Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Brno Katedra analytické chemie POUŽITÍ SÍRU OBSAHUJÍCÍCH PEPTIDŮ A PROTEINŮ JAKO BIOLOGICKÉ ČÁSTI BIOSENZORU PRO ANALÝZU TĚŽKÝCH KOVŮ Diplomová práce Vojtěch Adam Brno 2006 Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Brno Katedra analytické chemie POUŽITÍ SÍRU OBSAHUJÍCÍCH PEPTIDŮ A PROTEINŮ JAKO BIOLOGICKÉ ČÁSTI BIOSENZORU PRO ANALÝZU TĚŽKÝCH KOVŮ Diplomová práce Vojtěch Adam Brno 2006 Školitel: RNDr. Přemysl Lubal, Ph.D.1 Školitel-specialista: Ing. René Kizek, Ph.D.2 Konzultant: Doc. RNDr. Libuše Trnková, CSc.3 1 Katedra analytické chemie, PřF MU Brno, Kotlářská 2, 611 37 Brno 2 Laboratoř molekulární biochemie a bioelektrochemie, Ústav chemie a biochemie, AF MZLU, Zemědělská 1, 613 00 Brno 3 Katedra teoretické a fyzikální chemie, PřF MU Brno, Kotlářská 2, 611 37 Brno 2 Život je karetní hra, v níž srdce není nikdy trumfem. Marcel Achard 3 PODĚKOVÁNÍ Velmi děkuji Renému Kizekovi za skvělé vedení, podporu, všestrannou pomoc, čas, který mi věnoval a šanci, kterou mi dal. Panu RNDr. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. za diskuse nad výsledky a vedení. Paní Doc. RNDr. Libuši Trnkové, CSc. za konzultace věnované elektrochemickým metodám. Paní Doc. RNDr. Miroslavě Beklové, CSc. za pomoc a podporu, kterou mi věnovala. Ze svých nejbližších spolupracovníků bych chtěl na tomto místě poděkovat jmenovitě Jitce Petrlové, Davidovi Potěšilovi a Ondřeji Blaštíkovi za všestrannou pomoc. Všem zaměstnancům, studentům a nejbližším spolupracovníkům pracujícím v Laboratoři molekulární biochemie a bioelektrochemie (B&B), Ústavu chemie a biochemie, Agronomické fakulty, Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně děkuji za jejich ochotu, vstřícnost a skvělé prostředí a atmosféru, kterou vytváří. Za morální a duševní podporu především děkuji Olince Kryštofové a dále všem výše zmíněným. Děkuji svým rodičům za veškerou podporu, důvěru a zázemí, bez kterého bych jen stěží byl tím, čím jsem. 4 OBSAH I. ÚVOD ......................................................................8 II. TEORETICKÁ ČÁST.................................................................9 1. Těžké kovy...............................................................................................................10 1.1 Esenciální těžké kovy ......................................................................................10 1.1.1 Zinek............................................................................................................11 1.2 Toxické těžké kovy..........................................................................................12 1.2.1 Kadmium .....................................................................................................12 1.3 Využití kovů v lékařství...................................................................................13 1.4 Metody pro stanovení těžkých kovů................................................................17 2. Biosensory ...............................................................................................................18 2.1 Vlastnosti biosensoru.......................................................................................19 2.2 Fyzikálně-chemické převodníky......................................................................21 2.2.1 Elektrody......................................................................................................21 2.3 Bioreceptory.....................................................................................................24 2.3.1 Thiolové sloučeniny.....................................................................................24 2.3.1.3 Metalothionein.............................................................................................26 2.4 Měřící uspořádání při práci s biosensory.........................................................28 2.4.1 Přímý kontakt se vzorkem ...........................................................................28 2.4.2 Uzavřená nádoba..........................................................................................30 2.4.3 Průtočný systém...........................................................................................30 3. Elektrochemické metody .........................................................................................31 3.1 Voltametrie a polarografie...............................................................................31 3.1.1 Cyklická voltametrie....................................................................................33 3.1.2 Diferenční pulzní polarografie a voltametrie...............................................34 3.1.3 Rozpouštěcí voltametrie ..............................................................................35 3.1.4 Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie............................................................35 III. CÍLE PRÁCE ....................................................................37 IV. MATERIÁL A METODY ........................................................38 4. Chemikálie...............................................................................................................38 5. Přístroje....................................................................................................................38 5.1 Stacionární elektrochemický systém ...............................................................38 5.1.1 Adsorptivní přenosová rozpouštěcí technika (AdTS) diferenční pulsní voltametrie (DPV) fytochelatinu anebo metalothioneinu............................................38 5.1.2 Diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie kadmia na povrchu nemodifikované rtuťové kapkové elektrody................................................................39 5.1.3 Cyklická voltametrie DNA ..........................................................................39 6. Reálné vzorky ..........................................................................................................39 6.1 Příprava vzorků lidské moči ............................................................................39 6.2 Příprava vzorků lidského krevního séra...........................................................40 6.3 Příprava vzorků cisplatiny ...............................................................................40 6.4 Příprava aduktů DNA s cisplatinou .................................................................40 6.5 Přečištění DNA aduktů....................................................................................40 6.6 Statistická analýza získaných dat.....................................................................40 5 V. VÝSLEDKY A DISKUSE.........................................................42 7. Fytochelatin .............................................................................................................42 7.1 Adsorptivní přenosová technika pro analýzu fytochelatinu ............................42 7.2 Navržení PC2 biosensoru pro detekci těžkých kovů........................................44 7.3 Elektrochemické chování PC2 biosensoru v přítomnosti Cd(II) a Zn(II)........46 7.4 Stanovení Cd(II) a Zn(II) pomocí PC2 biosensoru v přítomnosti lidské moči 46 7.5 Analýza cisplatiny pomocí PC2 biosensoru.....................................................47 8. Metalothionein.........................................................................................................47 8.1 Adsorptivní přenosová technika pro analýzu metalothioneinu........................48 8.2 Modifikace HMDE metalothioneinem ­ navržení MT biosensoru pro detekci těžkých kovů................................................................................................................50 8.3 Elektrochemické chování navrženého biosensoru v přítomnosti Cd(II) a Zn(II) .........................................................................................................................50 8.4 Stanovení Cd(II) a Zn(II) pomocí MT biosensoru v přítomnosti lidské moči.53 8.5 Stanovení Cd(II) a Zn(II) MT biosensorem v přítomnosti lidského krevního séra .........................................................................................................................54 8.6 Porovnání MT biosensoru s technikou diferenční pulsní anodickou rozpouštěcí voltametrií....................................................................................................................55 8.7 Analýza cisplatiny pomocí MT biosensoru v přítomnosti základního elektrolytu....................................................................................................................56 8.8 Stanovení cisplatiny v přítomnosti lidského krevního séra .............................58 8.9 Studium interakcí mezi cisplatinou a DNA .....................................................59 8.10 Kvantifikace Pt(II)-DNA aduktů .....................................................................60 VII. SHRNUTÍ ....................................................................64 VIII. SUMMARY ....................................................................65 IX. