelulárně a 14,1 g intracelulárně. Amberlit XAD-7 nebyl tak účinný ve zvýšení podílu extracelulárních lignanů, extracelulárně bylo vázáno jen 9,2 g celkových lignanů, což je zhruba polovina oproti intracelulárně vázaným lignanům v kultuře, viz. tabulka Tab. 40. V kontrolním vzorku se extracelulárně vyskytovalo minimální množství lignanů. U linie LA4 byl podíl extracelulárního deoxyschizandrinu v přítomnosti amberlitu XAD-7 ­ 1,4 g, mnohem menší než v přítomnosti amberlitu XAD-2 ­ 37,5 g. Tab. 41.: Extracelulární a intracelulární rozložení lignanů v linii kultury LA52 SCH GA DS GN WC SUMA kultura podmínky g g g g g g kontrola intra 0,4 3,1 3,7 23,6 2,2 33 XAD-2 intra 3,7 25,9 14,6 84,8 7,7 136,7 XAD-7 intra 1,1 16,4 11,5 66,7 4,9 100,6 kontrola extra 1,5 0,7 0,1 0,4 0,3 3 XAD-2 extra 0,1 0,3 36,4 1 5,4 43,2 LA52 neředěné médium XAD-7 extra 0,1 0 1,2 1,4 3,7 6,4 U linie LA52 nedocházelo k výraznému zvýšení obsahu extracelulárních lignanů vlivem přídavku amberlitů XAD-2 a XAD-7. Byl stanoven vysoký obsah intracelulárních lignanů 136,7 g v kultuře s přídavkem XAD-2, 100,6 g v kultuře s přídavkem XAD-7 oproti liniím LA58 a LA4. Deoxyschizandrin tvoří 86 ­ 94 % lignanů vázaných na amberlit XAD-2 u kultury buněk LA4 a LA52, což je znatelně více než jeho zastoupení v buňkách kultivovaných bez přídavku amberlitu. Podobně amberlit XAD-7 je schopen v liniích buněk LA4 a LA52 zvýšit produkci především lignanu wuweizisu C. * Linie LAT10 a LATI Dále byl stanoven obsah lignanů v linii LAT10 a LATI. K těmto liniím byly také přidány polymerní pryskyřice XAD-2 a XAD-7. Opět oba amberlity zvyšují produkci lignanu buňkami kultur, což je v souladu s předchozími liniemi LA58, LA4 a LA52. Nepolární amberlit XAD-2 byl ve zvýšení produkce lignanů účinnější (až 4krát), než středně nepolární amberlit XAD-7. U kultury LAT10 amberlit XAD-7 způsobil dokonce pokles produkce lignanů o 60 % vůči kontrole. 97 Tab. 42.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LAT10, neředěné médium Lignany: SCH-schizandrin, GA-gomisin A, DS-deoxyschizandrin, GN-gomisin N, WC-wuweizisu C, SUMA- součet hmotnosti všech detekovaných lignanů hmotnost SCH GA DS GSCH GN WC SUMA přídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g g kultura 110,74 0,5 0,6 0,2 7,9 36,8 0,1 45,6 kontrola médium 0,7 0,2 0 0,5 0,2 0 0,9 kultura 103,13 2,6 1,3 13,7 36,3 13,4 0,8 65,5 médium 0,2 0,2 0,2 0,5 0,4 0 1,3 XAD-2 XAD-2 1,6 0,3 17,3 1,5 1,4 0 20,5 kultura 16,65 0,1 0 0,2 4,3 1,5 0,2 6,2 médium 0,2 0,2 0,1 0,6 0,5 0,5 1,9 XAD-7 XAD-7 2,8 0,7 7,6 0,7 0 0,3 9,3 K0 K2 K7 A2 A7 M0 M2 M7 schizandrin gomisin A deoxyschizandrin gama-schiznadrin gomisin N wuweizisu C 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 ug Obr. 58.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii v linii kultury LAT10 ,kontrolní kultura (K0) a kultura s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD-2 (K2, K7), amberlity (A2, A7) a média (M0, M2, M7) Buňky kultury LAT10 obsahují při kultivaci bez amberlitů převážně -schizandrin a gomisin N. V kultuře LAT10 byla obsažena vysoká množství lignanů, zejména gomisinu N 36,8 g, viz. tabulka 42. Extracelulárně se vyskytuje jen zvýšené množství deoxyschizandrinu naadsorbované na amberlitu XAD-2. 98 Tab. 43.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii kultury LATI, neředěné médium Lignany: SCH-schizandrin, GA-gomisin A, DS-deoxyschizandrin, GN-gomisin N, WC-wuweizisu C, SUMA-součet hmotnosti všech detekovaných lignanů hmotnost SCH GA DS GSCH GN WC SUMA přídavek adsorbentu vzorek mg g g g g g g g kultura 141,7 0,1 0 0,1 2,9 0,9 0,8 4,7 kontrola médium 0,1 0,1 0,2 0,9 0,6 0,1 1,9 kultura 135,41 0,1 0,1 0,5 8,7 7,2 0 16,5 médium 0,1 0,1 0,1 0,3 0,2 0 0,7 XAD-2 XAD-2 1,3 0,7 30,6 4,8 1,4 0 37,5 kultura 17,58 0 0,1 0,1 5,5 1,3 0 7 médium 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,1 0,8 XAD-7 XAD-7 2,5 0,3 20,9 1 0 0 22,2 K0 K2 K7 A2 A7 M0 M2 M7 schizandrin gomisin A deoxy schizandrin gama-schizandrin gomisin N wuweizisu C 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 g Obr. 59.: Vliv přídavku amberlitu XAD-2 a XAD-7 na obsah lignanů v kultuře, mediu a amberlitech v linii v linii kultury LATI ,kontrolní kultura (K0) a kultura s přídavkem amberlitu XAD-7 a XAD-2 (K2, K7), amberlity (A2, A7) a média (M0, M2, M7) V pokusu s linií LATI (Tab. 43) bylo zaznamenáno, že oba amberlity zvýšily zejména produkci deoxyschizandrinu, amberlit XAD-2 až 300krát. Amberlit XAD-7 byl přibližně dvakrát méně účinnější v produkci deoxyschizandrinu, konkrétně celkový obsah lignanu deoxyschizandrinu vyprodukovaný kulturou LATI s přídavkem XAD-2 byl 31,2 g. U kontrolní kultury byl celkový obsah deoxyschizandrinu pouze 0,3 g (amberlit + médium). Kultura LATI s přídavkem XAD-7 vyprodukovala celkem 21,2 g lignanů oproti 0,3 g 99 kontrolní kultury bez amberlitu. Kultura LATI obsahovala výrazně nižší množství -schizandrinu (2,9 g) a gomisinu N (0,9 g) než linie LAT10. 4.4.3 Vliv adsorpce lignanů na povrch raftů a kultivačních nádob Média obvykle obsahují nízká množství lignanů. Výjimku tvořily kultury LA52 a LAT10. Lignany z média by se mohly adsorbovat i na další povrchy, nejenom na amberlity. V následující linii kultur LA54 byl stanoven obsah lignanů nejen v kultuře, na amberlitech a v médiu, ale také i na raftech a v plastových kultivačních nádobách s cílem zjistit, zda nedochází k adsorpci lignanů i na tyto plochy. Proto byl navržen následující postup extrakce z kultivačních nádob: 100 ml methanolu bylo ponecháno 24 hodin v nádobě. Do naplněné nádoby byl ponořen raft. Kultivační nádoba s methanolem byla na 5 minut ponořena do ultrazvukové lázně a následně byl methanol odpařen na vakuové odparce. Získaný odparek byl podroben HPLC analýze. 