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY......................................66 6 SEZNAM ZKRATEK GSH redukovaný glutathion (Reduced glutathione) GSSG oxidovaný glutathion (Oxidized glutathione) PC fytochelatiny (Phytochelatins) Cys cystein (Cysteine) HMDE visící rtuťová kapková elektroda (Hanging mercury drop electrode) DME kapající rtuťová elektroda (Dropping mercury electrode) DPV diferenční pulzní voltametrie (Differential pulse voltammetry) DPP diferenční pulzní polarografie (Differential pulse polarography) AdSV adsorptivní rozpouštěcí voltametrie (adsorptive stripping voltammetry) DPASV diferenční pulzní anodická rozpouštěcí voltametrie (Differential pulse anodic stripping voltammetry) DPASV cyklická voltametrie (Cyclic voltammetry) MT metalothionein (Metallothionein) dsDNA dvouřetězcová DNA (Double stranded DNA) 7 I. ÚVOD Mezi první vynálezy lidského druhu patří křesadla, tloučky a mnoho jiných nástrojů, které v době svého zrodu výrazně pomáhali našim předkům, buď přežít nepřízeň přírody anebo vylepšit nějakým způsobem jejich dosavadní způsob života. Z našeho hlediska se to může zdát úsměvné, že pro získání lepšího nástroje či pomůcky, byli schopni vést i nelítostné boje. Jak šel čas dál lidé vymýšleli stále důmyslnější nástroje a pomůcky a jejich ,,hlad" po nových technologiích se zvyšoval. Na druhou stranu se také zvyšovala jejich závist, která vedla už ne jen ke rvačce dvou členů jedné tlupy, ale k válkám, které zachvátily celé národy a kontinenty. Ale důvod byl stále stejný, trocha závisti a to, že se ,,ten druhý" má lépe. A proto byl člověk opět nucen posunout hranice vědění dál, aby překonal zase jedno ,,nepříznivé období". Proto se zdá, že hlavním motorem lidského vývoje je na jedné straně zvědavost lidí, ale na straně druhé je to tlak či hrozba něčeho velmi nepříznivého. Vyvstává tedy myšlenka, že lidská populace vystavená stálé hrozbě je schopna ,,dotknout se hvězd", zatímco populace žijící v klidu jen paběrkuje. Proti tomuto tvrzení jasně hovoří fakt, že starost člověka o svou existenci ho sice motivuje k vyšším výkonům. Co je tedy lepší pro vývoj lidské populace? Západní způsob života zajišťující velké množství jistot, které dávají ,,klid", nebo nějakou hrozbu, která by nás zřejmě donesla někam dál. Na jednu stranu je odpověď naprosto jasná, jistota vítězí nad strachem, ale při podrobnějším rozboru s ohledem na budoucnost, a tím není myšlen zítřek, ale dvacet, třicet nebo dokonce sto let, je už situace mnohem složitější. Trpět a přinést svým dětem lepší svět, nebo žít v blahobytu a svoje děti nechat na pospas budoucnosti? Rozřešení tohoto zamyšlení nesmí zůstat na očekávání živelné pohromy nebo dokonce války, či jiných druhů katastrof. Vraťme se proto na začátek tohoto zamyšlení a pojďme se podívat na pračlověka, který mrznul v jeskyni do té doby, než přišel na to, že když uhodí dva kameny o sebe získá jiskru, která je schopna zažehnout oheň. Tomuto objevu se absolutně bez nadsázky dá přisoudit název ,,vědecký". A proto, jen věda a snaha lidí zapálených do vědy a snažících se posunout naše hranice vědění dál, mohou pomoct lidem nejen přežít 21. století, ale také se skutečně dotknout hvězd. 8 II. TEORETICKÁ ČÁST Rozvoj průmyslové výroby přináší produkci řady škodlivých sloučenin ­ pesticidů, toxických organických látek a také těžkých kovů. Koncentrace těžkých kovů v životním prostředí je závažným problémem v ochraně lidského zdraví a produkci potravin v řadě zemí. Jednou ze základních podmínek života je udržení stálého prostředí uvnitř organismu (homeostázy), kterou těžké kovy výrazným způsobem ovlivňují a narušují. Při jejím narušení může v organismu rychle docházet k ukončení životně důležitých funkcí [1]. Do organismů těžké kovy vstupují z okolního prostředí nejčastěji potravou, environmentálními polutanty, herbicidy či pesticidy [1]. A proto snadná a rychlá detekce těžkých kovů ve velmi nízkých koncentracích je nezbytná pro zajištění opatření proti akutní intoxikaci, a především, proti dlouhodobé expozici, která může vést ke vzniku mnoha onemocnění, popřípadě ke smrti. Pro stanovení těžkých kovů byla navržena řada spektrometrických, spektroskopických a řada dalších techniky. Tyto metody jsou ovšem velmi náročné na přípravu vzorku, musí být ovládány dobře proškoleným personálem a v neposlední řadě jsou velmi finančně náročné. Jejich velmi dobrým konkurentem jsou biosensory. Od roku 1986 v porovnáním s rokem 2005 podle databáze Web of Science (WOS) došlo k nárůstu vědeckých prací obsahujících ve svém názvu, abstraktu či klíčových slovech pojem ,,biosensor*" o více než 5500 % (Obr. 1). Z celkového počtu nalezených prací obsahovalo 92 kromě výrazu biosensor* také výraz ,,cadmium" a 134 výraz ,,zinc". Z průběhu daného obrázku je jasně patrné, že se využití biosensorů bude v dalších letech stále zvyšovat. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Početpublikací Jednotlivá léta Obrázek 1.: Vývoj počtu publikací od roku 1986 až po rok 2005 obsahujících ve svém názvu, abstraktu či klíčových slovech pojem ,,biosensor*" podle databáze Web of Science. 9 1. Těžké kovy Těžké kovy ( > 5 g.cm­3 ) jsou přírodní složkou Zemské kůry. Nemohou být degradovány na jednodušší látky ani zničeny. Podle vlivu na lidský organismus dělíme těžké kovy vstupující do potravních řetězců všech živých organismů na dvě skupiny: toxické a esenciální [2]. 1.1 Esenciální těžké kovy Esenciální těžké kovy jsou pro mnoho organismů nezbytné pro život. Vyskytují se jako složky mnoha enzymů a proteinů. Je důležité upozornit, že vysoké koncentrace esenciální těžkých kovů mají za určitých podmínek toxické účinky stejně jako jejich nedostatek (Obr. 2). Obrázek 2.: Na organismy působí ionty kovů ­ 1. toxicky (takové látky označujeme jako jedy). Již velmi nízká koncentrace vyvolá závažnou, většinou nevratnou negativní metabolickou změnu, která vede ke smrti organismu (tmavě zelená). 2. chronicky (světle zelená). Méně toxické ionty kovů vyvolávají v organismech závažné negativní metabolické změny (nemusí končit smrtí organismu). U iontů kovů, které jsou potřebné pro organismus (esenciální), pozorujeme nejdříve pozitivní zvyšování metabolické aktivity, až do koncentrace optima. Při dalším zvyšování koncentrace kovu nedochází ke změně metabolické aktivity (fáze nadbytku ­ luxusu). V určité koncentraci kovu však dochází k prudké negativní metabolické aktivitě (červená). Mezi esenciální těžké kovy se zpravidla řadí kobalt, měď, železo, mangan, molybden, nikl, selen, vanad a zinek. Měďnaté ionty slouží jako součást aktivních center některých enzymů. Měď je také nezbytná pro efektivní využití železa a pro biosyntézu některých fyziologicky významných sloučenin. Hořčík je součástí listového barviva chlorofylu. Mangan významně ovlivňuje oxidačně-redukční procesy při přeměně dvojmocného železa na železo trojmocné. A jedním z nejzajímavějších a nejstudovanějších esenciálních těžkých kovů je zinek [3]. 10 1.1.1 Zinek Čerstvě připravený zinek je stříbřitý s namodralým leskem, který rychle na vlhkém vzduchu ztrácí. Je to relativně měkký kov, snadno reaguje s anorganickými kyselinami i s organickými látkami. Ve sloučeninách se vyskytuje ve stavu Zn(II) [2]. Obsah zinku v zemské kůře je 68 ppm. Je to chalkofilní prvek, který se v redukční atmosféře, která převládala při tuhnutí zemské kůry, vyloučil jako sfalerit (nebo vzácněji jako wurtzit) ZnS. Vlivem povětrnostních podmínek došlo později k vyluhování části zinku a k jeho vysrážení ve formě uhličitanu ZnCO3 (kalamín), křemičitanu nebo fosforečnanu [2]. Obrázek 3.: Lidský zinkový prst FYVE, www.expasy.org. Zinek je esenciální pro většinu organismů a zároveň je druhým nejčastěji se vyskytujícím přechodným kovem v jejich tělech. Je známo, že lidské tělo obsahuje průměrně 2 g tohoto kovu. Nejvíce distribuován je krvi, játrech, ledvinách, kostech a mozku. Zinek je kofaktorem pro více než 300 enzymů anebo metaloproteinů, přičemž celkový seznam proteinů obsažených v lidském těle, které ve své molekule obsahují tento kov, obsahuje více než tři tisíce záznamů. Tyto zinek-obsahující proteiny a enzymy hrají mnoho důležitých, biologicky významných rolí v mitotickém buněčném dělení, syntéze proteinů, DNA a RNA syntéze atd. [4, 5]. Mezi jedny z nejdůležitějších enzymů obsahujících tento esenciální těžký kov patří karboxypeptidasa A (katalyzuje v procesu trávení hydrolýzu koncové peptidické vazby v bílkovinách) a karbonatdehydratasa (existuje v několika formách a je značně rozšířena rostlinách i zvířatech) [3]. Je zcela nezbytné zmínit také zinkové prsty, což je doména v proteinech, která je schopna se vázat 11 na DNA (Obr. 3). Skládá se ze dvou antiparalelních řetězců a helixu. Struktura každého zinkového prstu je vysoce konzervativní a obsahuje okolo 30 aminokyselinových zbytků, které mají ve svém středu zinek [3, 4]. Díky všem svým funkcím je zinek naprosto nezbytný pro správný růst a vývoj organismu [5]. V roce 1961 byla poprvé publikována práce, kde bylo popsáno, že nedostatek zinku způsobuje u lidí zakrslost a zpomalený fyzický a sexuální vývoj [6]. Dnes je všeobecně známo, že nedostatek zinku způsobuje poškození imunitního systému, nepříznivě ovlivňuje růst těla a sexuální vývoj, a že vede k poruchám čichových a chuťových vjemů. Také je velmi zajímavá a stále ne zcela objasněná je role tohoto prvku v mozku, kde je nejvíce zastoupeným kovem [4, 7, 8]. 1.2 Toxické těžké kovy Toxicita je vlastnost, která vyjadřuje míru škodlivosti (jedovatosti) dané látky na živý organismus, resp. na jeho části. Míra toxicity pro organismus závisí na dávce látky, velikosti organismu, na způsobu vstupu do organismu, délky expozice, metabolismu aj. [3]. Toxické těžké kovy jsou obecně charakteristické svou vysokou nebezpečností pro organismy a představují jednu z nejvýznamnějších skupin škodlivých látek. V prostředí se vyskytují přirozeně a nebo mohou být původu antropogenního tj., že jsou produkovány působením člověka. Toxickými těžkými kovy pro člověka jsou nejčastěji označovány arsen, kadmium, olovo a rtuť [2, 3]. 1.2.1 Kadmium Kadmium (Cd) je stříbřitý chalkofilní kov, v anorganických i organických sloučeninách se vyskytuje v oxidačním stupni +2. S organickými sloučeninami tvoří mnoho komplexů (např. thiokarbamáty). Obsah kadmia v zemské kůře je 0.16 ppm (např. minerál greenockitu ­ CdS) [2]. Kadmium je poměrně vzácný prvek a nemá esenciální podobu v žádném živém organismu, proto je i jeho malá koncentrace pro organismus toxická (tolerovaná denní dávka kadmia pro dospělého člověka činí 67 ­ 83 g, zatímco LD50 je 88 mg/kg při orálním podání CdCl2 pro krysu). Má podobnou elektronegativitu a podobné chemické vlastnosti jako esenciální těžký kov zinek a to způsobuje, že se toxicita kadmia projevuje výhradně tehdy, když nahrazuje zinek v životně důležitých proteinech (zinkové prsty). 12 K tomu přispívá i stejný mechanismus příjmu a transportu těchto dvou kovů v organismu. Iontový poloměr Zn (0.074 nm) je však nižší než iontový poloměr Cd (0.097 nm), a to při společném vstupu kovů ulehčuje Zn, aby přednostně obsadil cílová místa v proteinech, a tím celkově snižoval toxicitu kadmia [9]. Od začátku padesátých let minulého století se pozornost široké vědecké veřejnosti zaměřila na studium toxicity kadmia a nebezpečnosti jeho akumulace pro lidskou populaci. Kadmium je označován jako kumulativní jed, jehož obsah se zvyšuje se stoupajícím věkem živého organismu. Nejvíce zasaženým orgánem jsou ledviny [10]. Při dosažení kritického koncentrace může dojít až k selhání tohoto orgánu. Ačkoliv některé studie ukazují, že tyto efekty jsou reversibilní v případě krátkého vystavení tomuto kovu a následnému snížení jeho koncentrace [11]. Kromě výše zmíněné poruchy funkce ledvin může kadmium způsobovat průjmy, bolesti žaludku, zvracení, zvýšenou lámavost kostí, narušení reprodukce a v některých případech i neplodnost, poškození nervového a imunitního systému, psychické nemoci a pravděpodobně poškozuje DNA [3, 12, 13]. Jeho vliv na vývoj rakoviny je studován [14, 15]. Pro nekuřáky je největším zdrojem kadmia potrava. Je to hlavně způsobeno přítomností stopových množství tohoto prvku v potravinách například z důvodu používání fosfátových hnojiv. Mezi potraviny s nejvyšším obsahem tohoto toxického prvku patří houby, měkkýši a kakao. Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) je průměrný denní příjem kadmia 10-25 g na den a osobu, což je přibližně čtyřikrát méně, než je doporučná denní dávka. Je nezbytné zmínit, že se tato dávka může měnit v závislosti na místě a průmyslové výrobě v dané oblasti. 1.3 Využití kovů v lékařství Mnoho kovových prvků hraje velmi významnou roli v živých systémech. Obecná charakteristika těchto kovů je schopnost ztrácet elektrony, získávat tak pozitivní náboj a dobrá rozpustnost v biologických tekutinách. V tělech organismů se kovy tedy vyskytují v podobě kationů, i přesto, že tento stav je elektron deficitní. Výskyt kovů v podobě kationů v živých systémech umožňují proteiny a DNA, na které se kovy váží, protože tyto velmi důležité biologické molekuly jsou bohaté na elektrony a jsou tedy schopny stabilizovat pozitivně nabité kovy. A právě přitažlivost kladně nabitých kovů a proteinů bohatých na elektrony vysvětluje vysokou pravděpodobnost vytvoření vazby mezi těmito látkami. Tento princip se dále uplatňuje při vazbě mnoha malých molekul a iontů, které 13 jsou naprosto nezbytné pro život jako např. O2, na kovy vázané v proteinech. Při posouzení těchto vlastností není překvapivé, že evoluce postupně zapojila mnoho kovů do životně důležitých biologických funkcí [16, 17]. Díky výše zmíněným vlastnostem vyvstává otázka: ,,Mohou být kovy použity při tvorbě léčiv? Jsou koordinační sloučeniny potencionálními léčivy? Mohou být kovy využity pro medicínské účely?". Oblast výzkumu zabývající se odpověďmi na tyto otázky lze nazvat jako lékařskou anorganickou chemii [17]. Lékařská anorganická chemie byla a je praktikována po více než pět tisíc let [18]. Jako příklad slouží doba 3000 let před Kristem, kdy Egypťané používali měď pro sterilizaci vody. Zlato bylo užíváno v různých medicínských postupech v Číně a Arábii před více jak 3500 lety, však nikoliv z důvodu jeho léčebných vlastností ale především kvůli jeho vysoké ceně a velmi vzácnému výskytu v přírodě. Tradovalo se totiž, že pokud je zlato tak vzácné a cenné, musí být přece zdraví prospěšné. Dalším velmi intenzivně využívaným kovem bylo železo, které používali v medicíně Egypťané v letech 1500 před Kristem. Ve stejné době bylo objeveno, že i zinek je zdraví prospěšný, konkrétně, že urychluje hojení různých druhů zranění. V době renesance v Evropě byl používán chlorid rtuťnatý jako močopudná látka. Ve stejné době byla objevena nutriční esenciálnost železa. Ovšem skutečně racionální vyžívání anorganických léčiv začalo teprve před sto lety, kdy byl vyvinut komplex zlata K[Au(CN)2] pro léčbu tuberkulózy, různé sloučeniny antimonu pro léčbu leishmaniózy (což je kožní nemoc projevující se tvorbou rozsáhlých vředů a destruující pokožku i vnitřní orgány zvířat i lidí; je způsobena prvokem leishmanií, kterou do kůže zanesou drobní komáři-flebotomové), soli zlata pro své antibakteriální účinky a arsen pro léčbu sifylis. Lékařská anorganická chemie existuje jako vědní disciplína více než 40 let, přičemž základním kamenem bylo objevení protinádorových vlastností cisplatiny (komplex cis-diaminodichloroplatnatý ­ cis-[Pt(NH3)2Cl2]) [19, 20]. Jeho biologická aktivita byla objevena v roce 1965 Rosenborgem během jeho studií vlivu elektrického proudu na růst bakterií [21]. I přesto, že od jeho objevu uplynulo více než čtyřicet let, je cisplatina stále nejčastěji používaným cytotoxickým prostředkem při léčbě různých druhů nádorových onemocnění. Ovšem vývoj pokračoval dál a během těch čtyřiceti let byly objeveny stovky platnatých a platičitých komplexů, které byly s většími či menšími úspěchy testovány při léčbě nádorových onemocnění [22, 23]. V osmdesátých letech minulého století byla vyvinuta platinová léčiva ,,druhé generace", jejichž zástupcem je karboplatina 14 [cis-diamino(1,1-cyklobutan-dikarboxyláto)platnatý komplex)], jako méně toxická alternativa k cisplatině vykazující méně vedlejších efektů [24, 25]. Zatímco oxaliplatina [oxaláto-1,2-diaminocyklohexan platnatý komplex] byla navržena v letech devadesátých jako další, již ,,třetí generace" platinových léčiv [19, 26, 27]. Její hlavní předností je schopnost překonání resistence nádorových buněk vůči cisplatině a karboplatině. Kromě těchto obecně používaných léčiv je stále vyvíjena řada dalších jako například LA-12 [(OC-6-43)-bis-(acetáto)(1-adamantylamin)amminodichloro platičitý komplex] [28, 29]. cisplatina carboplatina oxaliplatina ormaplatina Pt(II)-DNA adukt Pt(II)-DNA adukt cisplatina carboplatina oxaliplatina ormaplatina Pt(II)-DNA adukt Pt(II)-DNA adukt Obrázek 4.: Vybraná platinová cytostatika a jejich DNA adukty. Převzato z práce Chaney et al. [30]. Ačkoliv jsou platinová cytostatika úspěšně aplikována při chemoterapii různých typů rakoviny po více než třicet let, jejich biochemický účinek není ještě dosud zcela jasný. Dnes obecně akceptovaným názorem je, že toto léčivo indukuje své cytotoxické vlastnosti prostřednictvím vazby na buněčnou DNA a následně tak narušuje transkripci a DNA replikační mechanismy [20, 31]. Chaney et.al. [30, 32] a další [33, 34] objevili, že cisplatina, karboplatina a oxaliplatina tvoří stejné typy aduktů na stejných místech v molekule DNA (Obr. 4). Konkrétně, platinová cytostatika se dokáží vázat na N7 dvou sousedících guaninů anebo adeninů, přičemž daný dusík už není schopen vytvářet vazbu pomocí vodíkových můstků s dalšími bázemi, které leží ve stejném nebo protějším vláknu DNA. Ze studií vyplývá, že průměrně vzniká 60 ­ 65 % GG Pt-DNA aduktů uvnitř jednoho vlákna, 25 ­ 30 % AG Pt-DNA aduktů uvnitř jednoho vlákna, 5 ­ 10 % GNG Pt-DNA aduktů uvnitř jednoho vlákna, a 1 ­ 3 % GG mezivláknových diaduktů Pt-DNA [30, 34]. Velmi vzácně se také objevují Pt-DNA monoadukty, kde se platinové cytostatikum převážně váže na N7 guaninu [30, 34]. Na Obr. 4 je zobrazeno schéma tvorby 15 Pt aduktů s jadernou DNA (Obr. 5). Samotný proces hydrolýzy cisplatiny je výrazným způsobem ovlivňován pH (Obr. 6). Cisplatina Jaderná obálka Deoxyribosa Báze Fosfát Reakce s celulárními thioly (GSH a MT), RNA, mitochondriální DNA Adukty uvnitř jednoho vlákna Mono-adukt Mezivláknový adukt Cisplatina Jaderná obálka Deoxyribosa Báze Fosfát Reakce s celulárními thioly (GSH a MT), RNA, mitochondriální DNA Adukty uvnitř jednoho vlákna Mono-adukt Mezivláknový adukt Obrázek 5.: Tvorba aduktů cisplatiny s DNA: jakmile cisplatina vstoupí do buňky, jsou její chloridové ligandy hydrolyzovány a vytvoří se tak positivně nabitý aqua komplex, který je schopen reagovat s nukleofillními místy na intracelulárních makromolekulách. Následně dochází k tvorbě protein (např. celulární thioly GSH ­ glutathion a MT ­ metalothionein), RNA a DNA aduktů. Reakce cisplatiny s DNA poskytuje monoadkuty, adukty uvnitř jednoho vlákna a mezivláknové adukty. Převzato z práce Kartalou et al. [34]. Obrázek 6.: Schématické zobrazení rovnovážných konstant ovlivňujících produkty hydrolýzy cisplatiny. Převzato z [35]. 16 1.4 Metody pro stanovení těžkých kovů Pro studium těžkých kovů je nyní využíváno mnoho analytických metod od spektrofotometrických až po elektrochemické. Nejrozšířenější metodou pro stanovení těžkých kovů je v nynější době atomová absorpční spektrometrie (AAS), která je používána pro široké spektrum biologických a environmentálních vzorků [36-42]. A navíc byl nedávno publikován souhrnný článek popisující využití průtokové injekční analýzy ve spojení s AAS ke stanovení stopových množství těžkých kovů [43]. Mezi metody využívající pro detekci těžkých kovů indukčně vázaného plazmatu patří hmotnostní spektrometrie (ICP-MS) [44-47] a optická emisní spektrometrie (ICP-OES) [46, 48-50]. Metody ICP-MS využil například Ayrault et. al. pro detekci těžkých kovů v ovzduší [51] nebo Lee et. al. pro studium environmentálních vzorků [52]. Naopak de la Rosa et. al. využili techniku ICP-OES pro velmi citlivé stanovení iontů kadmia [53]. Výhody a nevýhody ICP-MS a ICP-OES byly shrnuty a porovnány Grotiim et. al. [54]. Kromě klasických metod spektrálních se stále častěji prosazují velmi citlivé, rychlé a levné metody elektrochemické. Jednou z nejcitlivějších analytických metod pro analýzu kovů je diferenční pulzní anodická rozpouštěcí voltametrie (DPASV) [55-62]. Mezi nejnovější elektrochemické metody, které jsou využívány pro stanovení kovů, je odčítací anodická rozpouštěcí voltametrie [63]. Výše uvedené metody využívají jako pracovní elektrodu převážně visící rtuťovou kapkovou elektrodu, ovšem lze také využít speciální elektrody jako např. bizmutovou elektrodu [57, 61, 64] a uhlíkovou elektrodu, která se využívá pro detekci platinových cytostatik [65]. Nedávno bylo publikováno několik prací popisujících stanovení těžkých kovů pomocí biosenzorů založených na interakci těžkého kovu s DNA [66-70], enzymem (především ureasou, kde se detekuje snížení aktivity enzymu) [71-74], bakterií [75, 76] a proteinem [77-80]. Wu a Lin publikovali práci popisující využití metalothioneinu pro konstrukci proteinového biosensoru detekujícího těžké kovy [77]. 