100 Tab. 44.: Obsah lignanů v g u kultury LA54 Lignany: SCH - schizandrin, GA - gomisin A, DS - deoxyschizandrin,GSCH - -schizandrin, GN - gomisin N, WC - wuweizisu C, SUMA - součet hmotnosti všech detekovaných lignanů, dny ­ délka kultivace 7- 21 dní, nádoba ­ obsah lignanů extrahovaný z raftů + kultivačních nádob SCH GA DS GSCH GN WC C SUMA vzorek dny g g g g g g g kultura 3 7 1,5 0,2 64,2 0,8 3,6 0 65,4 médium 3 7 0 0,1 0 0 0 0 0,1 nádoba 3 7 0,3 0,2 21,0 0 0 0 21,5 kultura 4 7 0,4 0,1 0,4 2,3 5,6 0,6 9,4 kultura 5 14 3,8 0,6 1,9 0 1,9 0 8,2 kultura 6 14 0,6 0 0 0,2 0,3 0,2 1,4 kultura 7 21 1,8 0 0 45,5 0 0 47,3 médium 7 21 0 0,1 0 0 0,1 0 0,1 nádoba 7 21 3,8 1,0 36,3 0 0 0 41,0 kultura 29 7 9,8 0,5 1,4 5,9 1,1 0 18,7 média 7 0,1 0,1 0 0 0,2 0 0,4 XAD-2 7 0,3 0,4 10,9 0 0 0 11,5 kultura 30 7 3,2 0,7 6,4 1,6 0,9 2,2 15,0 média 7 0 0 0 0 0 0 0,1 XAD-2 7 0,2 0,7 16,9 0 0 0 17,9 kultura 31 14 3,0 2,6 0 0,2 0 0 5,8 média 14 0,2 0,1 0 0,1 0,5 0 0,7 XAD-2 14 0,2 0 32,7 0 0,3 0 33,2 kultura 32 14 0,1 2,7 9,6 40,6 78,4 0,2 131,6 média 14 0,1 0,1 0 0 0,1 0 0,3 XAD-2 14 0,3 0 29,3 0 0 0 29,6 nádoba 14 0,1 0,1 1,3 0 0 0 1,4 kultura 37 7 0,2 0,2 7,0 0 0 0 7,5 média 7 0 0 0 0,2 0 0 0,3 XAD-7 7 0 0 0,3 0 0 0 0,3 kultura 38 7 0,3 0 3,5 0 0 0 3,8 média 7 0 0,1 0 0 0,1 0 0,2 XAD-7 7 0 0,1 0,5 0 0,1 0 0,7 nádoba 7 4,7 7,1 4,2 0 0 0 16,0 kultura 41 21 12,1 0,6 2,5 4,8 98,1 0 118,1 média 21 0 0 0 0 0,2 0 0,3 kultura 42 21 1,8 0,8 0,2 5,7 3,5 0 12,0 média 21 0 0 0 0 0 0 0 kultura 43 14 1,4 0,8 0,2 0,8 0,2 1,5 4,8 média 14 0,1 0,1 0 0,1 0,1 0 0,4 kultura 44 14 1,2 1,9 0 3,9 0 0 7,0 média 14 0 0 0 0,1 0,1 0 0,2 101 Množství deoxyschizandrinu bylo u vzorků 31 a 32 po 14 dnech cca 30 g, což se shoduje s předchozími pokusy z linií LA58, LAT10. Po 7 dnech bylo množství deoxyschizandrinu přibližně poloviční 11 ­ 17 g, v tabulce je to vidět u kultur 29 a 30. Amberlit XAD-7 v těchto pokusech neadsorboval wuweizisu C. Tento výsledek je v souladu s minulými pokusy s liniemi LAT10 a LATI, ale rozdílný od prvních pokusů s amberlity (LA58, LA4 a LA52), kde na XAD-7 byl nalezen wuweizisu C ve zvýšeném množství. U vzorků 3 a 7 bez amberlitu se nachází stejně velké množství deoxyschizandrinu na kultivačních nádobách a raftech (21 a 36 g), které odpovídá množství nalezeného deoxyschizandrinu adsorbovaného na XAD-2 u vzorku 30 a 32 (11 ­ 33 g). U vzorků 41 až 44, které rovněž neobsahovaly žádný amberlit, byl obsah deoxyschizandrinu na kultivačních nádobách zanedbatelný (do 0,1 g). Na raftech a plastových nádobách lze nalézt lignany, ale neadsorbují podstatná množství lignanů (deoxyschizandrinu) jak je vidět z vzorků 3, 41 a 42, na raftech a nádobách je pouze 0,2 ­ 3,2 % všech lignanů, u vzorků 43 a 44 je na raftech a nádobách 13 a 26 % lignanů. 102 5 DISKUZE Prvním cílem této disertační práce bylo optimalizovat, zpřesnit a rozšířit metodu extrakce a stanovení lignanů v kulturách Schisandra chinensis in vitro pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Za hlavní účinné látky jsou z terapeutického hlediska pokládány dibenzo[a,c]cyklooktadienové lignany. Lignany jsou látky s širokým spektrem biologických účinků a samotná rostlina je pro své léčivé účinky již po staletí užívána v tradiční čínské medicíně. Metoda stanovení lignanů byla optimalizována v následujících krocích: výběr extrakčního rozpouštědla, zakoncentrování a přečistění lignanů pomocí extrakce na pevnou fázi (SPE), složení mobilní fáze pro HPLC analýzu, kalibrace HPLC a jiné. Prvním krokem optimalizace metody stanovení lignanů byl výběr extrakčního rozpouštědla. K extrakci lignanů z rostlinného materiálu bylo vybráno několik organických rozpouštědel s ohledem na fyzikálně-chemické vlastnosti lignanů ­ aceton, chloroform, ethylacetát, acetonitril a methanol. Nejvhodnějšími rozpouštědly se jevily ethylacetát a methanol, neboť poskytovaly nejvyšší výtěžky extraktů (32,2 % a 33 % původní hmotnosti extrahované drogy). Pro zjištění, zda droga již neobsahuje žádné lignany látky, byl rostlinný materiál reextrahován methanolem, viz. Tab. 22. Z těchto dvou rozpouštědel ethylacetátu a methanolu jsme pro extrakci dodaného materiálu (kultury, média, amberlity i rostlinný materiál) vybrali methanol. Methanol jako jediné rozpouštědlo obsahoval nejmenší hmotnost lignanů v doextrahovaném zbytku a nejvyšší hmotnost lignanů při první extrakci. Vzhledem k vyextrahování dalších látek kromě lignanů je však methanol rozpouštědlem málo selektivním a vzorek musí být dále přečištěn. Dalším krokem optimalizace metody byla preseparace - příprava vzorku pro HPLC analýzu. Extrakce rostlinného materiálu organickým rozpouštědlem vede k situaci, kdy se do vzorku připraveného na HPLC analýzu dostávají ve velkém množství i látky polárního charakteru. Tyto látky by mohli rušit stanovení lignanů s hydroxylovou skupinou - schizandrinu a gomisinu A. Tento problém byl vyřešen užitím metody extrakce na pevnou fázi (SPE). Na kolonu Strata C-18 byl nanesen methanolový extrakt kultury rozpuštěný ve 2 ml 10% vodného roztoku methanolu. Kolona byla promyta 2 ml 40% roztoku vodného methanolu. Obě frakce byly zachyceny, odpařeny do sucha a zanalyzovány HPLC metodou. V obou frakcích byly stanoveny pouze polární látky (Obr. 29, 30), lignany byly kompletně eluovány až při použití 103 100% methanolu (Obr. 31). Ve třech procentech původní hmotnosti je zkoncentrováno na 99,5 % všech lignanů z vzorku kultury připravených k HLPC analýze. Jako mobilní fáze pro separaci lignanů na koloně Chromolith Performance RP ­ 18e (Merck) byly nakonec vybrány dvě mobilní fáze. První mobilní fází byl vybrán 50% acetonitril (50 : 50 obj. %). Počet teoretických pater kolony N a rozlišení Rs mezi píky -schizandrinu a gomisinu N, které jsou izomery, je při použití námi zvolené mobilní fáze nejvyšší, viz. tabulka Tab. 21. Druhou nejlepší mobilní fází je 66 % methanol. Asymetrie píku se nejvíce blíží k jedné, rozlišení Rs píků -schizandrinu a gomisinu N je 1,54, viz. tabulka Tab. 18. Na základě posouzení těchto chromatografických parametrů jednotlivých lignanů byl pro analýzu vzorků kultur vybrán 50% acetonitril. Díky využití monolitické kolony, jejíž výhodou je možnost použití vyššího průtoku, byl průtok mobilní fáze zvýšen z obvyklého 1 ml/min na 2 ml/min a čas analýzy byl tímto značně zkrácen, a to pod 20 minut, což je zhruba dvakrát méně než u doposud publikovaných prací zabývajících se stanovením lignanů pomocí RP-HPLC. Avula a spol. 115 a Huang a spol. 116 dosáhli při stanovení lignanů retenčního času 40 minut a Bártlová a spol. 117 60 minut. He a spol. 118 dosáhli při stanovení lignanů retenčního času 20 minut, ovšem s publikovaného chromatogramu je zjevné, že dochází k velké koeluci píků. Lignany byly kvantifikovány při vlnové délce 220 nm, která odpovídá absorpčnímu maximu dibenzocyklooktadienových lignanů a při které je detekce lignanů nejcitlivější. Kvalita separace látek při HPLC analýze závisí na složení rozpouštědla, ve kterém je vzorek rozpuštěn. Proto byla testována různá složení rozpouštědla. Vzorek lignanů k nástřiku byl rozpuštěn v deionizované vodě, 10%, 20%, 40%, 60%, 80% vodných roztocích methanolu a v methanolu. Nejlepšího rozdělení lignanů bylo dosaženo při použití 60 ­ 80% methanolu. Pro nástřik vzorku na HPLC bylo zvoleno rozpuštění vzorku v 80% methanolu, protože v při tomto ředění vzorku dochází k lepší rozpustnosti nepolární lignanů. Pro zhodnocení celkové návratnosti lignanů v těchto krocích ­ extrakce rostlinného materiálu, preseparace vzorků pomocí SPE a HPLC analýzy, bylo využito stanovení pomocí analýzy vzorků připravených přidáním definovaného množství standardů lignanů k listům Cynara cardunculus. Tyto listy lignany ani jiné obdobné nepolární látky, které by mohly být zaměnitelné neobsahují. Pak byl proveden celý postup stanovení lignanů: extrakce vzorku methanolem, následně extrakce na tuhou fázi a HPLC analýza. Tímto postupem stanovená návratnost schizandrinu byla 98,1 5,5 %, gomisinu A 101,4 2,8 %, deoxyschizandrinu 98,2 4,2 %, -schizandrinu 93,1 3,1 %, gomisinu N 93,5 3 % a u wuweizisu C 89,9 7 % , viz. tabulka Tab. 30. Nejmenší návratnost 89,9 % wuweizisu C může být příčinou toho, 104 že je z analyzovaných lignanů nejvíce nepolární a pravděpodobně se nejvíce váže i na další povrchy během celého postupu analýzy např. na mikrozkumavky typu Eppendorf, stěny Erlenmayerových baněk a jiné. Pro tuto vypracovanou metodu stanovení lignanů S. chinensis pomocí HPLC byl stanoven způsob kalibrace pomocí externích standardů. Kalibrační přímka (y = ac + b) byla zkonstruována proložením plochy píku (y) a koncentrace kalibračního roztoku lignanu (c). Výsledky byly posuzovány metodou lineární regrese s faktorem 1/c2 . Tato metoda byla vybrána, protože poskytuje větší přesnost. Umožňuje proložení kalibrační přímky kalibračními body i při velmi nízkých koncentracích u standardních roztoků. Tyto nízké koncentrace se ve stejných řádech objevují i ve zkoumaných vzorcích tkáňových kultur S. chinensis. Korelační koeficient (R2 ) byl u všech kalibrovaných lignanů větší než 0,999, což indikuje velmi dobrou linearitu ve zkoušeném koncentračním rozpětí. Byly stanoveny parametry chromatografické analýzy jako jsou retenční čas (tr), počet teoretických pater (N), kapacitní faktor (k), rozlišení (Rs) a asymetrie píků (As), viz. tabulka Tab. 25. Zdá se, že počet teoretických pater kolony (3200 ­ 5700) je závislý na retenčním čase tr lignanů, neboť s retenčním časem vzrůstá. Počet teoretických pater byl vyšší, než v předešlých publikovaných pracích na monolitické koloně. Novaková, a spol. 119 stanovili pro ketoprofen a estrogel počet teoretických pater (810 ­ 3710), Hashem a spol. 120 pro kortikosteroidy (1510 ­ 2700). Námi popsaná metoda stanovení lignanů má spodní mez stanovitelnosti (LLOQ) 0,1 mg/l pro schizandrin a gomisin A, 0,3 mg/l pro deoxyschizandrin, -schizandrin a gomisin N a 1 mg/l pro wuweizisu C (Tab. 26). Halstead a spol. 121 publikovali metodu stanovení lignanů RP-HPLC s DAD detekcí. Uvádějí korelační faktor také 0,999, limit detekce byl v rozmezí 0,41 ­ 1,89 mg/l a návratnost 92,2 až 104 %. Doba analýzy trvala ovšem 45 minut a tato metoda byla validována pouze pro schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin a -schizandrin. Avula a spol. 122 pro svoji metodu stanovení lignanů S. chinensis pomocí RP-HPLC s UV detekcí uvedli hodnoty limitu detekce 0,2 ­ 1,5 mg/l a návratnost metody 97 ­ 104 %. Retenční čas byl také 40 minut. Uvedli však hodnotu korelačního koeficientu 0,9999 u všech stanovovaných 8 lignanů. Dalším cílem mojí disertační práce byla izolace lignanů ze zbytkových matečných louhů po extrakci lignanů provedené mým školitelem Mgr. Jiřím Slaninou, Ph.D. v rámci jeho disertační práce. Semena Schisandra chinensis byla extrahována petroletherem 2 dny za horka v Soxhletově extraktoru. Oddestilováním petroletheru bylo získáno 122 g odparku 105 a s tímto odparkem olejovité konzistence byla provedena chromatografie na sloupci silikagelu. Petroletherem byly eluovány frakce a ­ c, benzenem frakce d ­ h, diethyletherem frakce i ­ k a ethanolem frakce l. Samotné tyto frakce byly pak dále ještě děleny na sloupci silikagelu. Z přečištěné frakce d byl získán metodou semipreparativní HPLC -schizandrin (62 mg). Z přečištěné frakce e byl získán semipreparativní HPLC deoxyschizandrin (143 mg). A po přečištění frakcí e, g, h byly získány lignany schizandrin (212 mg) a gomisin A (115 mg). Lignany s hydroxylovou skupinou schizandrin a gomisin A se na semipreparativní HPLC dělí výrazně lépe, než nepolární lignany bez hydroxylových skupin jako je v tomto případě -schizandrinu. U schizandrinu a gomisinu A se dala separace ovlivnit jak rozpuštěním vzorku v methanolu, tak koncentrací methanolu v mobilní fázi. Lignany s hydroxylovými skupinami mohly být rozpuštěny v 50% vodném roztoku methanolu. Jako mobilní fáze byl zvolen 63% methanol. Za těchto podmínek bylo dosaženo kvalitního rozdělení lignanů z frakce e, g, h, viz. obrázek 12. Lignan -schizandrin je více nepolární a tak mohl být rozpuštěn až 74% vodném roztoku methanolu a mobilní fází byl v tomto případě 75 % methanol. Po navýšení procent methanolu bylo dosaženo dobrého rozdělení směsi izomerů -schizandrinu a gomisinu N. Hepatoprotektivní působení -schizandrinu je založeno na zvýšení redoxního stavu jaterního glutathionu jak v cytosolu, tak v mitochondriích. Ochranný účinek -schizandrinu je větší než u běžných antioxidantů (např. -tokoferolu). Narozdíl od tokoferolu nevykazuje prooxidační vlastnosti. 