17 2. Biosensory Biosensor je analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupiny) chemických látek ve vzorku [81]. Ovšem definice biosensoru má své úskalí. Představme si skupinu osob rozptýlených náhodně po poli, přičemž každá z nich má telefon a hlásí pozorování podmíněná čichem, sluchem, chutí a dotykem. Takový soubor pozorovatelů může poskytovat informace o povaze, intenzitě, prostorovém umístění a časovém průběhu chemických stimulů v daném prostoru. Přitom to bude biosensor ­ má rozpoznávací element (lidé) i převodník (telefony). Je patrné, že pojem biosensor je široce použitelný, velmi populární i módní. Kromě toho je aplikace biosensorů mezioborové, zasahuje do oblastí biochemie a biotechnologie, analytické a fyzikální chemie, elektroniky, informatiky a nauky o materiálech [82]. Enzym Mikro- organismus Protilátka Protein Peptid DNA Buňka Převodník signálu ­ fyzikálně chemická část Bioreceptor ­ biologická část Elektrický signál elektroaktivní substance změna pH teplo světlo změna hmoty elektroda pH elektroda termistor foto-dioda piezoelektrické zařízení Stanovovaná látka Interferenty Obrázek 7.: Princip funkce biosensoru. Bioreceptor (např. enzym, peptid protilátka) je vhodně navázán na fyzikálně-chemický převodník (elektrody, termistor, piezoelektrické zařízení), který je schopen při navázání stanovované látky na biologickou část biosensoru detekovat změnu vyjádřenou teplem, světlem, změnou hmoty a dalších. Základní schéma biosensoru je zobrazeno na Obr. 7. Z obrázku vyplývá, že se biosensor obecně skládá z biologické části (tzv. bioreceptoru či biorekogničního prvku) a fyzikálně chemického převodníku. 18 2.1 Vlastnosti biosensoru Citlivost je konečná ustálená změna výstupního signálu biosensoru (S) v důsledku změny koncentrace analytu (c), tj. S/c, nebo dS/dc. Při provádění kinetických měření (sleduje se časová změna signálu dS/dt) se citlivost vypočítá jako (dS/dt)/c. Speciálními druhy signálu mohou být plocha (časový integrál), frekvenční analýza apod. V ideálním případě by citlivost měla být konstantní a maximální po celou dobu životnosti biosensoru [82]. Kalibrace spočívá ve vystavení biosensoru různým standardním roztokům o známé koncentraci analytu. Kalibrační body by měly uzavírat pracovní oblast biosensoru, aby nebylo třeba provádět nespolehlivé extrapolace. Je vhodné použít co nejméně kalibračních bodů, pokud je znám tvar kalibrační závislosti (nejvhodnější je samozřejmě přímka), stačí 1 nebo 2 body. Ideálně by stačilo provést kalibraci pouze 1 × pro nový biosensor, prakticky je ji nutné periodicky opakovat [82]. Linearita u ideálního biosensoru existuje v celé pracovní oblasti, tj. biosensor má konstantní citlivost pro všechny možné koncentrace analytu, tj. od limitu detekce pro daný biosensor po limit daný rozpustností. Prakticky je oblast linearity pouze užším intervalem uvnitř pracovní oblasti. Nelineární části existují zpravidla v horní části (oblast saturace). Pro praktické použití biosensorů není linearita nezbytně nutná (počítače), ale je třeba mít stálý průběh kalibrační křivky. Nelineární úseky lze např. aproximovat několika přímkami. Nelineární kalibrační závislosti samozřejmě vyžadují víc kalibračních bodů a komplikují praktické použití [82]. Šum je zejména elektromagnetické povahy, lze ho omezit elektrickým stíněním biosensoru a přívodních vodičů. Jiným zdrojem šumu mohou být turbulence vznikající při míchání. Snížení velikosti šumu lze dosáhnout uspořádáním elektronických měřících obvodů (frekvenční závislosti zesilovačů, analogové filtry) nebo digitálními technikami (akumulace signálu, průměrování, vyhlazování) [82-84]. Limit detekce (LOD, limit of detection) biosensoru je nejnižší stanovitelná koncentrace analytu. Ideálně je dán rozlišením elektronického měřícího přístroje, obvykle je však zhoršován vedlejšími procesy. Pro definici se často používá velikost šumu (N, noise) signálu a limit detekce se bere pro poměr S/N = 3 [82, 83]. S tímto výrazem se pojí mez stanovitelnosti metody (LOQ, limit of quantification), což je nejnižší množství analytu ve vzorku, které může být stanoveno jako exaktní hodnota s požadovanou hodnotou nejistoty. 19 Signál pozadí (background) je signál v nepřítomnosti analytu, obvykle se automaticky odečítá od měřeného signálu: S = S(měřený) - S(pozadí). V některých případech je výhodnější použít referentní koncentraci analytu a vůči ní vztáhnout měřený signál [82]. Hystereze značí vliv minulých měření na aktuální signál. Ideálně by měla být nulová. Pozná se ze změny tvaru kalibračních křivek ­ objevuje se na nich konkávní resp. konvexní prohyb. Důvodem může být to, že vysoká koncentrace analytu může narušit okolí biosensoru nebo prostředí uvnitř bioreceptoru (nahromadění produktů reakce, lokální změny pH či teploty) a to ovlivní následující měření. Vliv hysterese se může omezit zpomalením měření [82]. Dlouhodobá stabilita (drift) je podmíněna změnami citlivosti biosensoru v čase. Citlivost obvykle klesá, ale může i přechodně vzrůst (změna biovrstvy - ztenčení, nabobtnání). Postupný pokles citlivosti může být vyvolán oxidací povrchu kovových elektrod, usazováním vrstev proteinů či jiných biomolekul (měření in vivo), otrava biovrstvy těžkými kovy [82, 83]. Selektivita (vliv interferencí). Odezva biosensoru by měla být vyvolána pouze přítomností stanovované látky, ostatní látky by se neměly projevit. Prakticky je často nutné rušivé látky eliminovat (zředění, selektivní bariéra) nebo jejich příspěvek na měřený signál paralelně určit jiným sensorem [82]. Rychlost odezvy je určována zejména fyzikálními vlastnostmi biosensoru (velikost). Závisí na rychlosti difúze analytu z okolního prostředí k povrchu biosensoru a dále pak vnitřní difúzí uvnitř systému biosensoru. Uplatňují se koncentrace analytu, velikost difúzních koeficientů, délka difúzní dráhy (počet vrstev biosensoru). Z praktického hlediska je výhodné, pokud odezva je limitována difúzí a nikoliv rychlostí bioreakce [82]. Doba odezvy se obvykle určuje jako čas potřebný k dosažení určité velikosti signálu v konečném ustáleném stavu (), např. t 90 pro dosažení 90 % [82]. Rychlost konvekce je určena přísunem látek z okolí k biosensoru. Lze ji zvýšit zrychleným mícháním nebo tokem nosného média, je ovšem třeba dát pozor na vznik turbulentních jevů, které zase konvekci mohou zpomalit [82]. Teplotní závislost při měřeních s biosensory působí jednak na difúzní jevy, jednak na probíhající chemické reakce. Proto se obvykle pracuje za isotermických podmínek, používá se vodní cirkulující termostat nebo vyhřívaný kovový blok [82]. 20 Životnost biosensoru je obvykle limitována nejslabším prvkem, což je bioreceptor. Přitom je třeba odlišit stabilitu při skladování (shelf life) od operační stability, která může být závislá na počtu a druhu analyzovaných vzorků. Pro dlouhodobé uložení biosensoru je obecně vhodná nižší teplota (chladnička, mraznička), z praktického hlediska je pohodlnější skladování v suchém stavu [82]. Biokompatibilita má zvláštní význam pro biomedicínské aplikace (měření in vivo). Při umístění biosensoru přímo v krevním toku je třeba zamezit srážení krve (impregnace heparinem), ve tkáních hrozí nebezpečí zánětlivých reakcí, zajizvení a zarůstání pojivovou tkání. Případná sterilizace biosensoru nesmí negativně ovlivnit jeho aktivitu [82]. 2.2 Fyzikálně-chemické převodníky Pro konstrukci biosensorů se obecně používají čtyři různé druhy fyzikálně- chemických převodníků a to elektrochemické, optické, piezoelektrické a akustické, a kalorimetrické. Elektrochemické systémy reprezentují nejrozšířenější typ převodníku používaného pro konstrukci biosensorů, zejména katalytických. Hlavními výhodami jsou jednoduchá konstrukce měřícího systému, nízké pořizovací náklady a výborná citlivost. Pro sestavení elektrochemického měřícího systému jsou zapotřebí nejméně dvě elektrody ­ pracovní (měřící) a referentní. Podle aplikace a konstrukce biosensoru může být tento dvouelektrodový systém doplněn o elektrodu pomocnou [82, 85]. 2.2.1 Elektrody Samotné tříelektrodové zapojení, které bylo naznačeno v předchozí kapitole, má mnoho výhod oproti dvouelektrodovému. Jednou z hlavních pro samotné použití biosensoru v praxi je citlivost, která je v případě tříelektrodového zapojení řádově vyšší ve srovnání s použitím dvou elektrod. Tříelektrodového zapojení je ukázáno na Obr. 8. 2.2.1.1 Pracovní elektrody Elektrody představují jednu z významných možností jak snadno a rychle provést analýzu v environmentálním prostředí nebo v automatických systémech. Cílem je zavést jednoduchou a rychlou analýzu přímo in vivo. Pro elektrochemickou analýzu jsou využívány polarizovatelné elektrody. Polarizovatelné elektrody můžeme rozdělit na dvě hlavní skupiny rtuťové a pevné elektrody. 21 Obrázek 8.: Schéma tříelektrodového zapojení ve voltametrii (a) ; Schéma elektrolytické nádobky (b): W ­ pracovní elektroda, R ­ referentní elektroda, A ­ pomocná elektroda, M - míchadélko, N2 ­ přívod inertního plynu [85]. Rtuťové elektrody Pro své dobré elektrické vlastnosti se nejčastěji používají kovové elektrody [86], mezi nimiž má zvláštní postavení rtuťová elektroda. Rtuťová elektroda má dokonale obnovitelný povrch, což je velmi výhodné při elektroanalytickém stanovení. Rtuťová elektroda je polarizovatelná ve větším rozsahu negativnějších potenciálů ve srovnání s ostatními kovovými elektrodami (díky vysokému přepětí vodíku na rtuti) a umožňuje sledování dějů probíhajících i ve velmi negativních oblastech potenciálů (až do ­2 V) vzhledem k nasycené kalomelové elektrodě (saturated calomel electrode ­ SCE). Rtuťové elektrody můžeme rozdělit na dvě hlavní skupiny: ˇ Kapající rtuťová elektroda (dropping mercury electrode; DME), která je využívaná v polarografické analýze. Hlavní výhodou je snadno definovatelný a obnovitelný povrch. Nevýhodou jsou velké nároky na objem analytu (1 ­ 2 ml). ˇ Visící rtuťová kapková elektroda (hanging mercury drop electrode; HMDE). HMDE je využívaná především ve voltametrii. Výhodou je, že celý experiment probíhá na jedné kapce (pracovní elektrodě). Studovaný analyt je možno akumulovat na elektrodě. Navíc je možné použit transferových metod. Pevné elektrody: Podle jejich složení je možné je rozdělit na uhlíkové a kovové: ˇ Uhlíkové. Uhlíkové elektrody jsou při studiu biologicky aktivních látek vhodným doplněním elektrod rtuťových, neboť jsou polarizovatelné do oblasti kladných potenciálů (až nad +1 V na rozdíl od HMDE, kterou lze polarizovat jen asi 22 k +0,2 V), čímž se rozšiřuje využitelná potenciálová oblast a možnost elektrochemického studia těchto látek. Nejvíce používanou pevnou pracovní elektrodou je uhlíková elektroda ze skelného uhlíku (glassy carbon electrode, GCE). GCE je připravován z polymerních fenolformaldehydových živic při kontrolovaném zahřívání v inertní atmosféře. Do této skupiny dále patří uhlíková elektroda z pyrolytického grafitu (pyrolytic graphite