82, 83 Výzkum z posledních let přinesl zjištění, že -schizandrin je účinným inhibitorem P-glykoproteinu, který zapříčiňuje resistenci na cytostatika (MDR). Přídavek této látky byl schopen udržet hladiny cytostatik paklitaxelu a vinkristinu v buněčných liniích s rezistencí MDR. 94 Podání -schizandrinu chránilo buňky kardiomyocytu H9c2 před apoptózou buněk vyvolanou hypoxií/reoxigenací. Cytoprotektivita může v tomto případě souviset se snížením změn mitochondriální permeability indukované Ca2+ , což postupně zvyšuje hladiny GSH v buňce. 123 Z těchto důvodů se předpokládá, že účinky, toxicita a metabolismus -schizandrinu budou dále intenzivně zkoumány. Schizandrin působí hepatoprotektivně, chrání proti poškození tetrachlórmethanem a pravděpodobně má i účinky na centrální nervový systém skrze aktivaci anticholinergního systému. Nedávno byly potvrzeny protizánětlivé účinky schizandrinu in vivo. Schizandrin aplikovaný myším, které trpěly sepsí vyvolanou lipopolysacharidy, výrazně zlepšoval jejich stav. Zlepšení stavu bylo zapříčiněno inhibicí NO produkce a také zabránění uvolňování prostaglandinu E2. 124 Gomisin A působí hepatoprotektivně, stabilizuje buněčné membrány jaterního parenchymu, zabraňuje tkáňovým změnám jako je degradace a nekróza hepatocytu. 11, 24 Dále má také účinky antineoplastické ­ inhibuje karcinogenezi 106 navozenou 12-(O)-tetradekanoylforbol acetátem a 7,12-dimethylbenzantracenem. 6 Gomisin A má také antiulcerozní působení 19 a protizánětlivé účinky. 18 Z HPLC analýz bylo zřejmé, že matečné louhy po krystalizaci schizandrinu a gomisinu A obsahují ještě další lignany. Frakce byly děleny pomocí semipreparativní HPLC a byly získány další čtyři minoritní lignany angeloylgomisin H (77 mg), tigloylgomisin H (67 mg), chemická struktura byla potvrzena 1 H NMR analýzou a získané údaje byly srovnány s již publikovanými údaji, viz. tabulka Tab. 7 a 8. Dále byl získán tigloylgomisin P (14 mg) a gomisin J (19 mg) struktura byla potvrzena 1 H NMR analýzou a údaje těchto dvou lignanů byly srovnány s literaturou, viz. tabulky Tab. 9 a 10. Gomisin J je velmi zajímavý lignan svým antivirový působením. Vykazoval antiHIV aktivitu vůči viru HIV-1 u buněčných kultur H9 (infikovaných virem HIV-1). Gomisin J zároveň posloužil jako předloha pro jeho halogenované deriváty, u těchto polysyntetických derivátů byla zjištěna vyšší antiHIV aktivita než u přírodní formy. Gomisin J dále působil synergisticky s azidothymidinem (AZT), jedním s nejznámějších a nejúčinnějších léků k oddálení propuknutí nemoci. 99 Gomisin J pokud je aplikován na kůži tlumí také schopnost rakovinotvorného 12-(0)-tetradekanoylforbol-13-acetátu vyvolávat zánět, tvorbu a vývoj kožních tumorů. 6 Také účinkoval jako inhibitor vápníkového kanálu typu L u prasat a mohl by tak mít potenciální schopnost snižovat patologicky zvýšený krevní tlak. 17 Lignany tigloylgomisin P a angeloylgomisin H a tigloylgomisin H byly vyizolovány Ikeyou a spol. v letech 1978 - 1982. Dosud byla publikována pouze jedna izolace lignanu tigloylgomisinu H. 50 Získané poznatky o struktuře tigloylgomisinu H potvrzené NMR analýzou jsou zde uvedeny první, po více jak 40 letech od poslední izolace. Naše určení struktury pomocí NMR (frekvence 500,13 Mhz) je mnohem přesnější, než tabulky publikované Ikeyou začátkem 80let, kdy struktura byla potvrzena NMR s frekvencí 80 Mhz. Angeloylgomisin H a tigloylgomisin P byly vyizolovány od roku 1978 ještě několikrát. 56 Chen a spol. vyizolovali tigloylgomisin P i z druhu Schisandra rubriflora. 125 Celkem však nebyla biologická aktivita těchto minoritních lignanů (vyjma gomisinu J) doposud podrobně prozkoumána. V současné době byly všechny vyizolované lignany poskytnuty dále ke stanovení biologické aktivity. Získané lignany byly testovány na Biologickém ústavu Lékařské fakulty MU na schopnost obnovit citlivost rezistentní buněčné linie plicního karcinomu COR-L23/R k cytostatiku doxorubicinu. Resistence linie COR-L23/R je dána zvýšenou expresí ,,multidrug-resistance protein 1", který patří do rodiny ABC transportérů lokalizovaných v cytoplasmatické membráně. V této studii bylo zjištěno, že lignany deoxyschizandrin 107 a -schizandrin aplikované společně s doxorubicinem zvyšovaly akumulaci doxorubicinu v buňkách MDR rezistentní linie COR-L23/R, což bylo zjištěno průtokovou cytometrií na základě fluorescence doxorubicinu v buňkách. Pouze lignany deoxyschizandrin a -schizandrin byly schopny obnovit cytotoxický účinek doxorubicinu na linii buněk COR-L23/R. Ostatní testované lignany byly podstatně méně účinné nebo neúčinné, jak ve zvýšení akumulace doxorubicinu, tak ve zvýšení citlivosti rezistentních buněk k doxorubicinu. Analýzou buněčného cyklu bylo zjištěno, že deoxyschizandrin a -schizandrin spolu s netoxickými dávkami doxorubicinu zastavují buněčný cyklus ve fázi G2/M, což je typické pro toxické dávky doxorubicinu, zatím co lignany aplikované samostatně nemají významný vliv na buněčný cyklus. Společným strukturním rysem deoxyschizandrinu a -schizandrinu je (R) konfigurace biarylu a absence hydroxylové skupiny na uhlíku C-7. 126 Dalším cílem disertační práce bylo stanovit obsah lignanů vyvinutou metodou ve vzorcích kultur S. chinensis. Tyto kultury byly kultivovány na Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendlovy lesnické a zemědělské univerzity v Brně. Kultury zde byly kultivovány týmem spolupracovníků pod vedením Ing. Heleny Vlašinové, Ph.D. K embryogenním kulturám S. chinensis byly přidány polyaminy putrescin, spermidin a spermin v koncentracích 250 ­ 750 mg/l, dále byl sledován vliv těchto polyaminů na syntézu lignanů kulturou. Polyamin putrescin přidaný do média v koncentraci 250 mg/l významně zvýšil obsah deoxyschizandrinu více jak 6krát (Obr. 52) a v koncentraci 500 mg/l zvýšil obsah gomisinu N přibližně 3krát, aniž by došlo k ovlivnění obsahu ostatních lignanů a růstu kultury. Opačný byl účinek putrescinu o koncentraci 750 mg/l. při této koncentraci došlo k poklesu obsahu všech lignanů včetně gomisinu N. Přídavek polyaminů spermidinu v koncentraci 250, 750 mg/l a sperminu v koncentraci 250 mg/l neovlivnil obsah lignanů. Při vyhodnocování působení růstových regulátorů na buněčnou kulturu S. chinensis bylo zjištěno, že lignany jsou v malém množství uvolňovány do kultivačního média. To vedlo k myšlence přidat do média určeného pro kultivaci buněk S. chinensis adsorbenty, které by mohly na svůj povrch navázat nepolární lignany. Z chemického hlediska by mohly vázat lignany polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 a Amberlite XAD-7. Adsorpce lignanů na polymerní pryskyřice byla teoreticky ověřena přidáním standardů lignanů k amberlitům. Byl sledován pokles absorbance (pokles koncentrace lignanů). Obě dvě polymerní pryskyřice v množství 12,5 mg byly schopny na sebe navázat 80 % přidaných lignanů v množství 50 g. 108 U jiných sekundárních metabolitů byla již tato vazba na amberlity a následné zvýšení produkce sekundárního metabolitu kulturami publikována. Např. přídavek XAD-7 zvyšoval až o 70 % produkci ajmalicinu ­ idolového alkaloidu Catharantus roseus. 127 Přídavek XAD-7 zvyšoval syntézu sanguinarinu ­ alkaloidu u buněčných kultur Papaver somniferum. 128 Amberlit XAD-4, na bázi polystyrenu, zvyšoval produkci kofeinu a theobrominu, purinových alkaloidů kultur Coffea arabica. 129 Dosud však nebyly publikovány žádné studie, které by se zabývaly zvýšením produkce lignanů, ať už S. chinensis nebo lignanů jiných rostlin pomocí přídavku polymerních pryskyřic do média kultury. Z MZLU byly k tomuto pokusu vybrány tři embryogenní linie LA58, LA4 a LA52 a dvě polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2 (nepolární polystyrenová pryskyřice) a Amberlite XAD-7 (středně polární polyakrylátová pryskyřice). V celkovém součtu hmotnosti vyprodukovaných lignanů (obsah lignanů = kultura + amberlit + médium) se ukázalo, že bez přítomnosti polymerní pryskyřice buňky linie LA58 obsahují velmi malé množství lignanů. Přídavek obou amberlitů ve srovnání s kontrolou výrazně zvýšil produkci lignanů v testované kultuře pod vlivem amberlitu XAD-2 32krát a XAD-7 90krát oproti kontrole. Tyto lignany jsou z 95 % navázány na polymerní pryskyřice, viz. tabulka Tab. 34. U linie LA4 je amberlit XAD-2 účinný ve zvýšení produkce lignanů především díky tomu, že zvyšuje především produkci deoxyschizandrinu 40krát vůči kontrole. Linie LA4 vykazovala zvýšený obsah lignanů i v samotné kultuře (Tab. 36). To je rozdílné oproti linii LA58, která obsahovala velmi malé množství lignanů lokalizovaných přímo v buňkách kultury intracelulárně. Buňky kultury LA52 s přídavkem amberlitů obsahovaly velké množství gomisinu N i ostatních stanovovaných lignanů. Gomisin N je lokalizován převážně intracelulárně, viz. tabulka Tab. 38. Amberlity pravděpodobně nejsou schopny převést gomisin N do extracelulárního prostředí. U linie LA52 bylo na amberlitu navázáno menší množství lignanů než u předchozích dvou buněčných linií. Na amberlitech se nevyskytuje zvýšené množství lignanů, kromě zvýšeného obsahu deoxyschizandrinu na amberlitu XAD-2. Všechny tyto tři linie byly kultivovány i s dvakrát zředěným médiem a po dvojitém zředění média obsah lignanů klesl v kultuře i na amberlitu až 10krát, viz. tabulky Tab. 35, 37. Z tohoto faktu lze vyvodit, že snížením látek nutných ke kultivaci kultury pravděpodobně nebude docházet vlivem stresu ke zvýšené produkci lignanů. Velmi se liší také zastoupení jednotlivých lignanů adsorbovaných na pryskyřicích. Amberlit XAD-2 má schopnost zvýšit produkci deoxyschizandrinu mnohem více než produkci ostatních lignanů a současně schopnost adsorbovat jej. Deoxyschizandrin tvoří 86 ­ 94 % lignanů vázaných na amberlit XAD-2 u kultur buněk LA4 a LA52, což je znatelně 109 více než jeho zastoupení v buňkách pěstovaných bez přídavku amberlitu (11 ­ 14 % všech lignanů). Podobně amberlit XAD-7 je schopen v liniích buněk LA4 a LA52 zvýšit produkci především lignanu wuweizisu C. Proto extrakt získaný extrakcí lignanů z amberlitu XAD-7 obsahuje převážně wuweizisu C (55 ­ 79 % lignanů), což je několikanásobně více než v kontrolních kulturách bez přídavku amberlitu (7 ­ 12 %). Tento poznatek může usnadnit případnou izolaci lignanu adsorbovaného na pryskyřici. Dále byl stanoven obsah lignanů v linii LAT10 a LATI také s přídavkem polymerních pryskyřic. V tomto pokusu bylo zaznamenáno, že oba amberlity zvyšují zejména produkci deoxyschizandrinu (u LATI amberlit XAD-2 300krát), to je více než v pokusech s liniemi LA58, LA4 a LA52, kde zvyšoval obsah deoxyschizandrinu max. 40krát. Amberlit XAD-7 byl ve srovnání s XAD-2 přibližně dvakrát méně účinnější. Buňky kultury LAT10 i LATI obsahují při kultivaci bez amberlitů pouze -schizandrin a gomisin N, viz. tabulky 42 a 43. U kultury LAT10 s přídavkem XAD-2 je více lignanů lokalizováno intracelulárně v buňkách kultury než na amberlitu. Spektrum lignanů je odlišné. Zatímco v buňkách je zvýšen -schizandrin a gomisin N, působením XAD-2 se zvyšovala syntéza deoxyschizandrinu. To naznačuje, že pravděpodobně dochází působením amberlitů k indukci syntézy lignanů, a že tyto navázané lignany nepocházejí např. z poškozených buněk kultury. V kultuře LATI bez amberlitů byl nižší obsah lignanů než v kultuře LAT10. V těchto dvou kulturách nedochází na rozdíl od kultur LA52, LA4 a LA58 ke zvýšení obsahu wuweizisu C ani u amberlitu XAD-2 ani u amberlitu XAD-7. Média