electrode; PGE). Významné postavení má uhlíková pastová elektroda CPE (carbon paste electrode; CPE). CPE je vyrobená ze směsi práškového grafitu (85%) a minerálního oleje (maximálně do 15%). Do CPE je možné dále přidávat další rozdílné příměsi. Složkami modifikované CPE mohou být jak nízkomolekulární látky tak i vysokomolekulární látky. Kromě oleje je možné do uhlíkové elektrody vmísit vosk, a tak vzniká vosková uhlíková elektroda (WISGE), případně parafínem impregnovaná grafitová elektroda (PIGE). Z uhlíkových vláken je možné připravovat ultramikroelektrody. Vlastní uhlíkové vlákno (5­20 m se umístí do ústí skleněné kapiláry a upevní epoxidovým lepidlem. Síťovaný sklovitý uhlík (reticulated vitreous carbon; RVC) našel využití v průtokové analýze. Díky své vysoké pórovitosti má velký povrch a klade velmi nízký odpor protékající kapalině. ˇ Kovové. Pracovní povrch elektrod může být dále modifikován. Hlavním smyslem modifikace povrchu elektrody je zvýšení selektivity a citlivost. Povrch pevné elektrody může být pokryt vrstvou rtuti (vzniká filmová elektroda), nebo lipidy apod.. Další zajímavou možností je interakce kovu v elektrodě se rtutí za vzniku amalgámy. Takové elektrody jsou označovány jako amalgámové. Elektrody mohou být podle jejich velikosti rozlišeny na makroelektrody (velikost plochy v cm2 ), minielektrody (DME, velké HMDE), semimikroelektrody (některé HMDE), mikroelektrody (meniskové elektrody) a ultramikroelektrody. V určitých případech analýzy je třeba zajistit dvě základní podmínky: a) miniaturizaci celého elektrodového systému; b) reprodukovatelnost měřícího postupu. Miniaturizace s sebou přináší výrazné zmenšení povrchu pracovní elektrody a tím je potřebné zajistit výrazně vyšší citlivost stanovení studovaného analytu. Plocha takové elektrody se z jednotek mm2 zmenšuje na m2 . Kromě vlastní měřící elektrody je důležité, aby došlo k výraznému zmenšení referentní elektrody. 23 2.2.1.2 Referentní elektrody Referentní elektrody slouží jako srovnávací bod pro měření respektive nastavování potenciálu pracovních elektrod. Jejich vlastní potenciál je přesně definovaný a pokud možno časově stálý. Mezi nejčastěji používané referentní elektrody patří elektrody druhého druhu, které jsou tvořeny kovem pokrytým vrstvičkou málo rozpustné soli a ponořený v roztoku anionů této soli [85, 87, 88]. U vyráběných elektrod se vždy před použitím zkontroluje hodnota potenciálu vůči kvalitní referentní elektrodě. Referentní elektrody se obvykle uchovávají v roztoku KCl a nesmí se nechat vyschnout. U amperometrických biosensorů, kdy stabilita referentní elektrody není až tak kritická, se často používá pouze holý povrch stříbra a jako elektrolyt slouží okolní prostředí [85]. 2.2.1.3 Pomocné elektrody Pomocné elektrody musí být tvořeny z dobrého vodiče s dostatečnou plochou a elektrochemicky neaktivní. Používá se platina ve formě drátku či plíšku, uhlíková tyčinka, mnohdy stačí i nerezový drát [82, 85]. Hlavním funkcí pomocné elektrody je zbavit proudového zatížení referentní elektrodu a tím snížit šum a chybu stanovení [86]. 2.3 Bioreceptory Bioreceptor je velmi kritickou složkou biosensoru. Na jeho ,,správné" funkci záleží úspěch celé analýzy. Podle druhu dělíme bioreceptory na biokatalytické (enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, organismus; analyt přeměňují v průběhu chemické reakce) a bioafinitní (lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor; analyt váží v afinitním komplexu) [82, 89-91]. Nedávno bylo publikováno využití kovy vázajícího thiolu pro jako biologické složky biosensoru pro detekci těžkých kovů [77]. 2.3.1 Thiolové sloučeniny Síra existuje v mnoha oxidačních stavech, což z ní dělá velmi univerzální prvek nezbytný v mnoha biologických sloučeninách a systémech [92]. Nejvíce aktivní a zároveň redukovanou formou síry v biomolekulách je thiolová skupina (­SH). Můžeme ji nalézt ve velkém množství biologicky aktivních látek jako je aminokyselina cystein (Obr. 9), neproteinová aminokyselina homocystein a mnoho dalších. Thiolové sloučeniny mají velké množství biologických funkcí jako jsou například kontrola genové exprese [92], 24 signalizace a detoxikace těžkých kovů [93-98]. Kromě toho mohou také sloužit jako markery mnoha různých onemocnění [99]. 2.3.1.1 Glutathion Glutathion (GSH) je ve vodě rozpustný tripeptid skládající se z glutaminu, cysteinu a glycinu (Obr. 9) a je nejrozšířenějším neproteinovým thiolem, vyskytujícím se prakticky ve všech buňkách rostlinných i živočišných organismů, hub a v některých prokaryotických organismech. C HNH CH2 HHOOC CH2 C O NH C CH2SH C H O NH CH2 COOH n (-glutamylcysteinyl)n glycin NH NH O S O S O HO NH2 HN O OHHN O OO HO H2N O OH GSH GSSG HN HN O HS O O HO NH 2 O OH NH2 O SH OH Cys PC C HNH CH2 HHOOC CH2 C O NH C CH2SH C H O NH CH2 COOH n (-glutamylcysteinyl)n glycin C HNH CH2 HHOOC CH2 C O NH C CH2SH C H O NH CH2 COOH n (-glutamylcysteinyl)n glycin NH NH O S O S O HO NH2 HN O OHHN O OO HO H2N O OH NH NH O S O S O HO NH2 HN O OHHN O OO HO H2N O OH GSH GSSG HN HN O HS O O HO NH 2 O OHHN HN O HS O O HO NH 2 O OH NH2 O SH OH Cys PC Obrázek 9.: Chemická struktura cysteinu (Cys), redukovaného glutathionu (GSH), oxidovaného glutathionu (GSSG) a fytochelatinu (PC2). Jeho koncentrace může v některých tkáních či pletivech dosáhnout milimolární hladiny [93, 100]. Jako důležitý antioxidant, GSH hraje důležitou roli v detoxikaci mnoha elektrofilních sloučenin (např. těžkých kovů) a peroxidů prostřednictvím katalýzy glutathion S-transferázou a glutathion S-peroxidasou [93, 101]. Kromě detoxikace se GSH účastní i dalších buněčných celulárních reakcí zahrnujících glyoxalátový cyklus, redukci ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy, regulaci proteinové a genové exprese prostřednictvím thiol:disulfidové výměnné reakce [94, 102]. Glutathion může v organismu existovat ve dvou stavech: oxidovaném (GSSG) a redukovaném (GSH) (Obr. 9). Udržování optimálního poměru GSH:GSSG v buňce je kritické pro její přežití [103]. Nedostatek glutathionu vystavuje buňku nebezpečí oxidativního poškození [103, 104]. 25 A proto není překvapení, že nerovnováha tohoto poměru je pozorována v průběhu mnoha onemocněních např. rakoviny, neuro-degenerativní onemocnění, cystická fibróza, HIV i stárnutí [94, 102, 104]. 2.3.1.2 Fytochelatiny (PC) GSH je dále součástí významných rostlinných peptidů, které jsou označovány jako fytochelatiny [95, 105-108]. PC mají základní strukturu (-Glu-Cys)n-Gly [109, 110], kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu ( -Glu-Cys) může opakovat 2 až 11krát (nejčastěji 2­5krát) (Obr. 9) [95]. Koncová aminokyselina (Gly) může být nahrazena jinou aminokyselinou (Ala, Glu, Ser), potom hovoříme o iso-PC. PC obsahují velké množství cysteinu (SH skupiny odpovídají za vazbu iontů kovů) a jsou syntetizovány post-translačně redukcí GSH ­ takzvanou transpeptidizační reakcí [110]. U PC bylo studováno kromě funkce detoxikační, která má vztah především k těžkým kovům také funkce homeostatická u kovů esenciálních. Bylo navrženo, že PC hrají roli v metabolismu esenciálních prvků [98]. Například u Zn-PC a Cu-PC komplexů bylo potvrzeno, že mohou reaktivovat apoformu enzymu diamino oxidázy (transport Cu(II)) a karbon anhydrázy (transport Zn(II)) [111]. Autoři ale také prokázali, že z hlediska přenosu kovů k apoenzymu je komplex PC méně efektivní než samotné ionty kovu dodané v podobě sulfidu. Z těchto experimentů vyplývá, že v současné době jsou pouze nepřímé důkazy, že PC mají jinou roli než detoxikace iontů těžkých kovů. Role PC v metabolismu železa a síry byla navržena celou řadou autorů [98, 112]. 2.3.1.3 Metalothionein V živočišných organismech existuje také kovy vyvazující látka, protein metalothionein. Objev tohoto proteinu je datován rokem 1957, kdy Margoshes a Vallee izolovali nízkomolekulární protein z koňských ledvin. Metalothioneiny (MT) patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních na cystein bohatých proteinů o molekulové hmotnosti od 6­10 kDa [113-115]. Díky své vysoké afinitě k těžkým kovům (Zn, Cd, As, atd.) je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace iontů těžkých kovů v řadě různých organismů. Řetězec tohoto proteinu je složen z přibližně 60 aminokyselin (Obr. 10). V jeho molekule nejsou přítomny aromatické aminokyseliny a aminokyselina cystein nejvíce zastoupena. 26 20 9 8 5 5 3 2 2 2 2 1 1 1 C S K G A T N E M P D Q I aminokyseliny početaminokyselin Obrázek 10.: Zastoupení aminokyselin v molekule metalothioneinu. (C ­ cystein, S ­ serin, K ­ lysin, G ­ glycin, A ­ alanin, T ­ threonin, N ­ asparagin, E ­ kyselina glutamová, M ­ methionin, P ­ prolin, D ­ kyselina asparagová, Q ­ glutamin, I ­ isoleucin). Pomocí rentgenové krystalografické strukturní analýzy bylo zjištěno, že molekula MT se skládá ze dvou přibližně sférických domén a stejné velikosti o rozměrech 1.5 ­ 2.0 x 10-9 m, které jsou složeny z cysteinových klastrů. Sulfhydrylové zbytky cysteinů se účastní kovalentní vazby kovů (Obr. 11). N-terminální část peptidu, označená jako -doména, má tři vazebná místa pro dvojmocné ionty a C-terminální část (-doména) má schopnost vyvázat čtyři dvojmocné ionty kovů. V případě jednomocných iontů kovů je MT schopen vázat celkem až 12 atomů. Pro -doménu, která obsahuje 3 kovy (II) a 9 ­ S- skupin, byla navržena struktura cyklohexanu. Pro -doménu, která obsahuje 4 kovy (II) a 11-S- skupin, pak struktura adamantanu v jednom rohu otevřená. Výsledných 6 negativních nábojů je kompenzováno ­ NH3 + skupinami lysinu. Celkový záporný efektivní náboj se pohybuje v rozmezí 2 ­ 3 na molekulu MT. Domény se liší svojí stabilitou a afinitou ke kovům. Obecně je -doména méně stabilní vůči chelatačním i alkylačním činidlům působím na SH skupiny. Kovy nejsou distribuovány mezi doménami nahodilým způsobem. Afinita iontů kovů k -doméně klesá v pořadí Cd, Zn, Cu a k -doméně klesá v pořadí Cu, Zn, Cd [116-118]. cysteinylová skupina těžký kov -doména -doména 1 61 5 22 7 14 27 2516 30 20 60 58 61 51 37 35 38 42 45 49 34 cysteinylová skupina těžký kov -doména -doména 1 61 5 22 7 14 27 2516 30 20 60 58 61 51 37 35 38 42 45 49 34 Obrázek 11.: Předpokládané schéma vazebných domén ( a ) v molekule metalothioneinu. S: sulfhydrylové zbytky v molekule MT váží ionty kovů. 27 Na základě sekvenční analýzy bylo popsáno 15 MT rodin a 38 MT podrodin. Fylogenetický