obsahují obvykle nízká množství lignanů. Přídavek amberlitu XAD-2 zvýšil množství lignanů v médiu u kultury LAT10 ­ možné vysvětlení je, že se pravděpodobně zvýší indukce syntézy lignanů amberlitem a amberlity nestačí lignany navázat, nebo zvýšený obsah lignanů může být vysvětlen zánikem buněk a uvolnění lignanů do média. Lignany z média by se mohly adsorbovat i na další povrchy nejenom na amberlity. V následující linii kultur LA54 byl stanoven obsah lignanů nejen v kultuře, na amberlitech a v médiu, ale také i na raftech a v plastových kultivačních nádobách s cílem zjistit, zda nedochází k adsorpci lignanů i na tyto plochy. Z výsledků v tabulce Tab. 44 je vidět, že na nádobách, raftech a na amberlitu XAD-2 je nadsorbován deoxyschizandrin. Ale v kulturách jsou opět hlavními lignany -schizandrin a gomisin N, které nejsou na XAD-2 ani na raftech a kultivačních nádobách. Z toho jasně vyplývá, že spektrum lignanů adsorbované na nádobách a na XAD-2 je stejné, ale rozdílné od vzorku kultury. Pokud byl přidán amberlit XAD-2, tak na nádobách bylo nalezeno jen malé množství deoxyschizandrinu 0,1 ­ 2,0 g, které tvoří pouze 0,6 ­ 7,1 % všech lignanů. Polyethylenové kultivační nádoby 110 nemohou konkurovat amberlitu XAD-2 v adsorpci lignanů. Pokud byl přidán amberlit XAD-7, tak na raftech a nádobách (Tab. 44) bylo stanoveno 2krát větší množství deoxyschizandrinu 0,2 ­ 4,2 g než v případě amberlitu XAD-2 a lignany naadsorbované na nádobách tvoří 20 až 77 % všech lignanů. To znamená, že na nádobách a raftech bylo stanoveno více lignanů než na amberlitu XAD-7, mohly by konkurovat amberlitu XAD-7 v adsorpci lignanů. Celkově lze z výsledků odvodit, pokud je pokus bez amberlitu, nejvíce lignanů je v kulturách (54 ­ 99,5 %), pak na raftech a nádobách (0,2 ­ 46 %) a nejméně v médiích (0,02 ­ 0,4 %). Výsledky popsané v této práci ukazují, že přídavek polymerních pryskyřic, zejména nepolárního amberlitu XAD-2, může být velmi účinný způsob pro převedení lignanů do extracelulárního prostředí a pro zvýšení biosyntézy těchto sekundárních metabolitů buněčnými kulturami S. chinensis. Lignany adsorbované polymerní pryskyřicí pak mohou být snadno získány bez destrukce buněčné kultury, což je výhodné vzhledem k pomalému růstu kultur. Použití adsorbentů ke zvýšení biosyntézy sekundárních metabolitů není novou technikou, avšak zvýšení biosyntézy sekundárních metabolitů popsané v této práci je zpravidla vyšší než bylo doposud publikováno pro různé metabolity (až 300krát např. pro obsah deoxyschizandrinu v buněčné linii LATI). Např. přídavkem XAD-7 se zvýšil obsah idolového alkaloidu ajmalicinu v buněčné kultuře Catharantus roseus 70krát. 127 Tato technika nebyla doposud použita ke zvýšení biosyntézy lignanů, na které se podílí jejích chemická struktura. Lignany jsou malé nepolární molekuly, které mohou snadno procházet biologickými membránami a vykazují vysokou afinitu k nepolárním adsorbentům. V současnosti má tento postup jen teoretický význam a nedá se prakticky použít pro získání lignanů kvůli jejich nízké produkci buněčnými liniemi S. chinensis. K praktickému použití by musely být vyselektovány buněčné linie schopné vysoké produkce lignanů a jejich biosyntéza by musela být zvýšena dalšími postupy, jako je např. přídavek prekursorů apod. Použití adsorbentů by však mohlo být vhodné k nepřímé ,,extrakci" nepolárních lignanů a dalších nepolárních sekundárních metabolitů z buněčných kultur in situ bez jejich destrukce, např. za účelem fytochemické analýzy metabolitů produkovaných kulturami. 111 6 ZÁVĚRY ˇˇˇˇ Metodou semipreparativní HPLC byly vyizolovány následující lignany: schizandrin (212 mg), gomisin A (115 mg), deoxyschizandrin (143 mg), -schizandrin (62 mg), tigloylgomisin H (66,5 mg), gomisin J (18,9 mg), angeloylgomisin H (77,3 mg), tigloylgomisin P (13,5 mg) a jejich struktura byla potvrzena NMR analýzou s využitím 1D a 2D 1 H NMR a 13 C NMR metod. ˇˇˇˇ Byla navržena rychlá a účinná metoda stanovení lignanů v rostlinném materiálu skládající se ze tří postupných kroků: extrakce vzorku methanolem, přečistění methanolového odparku pomocí SPE a následně HPLC analýza. Metoda byla validována pro schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, -schizandrin, gomisin N a wuweizisu C. Stanovená návratnost této metody se pohybuje v rozmezí 89,9 ­ 101,4 %. ˇˇˇˇ Lignany byly kvantifikovány na monolitické HPLC koloně Chromolith Performance RP- 18e (100 × 4,6 mm, Merck) za použití mobilní fáze (50% acetonitril). Separace všech 6 lignanů bylo dosaženo do 20 minut díky vyššímu průtoku mobilní fáze (2ml/min), který byl umožněn nízkým tlakem mobilní fáze na monolitické koloně. Korelační koeficient pro všechny kalibrované lignany je větší než 0,999, což indikuje velmi dobrou linearitu kalibrační přímky ve zvoleném koncentračním rozpětí. Limit detekce byl stanoven v rozpětí 0,4 ­ 3,9 ng a limit kvantifikace 1,2 ­ 13 ng. ˇˇˇˇ Zvolenou metodou byl stanoven obsah lignanů v buněčných kulturách S. chinensis Přídavek polymerních pryskyřic, zejména nepolárního amberlitu XAD-2, může být velmi účinný způsob pro převedení lignanů do extracelulárního prostředí a pro zvýšení biosyntézy těchto sekundárních metabolitů buněčnými kulturami S. chinensis. Lignany adsorbované polymerní pryskyřicí pak mohou být snadno získány bez destrukce buněčné kultury, což je výhodné vzhledem k pomalému růstu kultur. 112 7 LITERATURA 1 Hancke J. L., Burgos R. A., Ahumada F.: Fitoterapia 70, 1999, 449-455 2 Slanina J., Táborská E., Lojková L.: Planta Med. 63, 1997, 277-280 3 Harnischfeger G., Tewocht G.: Der Hagers Handbuch der Pharmaceutischen Praxis Vol. 6, Springer, Verlag, Berlin, 1994, 640 4 Saunders RMKS.: Monograph of Kadsura (Schizandraceae). Systematic botany monographs 54, 1998, 1-106 + 2pl 5 Saunders RMKS.: Monograph of Kadsura (Schizandraceae). Systematic botany monographs 54, 2000, 1-124 + 6pl 6 Opletal L., Opletalová V.: Pokroky ve farmacii. Praha: Avicenum, 1990, 91-111 7 Panero J. L., Aranda P.D.: Brittonia 50, 1998, 87-90 8 Denk T., Oh I. C.: Plant. Syst. Evol. 256, 2006, 113-145 9 Valíček P., Ando V., Čížek H.: Léčivé rostliny tradiční čínské medicíny. Svítání, Hradec Králové, 1998, 240-241 10 Horák V., Valíček V.: Remedia 5, 1995, 223-226 11 Matsuzaki Y., Matsuzaki T., Takeda S. et al.: Yakugaku Zasahi 111, 1991, 524 12 Lu H., Liu G.T.: Planta Med. 58, 1992, 311-317 13 Jung K. Y., Lee I. S., Oh R. S. et. al.: Phytomedicine 4, 1997, 229 14 Pan S. Y, Dong H., Han Y. F., Li W.Y., Zhao X. Y., Ko K. M.: Eur. J. Pharmacol. 357, 2006, 200-204 15 Liu J., Wang W., Huang M.: Zhoncayao 21, 1990, Chem. Abstr. 113, 217928 1990, 294 16 Slanina J.: Disertační práce, Univerzita Palackého, Olomouc, 1999, 29 - 37 17 Suekawa M., Shiga T., Sone H., Ikeya Y., Taguchi H., Aburada M., Hosoya E.: Yakugaku Zasshi 107, 720 (1987). Chem. Abstr. 108, 1988, 16176 18 Ohkua Y., Mizogushi Y., Morisava S. et al.: Jpn. J. Pharmacol. 52, 1990, 331- 338 19 Ikeya Y., Taguchi H., Matsuhashi H., Takeda S., Kase Y.: Phytochemistry 27, 1988, 569 20 Buřivalová K.: Diplomová práce, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 2001, 32 21 Tolmačev A. I. et. al.: Atlas arealov I resursov lekarstvennych rastěnij. GUGK, Moskva 1980 22 Hegenauer, R.: Chemotaxonomie der Pflansen. Bd 6, Birkhauser Verlag, Basel 1973 23 http://cs.wikipedia.org/wiki/Mand%C5%BEusko 24 Opletal L., Křenková M., Havlíčková P.: Čes.. slov. Farm. 50, 2001, 173-180 25 Sladkovský R., Solich P., Opletal L.: J. Pharm. Biomed. Anal. 24, 2001, 1049-1054 26 Chen C. C., Shen C.C., Shih. Y.-Z., Pan T. M.: J. Nat. Prod. 57, 1994, 1164 27 Taguchi H.: Gendai Toyo Igaku 6, 65, 1985, 85-93 28 Ikeya Y., Ookawa N., Taguchi H., Yosioka I.: Chem. Pharm. Bull. 30, 1982, 3202 29 Juany S. X., Yang L. B., et. al: Tetrahedron Lett. 64, 2008, 4260-4267 30 Fuss E.: Phytochem. Rev. 3, 2003, 307-320 31 MacRae W. D., Towers G. H. N.: Phytochemistry 23, 1984, 1207 32 Slanina J.: Chem. Listy 94, 2000, 111-116 33 Harmata J., Dinan L.: Phytochem. Rev. 2, 2003, 321 113 34 Harmata J.: Chem. Listy 99, 2005, 622-632 35 Ayres D. C., Loike J. D.: Cambridge University Press, 1990, 438-444 36 Ward R. S.: Nat. Prod. Rep. 43, 1997, 43-74 37 Yang L. M., Lin S. J., Yang H. T., Lee K. H.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 6, 1996, 941 38 Ikeya, H. Taguchi, I. Yosioka, H. Kobayashi: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 1583 39 Sakurai H., Nikaido T., Ohmoto T., Ikeya Y., Mitsuhashi H: Chem. Pharm. Bull. 40, 1992, 1191 40 Opletal L., Sovová H., Bártlová M.: J. Chromatogr., B: Biomed. Appl. B 812, 2004, 357-371 41 Ikeya. H, Taguchi I., Yosioka H.: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 1383 42 Samojlenko L. I., Suprunov N. I.: Chim. Prir. Sojedin. 10, 1974, 75 43 Nakajima K., Taguchi H., Ikeya Y., Endo T., Yosioka I.: Yakugaku Zasshi 103, 1983, 743 44 Ikeya. H, Taguchi I., Yosioka H.: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 1383 45 Kochetkov N. K., Khorlin A., Chizhov O. S.: Zh. Obsch. Chim. 31, 1961, 3454 46 Kochetkov N. K., Khorlin A., Chizkov O. S, Sheichenko V. I.: Tetrahedron Lett. 20, 1961, 730 47 Chen Y. Y., Zhu Z. B, Li L. L.: Scientia Sin. (Peking) 19, 1976, 276 48 Kochetkov N. K., Khorlin A., Chizhov O.S.: Izv. Akad. Nauk SSSR, Sen Khim, 1964, 1036 49 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I., Kobayashi H.: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 2695 50 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I., Kobayashi H.: Chem. Pharm. Bull. 26, 1978, 3257 51 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I.: Chem. Pharm. Bull. 30, 1982, 3207 52 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I., Kobayashi H.: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 1395 53 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I., Kobayashi H.: Chem. Pharm. Bull. 27, 1979, 1576 - 1582 54 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I.: Chem. Pharm. Bull. 28, 1980, 2422 55 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I.: Chem. Pharm. Bull. 30, 1982, 26 56 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I., Kobayashi H.: Chem. Pharm. Bull. 28, 1980, 3357 57 Ikeya Y., Taguchi H., Yosioka I.: Chem. Pharm. Bull. 29, 1981, 2893 58 Ikeya Y., Kanatani H., Hakozaki M., Taguchi H., Mitsuhashi H.: Chem. Pharm. Bull. 36, 1988, 3974 59 Wang N.Y., Minatoguchi S., Arai M. et al.: Circulation Journal 66, 2002, 763-768 60 Yick P. K., Poon M. K. T., Ip. S. P., Ko K. M.: Pharm. Biology 36, 1998, 189-193 61 Ko K. M., Yick P. K., Poon M. K. T. et al.: Phytother. Res. 9, 1995, 203 62 Nishama N., Chen P. J., Saito H.: Biol. Pharm. Bull. 19, 1996, 88-395 63 Sun P.: Can. Pat. App. CA 2, 172 641, Chem. Abstr. 128, 1998, 188627 64 Narimanian M. et. Al.: Phytomedicine 12, 2005, 723-729 65 Yang L., Chen X., Quiang Z., Jun J. L., Ren X. T.: J. Ethnopharmacol. 98, 2005, 329- 333 66 Kang Y. S et. al.: Life Sci. 76, 2005, 1691-1705 67 Hsieh T. M., Chi R. W., Wang W. H., Lin L. W.: Pharmacol. Res. 43, 2001, 778-781 68 Chang T. G., Kang K. S., Kim H. J. et. al.: J. Ethnopharmacol. 102, 2005, 340-349 114 69 Amaryan G., Astvatsatryan E., Gabrielyan A. et. al.: Phytomedicine 10, 2003, 271-285 70 Li X. Y.: Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 86, Suppl 2, 1991 31-37 71 Ko K. M., Ip S. P., Poon M. K. T., Wu S. S., Che C. T., Ng K. H., Kong Y. C.: Planta Med. 61, 1995, 134 72 Ip S. P., Mak D. H. F., Li P. C., Poon M. K. T., Ko K. M.: Pharmacol. Toxicol. 78, 1996, 413 73 Zhu M., Lin K. F., Yeung R. C. Li. P. C.: J. Ethnofarmacol. 67, 1999, 61­68 74 Ni J. X., Fuji K., Sato N., Yuge O.: J. Appl. Toxicol. 6, 1993, 385-388 75 Jiaxiang N., Fujii K., Sato N., Yuge O.: J. Appl. Toxicol. 13, 1993, 385 76 Ip S. P., Mak D. H. F., Li P. C., Poon M.K.T., Ko K.M.: Pharmacol. Toxicol 78, 1996, 413 77 Eybl V., Kotyzová D., Koutenský J., Waitzová D., Jones M. M.: Arch. Toxicol. 