vztah různých rodin MT byl získán z proteinové a genové sekvence. Výsledky umožnily rozlišit fylogeneticky podobné rodiny a podrodiny evolučně podobných komplexů obratlovčích rodin MT. Metalothioneiny byly rozděleny nejdříve do tří tříd. Třída I jsou MT vyskytující se u různých savčích druhů. Třída II jsou všechny ostatní proteinové MT nepatřící do třídy I. Do třídy III byly zařazeny metaloisopolypeptidy obsahující gamaglutamyl-cysteinovou jednotku. Metalothioneinová superrodina je fenomenologicky definována jako polypeptidy odvozené od metalothioneinu z koňských ledvin. Základní obecnou vlastností je nízká molekulová hmotnost, vysoký obsah kovů, charakteristický aminokyselinový obsah (vysoký obsah cysteinů, nízký obsah aromatických aminokyselinových zbytků). Cysteinové zbytky vytváří repetice a tak thiolátové klastery. Bylo navrženo několik MT rodin na základě charakteristické sekvence genů. Členové jedné rodiny vykazují sekvenčně specifické podobnosti. Další rodiny byly identifikovány u řady taxonomických skupin. Dále bylo možné rozlišit podrodiny, podskupiny, isoformy a nebo alelické isoformy MT. Sekvenční podobnost však často není dostatečná, a proto byla navržena definice klanu. Klany, sdružují MT podle jiných vlastností, tj. obecné struktury, termodynamických vlastností, kovy vázajících skupin a pod [119-121]. Metalothionein nevykazuje absorpci v oblasti 280 nm, která je známa u bílkovin a odpovídá přítomnosti aromatických aminokyselin. V molekule metalothioneinu nejsou přítomné disulfidické můstky. Mohou se vyskytnout pouze jako artefakt, způsobený oxidací a vznikem polymerů. Metalothionein vykazuje v UV spektru absorpční pás, jehož maximum je přibližně shodné s absorpčním maximem komplexu daného kovu s thioly (např. maximum pro Cd-MT je 250 nm) [122]. Charakteristickou vlastností MT je uvolňování kovu v kyselém prostředí, čehož se využívá při přípravě apoMT. Masivní vzestup koncentrace MT byl pozorován u zvířat po intenzivním fyzikálním stresu. Fyziologická syntéza MT a koncentrace jsou závislé na průběhu buněčné proliferace. MT pravděpodobně umožňuje interakce mezi volným zinkem a vázaným do proteinů zinkových prstů, a tak jeho pravděpodobný vliv na genovou expresi. 2.4 Měřící uspořádání při práci s biosensory 2.4.1 Přímý kontakt se vzorkem Biosensor se nachází přímo ve sledovaném prostředí (řeka, tkáň, krevní řečiště, fermentor atd.). Přitom by jeho činnost neměla okolní prostředí ovlivnit - vyčerpávání 28 analytu důsledkem měření, ovlivnění toku jiných látek. Při tomto způsobu použití může být užitečné měnit polohu biosensoru, tak lze získat dodatečné informace o distribuci analytu v prostředí a odhalit případné existující koncentrační gradienty [82]. tubulární wall-jet tenká vrstva vstup vlastní detektor výstup tubulární wall-jet tenká vrstva vstup vlastní detektor výstup Obrázek 12.: Typy elektrochemického detektoru podle různého uspořádání v průtokovém systému [85]. Obrázek 13.: Různé konstrukce průtokových nádobek podle [85, 123]; (a) nádobka s pracovní elektrodou ze skelného uhlíku (GC) a pomocnou Pt elektrodou, referentní elektroda je umístěna do výpusti (není zobrazeno); (b) nádobka se visící rtuťovou kapkovou elektrodou (pracovní) (1) ­ 29 přítok, (2) ­ odtok, (3) ­ referentní elektroda, (4) ­ pomocná Pt elektroda (prstenec), (5) ­ membrána, (6) ­ kladivo (odklepávač kapek), (7) ­ rezervoár pro rtuťové kapky; (c) nádobka s pracovní elektrodou (W) ze skelného uhlíku anebo z uhlíkové pasty, A ­ pomocná elektroda, R ­ referentní elektroda; (d) nádobka s míchadélkem (G) a s pracovní elektrodou z porézního uhlíku (C), A,B ­ přítok a odtok, D ­ vodič, E ­ referentní elektroda, F ­ pomocná elektroda (Pt drátek). 2.4.2 Uzavřená nádoba Biosensor je umístěn ve vhodné nádobce (často opatřená vodním pláštěm pro temperaci a magnetickým míchadlem, Obr. 8). Nejprve se vyčká ustavení pozadí signálu v přítomnosti pracovního roztoku (pufr obsahující dle potřeby další pomocné reagenty). Přidá se vzorek a po ustálení se odečte signál. Přídavky vzorku lze často několikrát opakovat. Někdy je možné celou nádobku vyplnit vzorkem (např. voda, mléko). Podmínky měření (druh a koncentrace pufru, teplota, pH) je vhodné pro každý typ biosensoru optimalizovat. Toto uspořádání je velmi jednoduché a nenáročné na vybavení, nevýhodou je potřeba manuální obsluhy [82]. 2.4.3 Průtočný systém Biosensor je umístěn ve vhodné průtočné cele. Jsou možné dva způsoby činnosti: A) Systémem se nechá střídavě protékat zóna základního roztoku a zóny vzorků. Měřený signál je funkcí odezvy přímo neředěného vzorku analytu. B) Při druhém způsobu systémem neustále protéká pracovní roztok, do kterého se nastřikují vzorky (FIA, flow injection analysis). Přitom vždy dojde k definovanému naředění vzorku a signál má charakteristický tvar píků. Vyhodnocuje se buď jejich výška nebo plocha. Typy elektrochemického detektoru podle různého uspořádání v průtokovém systému jsou zobrazeny na Obr. 12. Průtočná uspořádání umožňují automatizovat měření [82, 85]. Jednotlivé druhy konstrukcí elektrochemických průtočných komůrek jsou ukázány na Obr. 13. 30 3. Elektrochemické metody Vysoce citlivé, rychlé a selektivní metody detekce anorganických i organických látek ve složité biologické matrici jsou metody elektrochemické a elektroanalytické [83, 87, 124]. Podstatou elektrochemických metod je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci. Objektem zkoumání je elektrochemický článek ­ soustava, v níž je analyzovaný roztok v kontaktu s elektrodami (Obr. 8). Elektrody zprostředkují jeho spojení s měřícím přístrojem, který sleduje některé z elektrických veličin (proud I, potenciál E, vodivost G, elektrický náboj Q, kapacitu C, aj.) [83, 85, 87, 88]. 3.1 Voltametrie a polarografie Voltametrie a polarografie jsou elektrochemické metody založené na sledování intenzity proudu na velikosti proměnlivého vloženého napětí vkládaného mezi pracovní (polarizovatelnou) a referentní (nepolarizovatelnou) elektrodu ­ dvouelektrodové zapojení. Z důvodu eliminace rušivé vlivy plynoucích z dvouelektrodového zapojení (např. proudového zatížení referentní elektrody) se v dnešní době používá kromě pracovní a referentní i elektroda pomocná ­ tříelektrodové zapojení (Obr. 8a). Schéma elektrolytické nádobky v tříelektrodovém zapojení je zobrazeno na Obr. 8b. Na pracovní elektrodě probíhá elektrodový proces, který sledujeme. Potenciál pracovní elektrody je kontrolovaný vůči elektrodě referentní s konstantním potenciálem. Vlastní referentní elektroda je od měřeného roztoku oddělena solným můstkem se zatavenou hustou skleněnou fritou. Proud protéká elektrodami pomocnou a pracovní. Metody, kde se stále využívá rtuťové kapkové elektrody, se nazývají polarografické [85, 87, 124]. Roztokem neprochází proud, pokud zkoumaný vzorek neobsahuje elektroaktivní látku, tzv. depolarizátor, který se v daném potenciálovém rozsahu oxiduje nebo redukuje. Přítomnost depolarizátoru se při určitém potenciálu projeví zvýšením proudu. Elektrodové děje (oxidace anebo redukce) způsobují změny jen ve velmi těsné blízkosti povrchu polarizovatelné elektrody. Samotný elektrodový proces zahrnuje děje, které jsou spojeny s transportem elektroaktivní látky (analytu) k elektrodě, vlastním elektrodovým dějem a vylučováním produktu na elektrodě, případně jeho transportem od elektrody [87, 88, 125]. Transport elektroaktivní látky je k elektrodě zprostředkován třemi pochody: 31 a) Difúzí, která je řízena koncentračním spádem v těsné blízkosti elektrody. Koncentrační spád je vyvolán úbytkem elektroaktivní látky u povrchu elektrody způsobeným jejím vylučováním na elektrodě. b) Migrací, kterou vyvolává elektrické pole mezi elektrodami svým působením na nabité částice. c) Konvekcí, kterou je tok částic vyvolaný mícháním. Cílem elektrochemické detekce je zjištění koncentrace elektroaktivní látky. Z tohoto důvodu je sledována především difúze, která na ní závisí, a naopak potlačena migrace elektroaktivní látky. Přidáme-li do zkoumaného roztoku nosný (indiferentní) elektrolyt v koncentraci řádově převyšující koncentraci elektroaktivní látky, převážnou část náboje přenášejí ionty nosného elektrolytu a migrace elektroaktivní látky je zanedbatelně malá. Současně je tím významně snížen elektrický odpor roztoku. Dále je nezbytné před samotným měřením odstranit z nosného elektrolytu veškerý kyslík, protože jeho vylučování na povrchu elektrody znemožňuje detekci ostatních elektroaktivních látek přítomných v roztoku, protože se sám zúčastňuje elektrodové reakce. Odstranění kyslíku se provádí probubláváním roztoku inertním plynem (např. dusík, argon) [87, 125, 126]. Dosáhne-li potenciál polarizované elektrody hodnoty rozkladného potenciálu elektroaktivní látky, kdy začne její vylučování, snižuje se koncentrace této látky na povrchu elektrody v důsledku elektrodové reakce. Vylučovat se může jen ta látka, která se nachází těsně u povrchu elektrody, a tam se dostane difúzí (migraci eliminuje přítomnost nosného elektrolytu), proto je procházející proud označován jako difúzní. Zvyšuje-li se dále vložené napětí, narůstá vylučování elektroaktivní látky. Tento růst nastává pouze potud, pokud se nezačne vylučovat každá částice elektroaktivní látky, která je k povrchu elektrody difúzí transportována. Tím klesne koncentrace elektroaktivní látky u povrchu elektrody na nulovou hodnotu. Zvyšování napětí již neurychluje její vylučování, protože tato látka u povrchu elektrody není přítomna. Proud dosáhl hodnoty limitního difúzního proudu a jeho velikost je určena rychlostí difúze elektroaktivní látky k povrchu elektrody. Elektroda se polarizovala koncentrační polarizací [83, 85, 87, 88, 124, 126-128]. Proudová odezva při aplikaci pulsu se skládá ze dvou složek: i) kapacitní proud (IC) ­ je potřebný k vytvoření elektrické dvojvrstvy na rozhraní rtuť ­ roztok. Tento proud nesouvisí s přeměnou elektroaktivní látky. U DME dochází k neustálému obnovování povrchu, a proto se musí každá kapka nabít na 32 daný potenciál a tak vzniká kapacitní proud, který je funkcí vloženého potenciálu, velikosti povrchu kapky a povahy základního elektrolytu. Tento proud snižuje citlivost měření. ii) difúzní proud (ID) ­ má faradaický charakter a je rozhodující pro stanovení koncentrace depolarizátoru (viz. Cottrellova rovnice). Jeho velikost je dána: velikostí náboje vyměňovaného mezi polarizovanou elektrodou a roztokem za jednotku času, počtem elektronů vyměňovaných v elektrodové reakci, koncentrací depolarizátoru a rychlostí jeho přenosu z roztoku na povrch elektrody. Cottrellova rovnice: ) 11 ( 2 1 2 1 2 1 r tD cADFnic + = n (počet přenesených elektronů), F (Faradayova konstanta), D (difúzní koeficient), A (plocha elektrody), c (koncentrace analytu), t (čas pulsu), R (poloměr elektrody) [85] 3.1.1 Cyklická voltametrie Při této metodě se po lineárním potenciálovém pulsu mění potenciál pracovní elektrody E na Ei. Ve chvíli kdy je dosaženo potenciálu Ei změní se směr polarizace pracovní elektrody a potenciál se vrací zpět k hodnotě E. Tvar proudové odezvy při cyklické voltamterii je zobrazen na Obr. 14. Při poklesu potenciálu se od hodnoty Ei objeví pík odpovídající opačné elektrodové přeměně. Pokud je systém reverzibilní tak pro potenciály píků před a po obratu směru polarizace platí, že rozdíl těchto hodnot musí být menší než 57/z [85]. Pro reverzibilní elektrodovou reakci vytvořili Randles a Ševčík rovnici popisující tento proces. Proudové odezvy obou píků se v případě reverzibilních dějů rovnají, pro ireverzibilní děje je tento poměr složitější [86-88]. směr polarizace směr polarizace směr polarizace směr polarizace Obrázek 14.: Cyklický voltampérogram převzato [85, 88]. 