11, 1987, 209-212 78 Rhyu R. M., Kim Y. E., Yoon B. K., Lee Y.J., Chen S. N.: Phytomedicine 13, 2006, 651-657 79 Kubo S., Ohkura Y., Mizoguchi Y. et al.: Planta Med. 58, 1992, 482 80 Nomura M., Nakachiyama T., Hida T., Ohtaki Y., Sudo K., Aizawa T., Aburada M., Miyamoto K.: Cancer Lett. 76, 1994, 11 81 Takeda S., Kase Y., Okhura Y. et. al.: Oyo Zakuti 33, 1987, 229, Chem. Abstr. 107, 1987, 70274 82 Yp S. P., Yiu H.Y., Ko K. M.: Mol. Cell. Biochem. 208, 2000, 151-155 83 Chiu Y. P., Tang H. M., Duncan H. F. et al.: Free. Radic. Biol. Med. 34, 2003, 368-380 84 Iwata H., Tezuka Y., Kadota S., Hiratsuka A., Watabe T.: Drug Metab. Dispos. 32, 2004, 1351-1358 85 Lin T. J., Liu G. T., Pan Y., Liu Y., Xu G. Z.: Biochem. Pharmacol. 42, 1991, 1805 86 Zhao L. B., Li X. J., Lui G. T.: Cell Biol. Int. 14, 99, 1990 87 Li X. J., Zhao B. L. Liu G. T.: Free Radical Biol. Med. 99, 9, 1990 88 Yoschikawa A., Salto Y. Maruyama K.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 2006, 394-399 89 Min H. Y., Park E. J., Hong J. Y, Kang Y.J., Kim S., Chung H., Woo E., Hung T., Youn U., Kim Y., Kang S., Bae K., Lee S.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 2008, 523-526 90 Hancke J.L., Wukman G., Hernandez D.A.: Planta Med. 1986, 85-62 91 Volicer L., Sramka M., Janků I. et. al.: Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 163, 1966, 249 92 Xue J.Y., Liu G.T., Wei H.L., Pan Y. : Free Radical Biol. Med. 12, 1992, 127 93 Chang H.M., But P.P. et. al.: Pharmacology and Aplications of Chinese Material Edica, 1 Wold Scientific Pub. 1986, 199-209 94 Quaingrong P., Quinghua L., Kun Z., Xun H.: Cancer Chemother. Pharmacol. 58, 2006, 99-106 95 Quaingrong P., Tao W., Quinghua L., Xun H.: Biochem. Biophys. Res. Comun. 335, 2005, 406-411 96 Chi-Keung W. et. al.: Biochem. Pharmacol. 72 , 2006, 824-837 97 Fong W. F., Wang C. K., Zhu G. Y.: Planta Med. 73, 2007, 212-220 98 Lee I. S., Jung K. Y., Oh S. R., Kim D. S., Kim J. H., Lee J. J., Lee H. K., Kim E. H., Cheong C.: Arch. Pharm. Res. 20, 1997, 663 115 99 Fujihashi T., Hara H., Sakata T., Mori K., Higuchi H., Tanaka A., Kaji H., Kaji A.: Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1995, 2000 100 Chen D. F., Zhang S. X., Xie L., Xie J. X., Chen K., Kashiwada Y., Zhou B. N., Wang P., Cosentino L. M., Lee K. H.: Bioorg. Med. Chem. 5, 1997, 1715 101 Sakurai H., Nikaido T., Ohmoto T., Ikeya Y., Mitsuhashi H.: Biol. Pharm. Bull. 40, 1992, 1191 102 Kwon B. M., Jung H. J., Lim J. H. et. al: Planta Med. 65, 1999, 74-76 103 Rhee J. K., Woo K.J, Baek B.K., Ahn B.J: Am. J. Chinese Medicine 9, 1981, 277-284 104 Bolšakova I., Lozovskaja E. L., Sapežinskij I. I.: Biofyzika 42, 1997, 926 105 Chen D. F., Zhang S. X., Xie L., Xie J. X., Chen K., Kashiwada Y., Zhou B. N., Wang P., Cosentino L. M., Lee K. H.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 1997, 1715 106 Niu X.Y, Bian Z. J., Ren Z. H. : Acta Pharm. Sin 18, 1983, 491 107 Ikeya Y., Sugama K., Tanaka M., Wakamatsu T., Ono H., Takeda S., Oyama T., Maruno M.: Chem. Pharm. Bull. 43, 1995, 121 108 Masarovičová E. et.al.: Fyziologia rastín. Univerzita Komenského, Bratislava 2002, 303 109 Dušek J., Dušková J., Tůmová L., Spilková J.: Čes. slov. Farm. 45, 1996, 204 110 Kašparová M., Siatka T., Dušek J.: Česk. slov. Farm. 52, 2003, 148 111 Choi H. S., Song H. S., Ukeda H., Sawamura M.: J. Agric. Food Chem. 48, 2000, 4156 112 Smíšková A., Vlašínová H., Havel L.: Biol. Plant. 49, 2005, 451-454 113 Wang J. P., Raung S. L., Hsu M. F., Chen C. C.: Br. J. Pharmacol. 54, 1994, 945­953 114 Kováč J.: Explantátové kultury rostlin, Univerzita Palackého, Olomouc, 1995, 142 115 Avula B., Choi Y. W., Srinivas P. V., Khan I. A.: Chromatographia 61, 2005, 515-518 116 Huang X., Song F. R., Liu Z. Q., Liu S. Y.: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 42, 2007, 1148-1161 117 Bartlová M., Opletal L., Chobot V., Sovová H.: J Chromatogr., B: Biomed. Appl. 770, 2002, 283-289 118 He X. G., Lian L. Z., Lin L. Z.: J Chromatogr., A 757, 1997, 81-87 119 Novaková, L., Matysová, L., Solichová, D., Koupparis, M. A., Solich, P.: J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 813, 2004, 191-197 120 Hashem, H., Jira, T.: Chromatographia 61, 2005, 133-136 121 Halstead C. W., Lee S., Khoo C. S., Hennell J. R., Besoussan A.: Pharm. and Biomed. Anal. 45, 2007, 30-37 122 Avula B., Choi W. Y., Sirinivas P. V., Khan I. A.: Chromatographia 65, 2005, 515-518 123 Chiu P. J, Luk F. K., Leung H. J., Ng K. M., Ko K. M.: Life Sci. 82, 2008, 1092-1101 124 Guo L. Y., Hung T. H., Bae K. H., Shin E. M. , Zhou H. Y., Hong Y. N., Kang S., Kim P. H., Kim S. J: Eur. J. Pharmacol. 591, 2008, 293-299 125 Chen M., Kilgore N., Lee H. K., Chen D. F.: J. Nat. Prod. 69, 2006, 1697-1701 126 Slaninová I., Slanina J., Tomalová I., Březinová L., Broošová M., Koubíková L., Krestová K.: XIX. Biologické dny, sborník. 2008, 79 127 Lee-Parsons W.T., Shuler M. L.: Biotechnol. Bioeng. 79, 2002, 408-415. 128 Wilams R. D.; Chauret N.; Bedard C.; Archambault J.: Biotechnol. Bioeng. 40, 1992, 971-977 129 Kurata H., Kawai A., Seki M., Furusaki S.: J. Ferment. Bioeng. 78, 1994, 117-119 116 8 PŘÍLOHY PŘÍLOHA 1: 1 H NMR spektrum -schizandrinu (JS_2) PŘÍLOHA 2: 13 C NMR spektrum -schizandrinu (JS_2) PŘÍLOHA 3: 1 H NMR spektrum tigloylgomisinu H (JS-4) PŘÍLOHA 4: 13 C NMR spektrum tigloylgomisinu H (JS-4) PŘÍLOHA 5: 1 H NMR spektrum gomisinu J (JS12) PŘÍLOHA 6: 13 C NMR spektrum gomisinu J (JS12) PŘÍLOHA 7: 1 H NMR spektrum angeloylgomisinu H (JS21) PŘÍLOHA 8: 13 C NMR spektrum angeloylgomisinu H (JS21) PŘÍLOHA 9: 1 H NMR spektrum tigloylgomisinu P (JS22) PŘÍLOHA 10: 13 C NMR spektrum tigloylgomisinu P (JS22) PŘÍLOHA 11: srovnání 1H NMR a 13C NMR spekter -schizandrinu, gomisinu J, angeloylgomisinu H a tigloylgomisinu P PŘÍLOHA 12: 1 H NMR spektrum deoxyschizandrinu (JS_3) PŘÍLOHA 13: 13 C NMR spektrum deoxyschizandrinu (JS_3) PŘÍLOHA 14: Seznam publikací