33 Randles-Ševčíkova rovnice: )(2 1 2 1 2 1 2 1 2 3 2 3 tXcvDA TR F ic = n (počet přenesených elektronů), F (Faradayova konstanta), R (univerzální plynová konstanta), T (teplota), A (plocha elektrody), D (difúzní koeficient), c (koncentrace analytu), v (rychlost posunu potenciálu), )( tX (bezrozměrná proudová funkce) [85] 3.1.2 Diferenční pulzní polarografie a voltametrie Při diferenční pulzní polarografii (DPP) a voltametrii (DPV) jsou na lineární potenciálovou rampu aplikovány pulsy s konstantní amplitudou. Měřený signál odpovídá rozdílu proudů (I), které jsou měřeny v krátkých intervalech, a to před začátkem napěťového pulsu a těsně před koncem napěťového pulsu. U DPP má závislost proudu na napětí tvar píku. Při DME je doba kapky seřízená na určitý čas kratší než přirozená doba kapky. Délka doby kapky se užívá obvykle 2 až 3 s. Puls je vložen na kapku ve stejnou dobu jejího trvání. Obrázek 15.: Diferenční pulzní voltametrie/polarografie - Na elektrodu je přiváděn lineárně rostoucí potenciál. Na konci doby časového kroku je přiveden na elektrodu potenciálový puls s konstantní amplitudou. Proud je měřen před vložením potenciálového pulsu a před koncem tohoto pulsu. Převzato z [85]. Je nutné použít co nejkratší dobu k měření, aby byla získána co největší proudová odezva, ale současně dostatečně dlouhou dobu, kdy hodnota kapacitního proudu je co nejnižší. Doba pulsu se využívá řádově desítky ms. Další charakteristikou je tzv. doba předpolarizace, což je doba odkápnutí předešlé kapky do vložení pulsu. Velikost amplitudy se v praxi obvykle používá 5 až 100 mV (Obr. 15). V případě DPV kapka neodkapává a celé měření probíhá na jedné visící rtuťové kapkové pracovní elektrodě [85, 127]. 34 3.1.3 Rozpouštěcí voltametrie Stanovení elektroaktivních složek se provádí nikoliv při jejich vylučování na polarizovatelné elektrodě, ale naopak při jejich elektrolytickém rozpouštění [85, 88, 124]. Rozpouštěcí voltametrie probíhá ve třech krocích: 1. depozice: při elektrolytickém nahromadění se vylučují stanovované látky na elektrodě. Provádí se za intenzivního míchání při konstantním potenciálu (potenciál depozice) odpovídajícímu limitnímu proudu stanovované látky. Ionty se dostávají k povrchu elektrody konvekcí, proto je limitní proud podstatně vyšší než v nemíchaném roztoku. Nahromadění probíhá dobu, která závisí na obsahu stanovované složky v roztoku (řádově desítky sekund až desítky minut). 2. čas depozice: míchání se vypne ale na elektrodu je stále vkládán potenciál depozice. Přísun elektroaktivní látky k elektrodě konvekcí přestane a elektrodě je připravena k měření. Tato fáze trvá 10 ­ 20 s. 3. rozpouštění: v posledním kroku probíhá vlastní rozpouštění nahromaděných produktů elektrolýzy na povrchu pracovní elektrody lineární změnou potenciálu a zaznamenává se proudová odezva. Dochází zde ke změně polarizace elektrody. 3.1.4 Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie (adsorptivní ,,stripping" voltametrie, AdSV) je modifikací rozpouštěcí voltametrie. Liší se od ní způsobem akumulace analytů na pracovní elektrodě. Akumulace nastává adsorpcí při vhodně zvoleném potenciálu po akumulační čas. AdSV metoda využívá skutečnosti, že mnoho organických látek vykazuje povrchově- aktivní vlastnosti, což se projevuje jejich adsorpcí z roztoku na fázových rozhraních roztok ­ tuhá látka. Na fázovém rozhraní roztok ­ elektroda můžeme tento proces sledovat a využívat jej na kvantitativní stanovení příslušné povrchově-aktivní látky. Další typ neelektrolytické akumulace při rozpouštěcích analýzách představuje chemická interakce analyzované látky s modifikovaným povrchem elektrody, který je citlivý na určitý druh analytu. Vazba analytu probíhá na základě chemické interakce. Jako pracovní elektrodu používáme HMDE nebo různě modifikované uhlíkové pastové elektrody [124, 125]. Modifikace se provádějí: ˇ pokrytím povrchu tenkou vrstvou nízkomolekulárních látek. ˇ pokrytím povrchu vrstvou polymerního filmu. ˇ přimícháním modifikátoru do celého materiálu elektrody. 35 Při samotném procesu rozpouštění se obvykle aplikuje diferenčně pulzní pokles potenciálu (DPV metoda). Při AdSV rozeznáváme faradaické (nastává oxidace či redukce adsorbovaného analytu) a nefaradaické (dochází k desorpci analytu, kterým je elektroneaktivní látka) signály [85, 88, 124]. 36 III. CÍLE PRÁCE Předložená práce je orientována na navržení elektrochemického biosensoru pro detekci těžkých kovů. Jejím cílem je ukázat, že aplikace moderních elektrochemických metod při řešení určitých problémů v biologii může být velmi výhodná. Jak se v poslední době ukazuje, důležitou oblast představuje přímé stanovení některých biologicky aktivních sloučenin přímo v biologickém vzorku, k čemuž by navržený biosensor měl sloužit. Pro tuto práci byly zvoleny následující dílčí cíle: Studium elektrochemického chování biologických složek navržených biosensorů ­ rostlinného peptidu fytochelatinu (PC2) a savčího metalothioneinu Navrhnout konstrukci těchto biosensorů Navržené biosensory aplikovat na stanovení iontů těžkých kovů (kadmium(II) a zinek(II)) Biosensory ověřit analýzou lidských tělních tekutin (lidské krevní sérum a moč) Využít biosensory pro analýzu cisplatiny v různých matricích Studovat interakci cisplatiny s DNA a stanovit následně vzniklé Pt(II)-DNA adukty 37 IV. MATERIÁL A METODY 4. Chemikálie Metalothionein z králičích jater (MW 7143), obsahující 5.9% Cd a 0.5% Zn, byl získán od firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Fytochelatin (-Glu-Cys)2-Gly (PC2) byl syntetizován ve firmě Clonestar Biotech; čistota vyšší než 90 % (Brno, Česká republika). Tris(2-karboxyethyl)fosfin (TCEP) byl zakoupen od laboratoře Molecular Probes (Evgen, Oregon, USA). Chlorid sodný, dusičnan kademnatý, dusičnan zinečnatý a ostatní použité chemikálie byly získány od firmy Sigma Aldrich. Zásobní roztoky standardů (koncentrace 10 g.ml-1 ) byly připraveny v ACS vodě (Aldrich, USA) a uchovány ve tmě při teplotě -20 °C. Pracovní roztok byl připravován denně ředěním zásobních roztoků. Hodnoty pH byly měřeny s použitím WTW inoLab Level 3 (Weilheim, Německo), spojeným s osobním počítačem (Weilheim). pH-electroda (SenTix-H) byla pravidelně kalibrována souborem WTW pufrů. Všechny roztoky byly před analýzou filtrovány přes teflonový filtr 0.45 m (MetaChem, Torrance, CA, USA). Voda byla demineralizována pomocí reverzní osmózy na přístrojích Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Tišnov, Česká republika) a dále čištěná pomocí Millipore RG (Millipore Corp., USA, 18 M). 5. Přístroje 5.1 Stacionární elektrochemický systém Elektrochemické měření bylo prováděno na AUTOLABu (EcoChemie, Nizozemí) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). Byl použit tříelektrodový systém skládající se z visící rtuťové kapkové elektrody jako pracovní elektrody s plochou 0.4 mm2 , argentochloridové elektrody (Ag/AgCl/3 mol.l-1 KCl) jako referenční elektrody a uhlíkové tyčky jako pomocné elektrody. Analyzované vzorky byly před měřením deoxygenovány probubláním argonem (99.999%), saturovaném ve vodě po 120 s. Všechny experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. Software GPES (EcoChemie) byl použit pro zpracování hrubých dat (vyhlazování, korekce na základní hladinu). 5.1.1 Adsorptivní přenosová rozpouštěcí technika (AdTS) diferenční pulsní voltametrie (DPV) fytochelatinu anebo metalothioneinu Fytochelatin a metalothionein jako biologické části biosensorů byly analyzovány pomocí AdTS DPV. Vzorky PC2 anebo MT byly před každým měřením redukovány 38 přídavkem 1 mM tris(2-carboxyethyl)fosfinem podle [129, 130]. AdTS DPV parametry byly následující: počáteční potenciál ­1.2 V, koncový potenciál ­0.3 V, modulační čas 0.057 s, interval 0.2 s, potenciálový krok 1.05 mV/s, modulační amplituda 250 mV. Doba akumulace PC2 anebo MT a doba interakce byly optimalizovány a jsou uvedeny v sekci ,,Výsledky a diskuse". 5.1.2 Diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie kadmia na povrchu nemodifikované rtuťové kapkové elektrody Kromě námi navrženého biosensoru jsme pro stanovení kadmia zvolili metodu diferenční pulzní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV) na nemodifikované HMDE. Základní elektrolyt (chlorid sodný: 0.5 M NaCl, pH 6.4) byl získán od firmy Sigma Aldrich v ACS kvalitě. DPASV parametry byly následující: potenciál akumulace ­1.2 V, čas akumulace 60 s, počáteční potenciál ­1.2 V, koncový potenciál ­0.7 V, modulační čas 0.057 s, interval 0.2 s, potenciálový krok 1.95 mV/s, modulační amplituda 5 mV. 5.1.3 Cyklická voltametrie DNA Jako základní elektrolyt pro analýzu DNA byl použit 0.3 M mravenčan amonný, pH 6.5. CV parametry byly následující: počáteční potenciál 0 V, potenciál obratu ­1.8 V a koncový potenciál 0 V, potenciálový krok 2 mV/s, rychlost polarizace 1 V/s, potenciál akumulace ­1.7 V, čas akumulace 3 s. 6. Reálné vzorky 6.1 Příprava vzorků lidské moči Lidská moč (získaná od zdravých kolegů) byla zfiltrována přes teflonový diskový filtr (0.45 m o průměru 13 mm, Alltech Associates, Deerfield, Il, USA) a před měřením 10 × zředěna 0.5 M roztokem chloridu sodného (pH 6.4). Kromě toho jsme přidali kademnaté a zinečnaté ionty o výsledných koncentracích 25, 50, 100, 225, 400, 600 M pro kadmium(II) a 50, 100, 200, 400, 600, 800 M v případě zinku(II) k 10 × zředěnému roztoku lidské moči. Takto připravená lidská moč byla následně analyzována pomocí PC2 i MT biosensoru. 39 6.2 Příprava vzorků lidského krevního séra Vzorky lidského krevního séra byly získány Ústavu klinické biochemie, Fakultní nemocnice Ponávka v Brně. Před analýzou bylo sérum 1000 × zředěno roztokem 0.5 M chloridu sodného (pH 6.4). Následně bylo přidáno Cd(II) a Zn(II) o výsledných koncentracích 50, 100, 200, 400 a 800 M. Takto připravené lidské krevní sérum byla následně analyzována pomocí MT biosensoru. 6.3 Příprava vzorků cisplatiny Chemoterapeutické léčivo cisplatina ([PtII (NH3)2Cl2]0 ; molekulová hmotnost: 303 g.mol-1 ) byla syntetizována a poskytnuta firmou Pliva-Lachema (Brno, Česká republika) [131]. Zásobní roztoky standardu cisplatiny (koncentrace 10 g.ml-1 ) byly připraveny v roztoku chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4) a uchovány ve tmě při teplotě -20 °C. Pracovní roztok byl připravován denně ředěním zásobních roztoků. 6.4 Příprava aduktů DNA s cisplatinou V našich experimentech jsme modifikovali dsDNA získanou z kuřecích erytrocytů (100 g.ml-1 ) v přítomnosti 10 mM NaClO4 pomocí cisplatiny (375 M). Modifikace probíhala po 24 hodin při 25 °C ve tmě v prostředí termostatovaného boxu (Model TER ­ 5/1, Chirana, Brno, Česká republika). 6.5 Přečištění DNA aduktů Získaný DNA adukt byl purifikován po 24 hodin pomocí ultrafiltrace (Microcon YM-30, Millipore, USA). DNA adukt byl umístěn na Microcon YM-30 membránu a centrifugován (Eppendorf, 14 000 g) po dobu 10 min při 20 °C. Přes nitorocelulosovou membránu prošly všechny nízkomolekulární sloučeniny, jako je volná cisplatina a fragmenty DNA. Následně byl reservoár se vzorkem obrácen a po 10 min. centrifugaci (14 000 g) byla získána pouze modifikovaná DNA. 6.6 Statistická analýza získaných dat K vyhodnocení získaných dat byl použit Microsoft Office Excell 2003 a program STATISTICA Cz (StatSoft, Inc., verze 7.1.). Výpočty byly prováděny na hladině významnosti = 0,05. Limit kvantifikace (LOQ) byl vypočítán dle rovnice 40 LOQ = výška ekoncentracšum ××10 , kde šum je směrodatná odchylka jednotlivých proudových hodnot získaných při měření slepého vzorku v potenciálovém rozmezí přibližně 200 mV (300 hodnot). 41 V. VÝSLEDKY A DISKUSE Elektrochemie má vlastnosti převyšující ostatní existující metody analýzy, protože elektrochemické biosensory mohou poskytnout rychlou, jednoduchou a levnou detekci. Technologie biosensorů plně konkuruje konvenčním analytickým technikám, a spojuje specifitu a senzitivitu biologických systémů do malých a levných zařízení. V nedávné době byly publikovány práce zabývající se konstrukcí biosensorů pro detekci těžkých kovů pomocí rozdílných biologických součástí (houby, bakterie, proteiny, peptidy) [66, 67, 78, 114, 132-139]. Kvůli vzrůstajícímu zájmu o vývoj biosensoru těžkých kovů byla v této práci věnována pozornost elektrochemickým stanovením těžkých kovů pomocí jejich interakce s kovy vázajícím, rostlinným peptidem (fytochelatin ­ PC2) a savčím proteinem vázajícím kovy (metalothionein), kterým byla modifikována visící rtuťová kapková elektroda. 7. Fytochelatin Nejprve jsme se zaměřili na využití fytochelatinu (PC2) jako biologické části našeho biosensoru. Pro tento účel bylo nezbytné vybrat vhodnou elektrochemickou techniku pro charakterizaci námi navrženého biosensoru. Fytochelatiny byly studovány diferenční pulsní voltametrií [140-143] anebo katodickou rozpouštěcí voltametrií [144-146]. Jako nejvhodnější elektrochemická technika byla pro naše účely zvolena diferenční pulzní voltammetrie v kombinaci s adsorptivní přenosovou technikou, kterou jsme nejprve využili pro lepší pochopení možných procesů, které probíhají na povrchu pracovní elektrody. 7.1 Adsorptivní přenosová technika pro analýzu fytochelatinu Adsorptivní přenosová technika byla vyvinuta jako vhodný nástroj pro elektrochemickou analýzu biomolekul, jako jsou proteiny a DNA [139, 147-153]. Princip této techniky spočívá v adsorbování studovaného analytu při otevřeném potenciálu na povrch pracovní elektrody, kterým byla v našem případě HMDE (Obr. 16A2). Po adsorpci je elektroda vyjmuta z roztoku a zbytky analytu, který není pevně adsorbován na povrch HMDE, jsou omyty v pufru (Obr. 16A3). Adsorbovaný analyt je následně analyzován v prostředí základního elektrolytu (Obr. 16A3). Bylo prokázáno, že během tohoto procesu 42 se na povrchu HMDE tvoří pouze jedna monomolekulární vrstva biomakromolekul anebo látek schopných se adsorbovat na povrch elektrody [139]. Bylo studováno elektrochemické chování fytochelatinu2 (klíčový rostlinný peptid, vázající těžké kovy; PC2) na povrchu HMDE pomocí diferenční pulsní voltametrie (DPV) v kombinaci s adsorptivní transferovou technikou (AdTS). Voltamogram 500 M PC2 akumulovaného na povrch HMDE po dobu 120 s a analyzovaného v 0.5 M NaCl (pH 6.4) je ukázán na Obr. 16B. Na získané křivce jsme pozorovali signál o potenciálu ­0.57 V, který pravděpodobně souvisí s navázáním PC2 na povrch HMDE podle následující rovnice: HS-peptid + Hg = HgS-peptid [154, 155]. 1 omytí elektrody 3 fytochelatin 2 adsorpce fytochelatinu elektrochemická detekce 4A B 500 M PC2 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 2 nA PC2 obnovení povrchu 11 omytí elektrody 3 omytí elektrody 3 fytochelatinfytochelatin 22 adsorpce fytochelatinu elektrochemická detekce 4 elektrochemická detekce 4A B 500 M PC2 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 2 nA PC2 B 500 M PC2 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 2 nA PC2 obnovení povrchu Obrázek 16.: Schéma adsorptivní rozpouštěcí přenosové techniky použité pro detekci fytochelatinu; (1) obnova povrchu visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE); (2) adsorpce PC2 v kapce roztoku na povrch HMDE při otevřeném potenciálu; (3) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (4) analýza PC2 metodou DPV v prostředí 0.5 M chloridu sodného, pH 6.4 (A). Typický DPV voltamogram 500 M PC2 (B). AdTS DPV parametry byly následující: počáteční potenciál ­1.2 V, koncový potenciál ­0.3 V, modulační čas 0.057 s, interval 0.2 s, potenciálový krok 1.05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, čas akumulace 120 s. Bylo nezbytné zjistit způsob pravděpodobné interakce peptidu s povrchem pracovní elektrody s výhledem na modifikace HMDE jakožto konstrukce vhodného biosensoru pro detekci těžkých kovů. Nejdůležitějším faktorem stavu elektrodové dvojvrstvy je závislost proudové odpovědi na době akumulace [139, 156]. Byl studován vliv doby akumulace PC2 o koncentraci 10 M a 1 mM na elektrochemické odpovědi (výška signálu PC2). Získaná závislost 1 mM PC2 prudce vzrůstala až do 240 s, přičemž do 400 s trvající interakci se podobala Langmuirovské isotermě (Obr. 17A). Ze získaných výsledků vyplývá, že signál PC2 vzrůstající až do doby akumulace peptidu 240 s pravděpodobně souvisí s následným zaplňováním elektrodového povrchu. V čase 240 s tedy pravděpodobně došlo k zaplnění povrchu HMDE jednou vrstvou PC2 ­ surface assembled monolayer (SAM) [157]. Po 240 s signál adsorbovaného peptidu nevzrůstá, naopak klesá, což pravděpodobně souvisí s tvorbou vícevrstevného PC2 na povrchu HMDE ­ klesající možnost detekce adsorbovaných molekul. V případě nižší koncentrace testovaného PC2 (10 M), jsme 43 zaznamenali vzestup výšky píku PC2 se vzrůstající dobou akumulace ve celém testovaném rozsahu (Obr. 17A). Pro konstrukci biosensoru jsme v následujících experimentech využili PC2 o koncentraci 1 mM a dobu akumulace 240 s. Dalším důležitým faktorem chování fytochelatinu na povrchu HMDE byla změna PC2 proudové odpovědi na základě jeho rozdílných koncentrací. Byly testovány koncentrace PC2 v rozsahu od 2,5 do 1000 M při době akumulace 240 s (Obr. 17B). Závislost získaná z PC2 proudových odpovědí v závislosti na jejich rozdílných koncentrací byla lineární v rozsahu koncentrací 0 ­ 40 M (y = 0.0894x + 0.0621; R2 = 0.9969, Obr. 17Ba). Navíc jsme pozorovali pokles proudové odpovědi PC2 o koncentraci 100 M. Tento fenomén pravděpodobně souvisí s tvorbou více vrstev na elektrodovém povrchu [139, 156, 158]. Na obrázku 17Bb je zobrazen signál PC2 po aplikaci korekce na základní hladinu. 0 1 2 3 0 250 500 750 1000 Koncentrace fytochelatinu (M) 0.0 1.0 2.0 3.0 0 100 200 300 400 500 600 Řada1 Řada2 A Výškapíku(nA) Čas akumulace (s) 1 mM Výškapíku(nA) 0 2 4 0 10 20 30 40 Koncentrace fytochelatinu (M) Výškapíku(nA) 0.5 nA ­ 0.59 V 90 pmolů PC2 B a b 10 M 0 1 2 3 0 250 500 750 1000 Koncentrace fytochelatinu (M) 0.0 1.0 2.0 3.0 0 100 200 300 400 500 600 Řada1 Řada2 A Výškapíku(nA) Čas akumulace (s) 1 mM Výškapíku(nA) 0 2 4 0 10 20 30 40 Koncentrace fytochelatinu (M) Výškapíku(nA) 0.5 nA0.5 nA ­ 0.59 V 90 pmolů PC2 B a b 10 M Obrázek 17.: Závislosti výšky píku PC2 na času akumulace získané při dvou různých koncentracích tohoto peptidu 10 M a 1 mM (A). Vliv různých koncentrací PC2 na jeho elecktrochemický signál (B a Ba). Signál PC2 (18 M ­ 90 pmolů PC2 v 5 l kapce) po aplikaci korekce na základní hladinu (Bb). Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obr. 16. 7.2 Navržení PC2 biosensoru pro detekci těžkých kovů Pro naše účely jsme použili HMDE jako fyzikálně-chemickou část a fytochelatin2, který má schopnost vázat těžké kovy [1, 95, 98, 105, 106], jako biologická část navrhovaného biosensoru těžkých kovů. Proto bylo možné provést následující experimenty: i) na povrch pracovní elektrody HMDE adsorbovat PC2 při otevřeném potenciálu, ii) odstranit přebytečný PC2 iii) vystavit adsorbovaný PC2 působení těžkého kovu iv) změny v signálech PC2 (Obr. 18). Pro naše účely jsme zvolili dva ionty těžkých kovů, kadmia(II) a zinku(II). 44 To je důvod, proč jsme se zajímali, zda volné ionty zvolených těžkých kovů jsou schopny adsorbce a přenosu na povrchu HMDE elektrody. Když jsme akumulovali (120 s) pouze volné ionty Cd(II) nebo Zn(II) bez PC2 na povrchu rtuťové pracovní elektrody, nepozorovali jsme žádný signál, který by odpovídal těžkému kovu. Popsaný efekt prokázal, že volné ionty těžkých kovů nejsou schopny přenosu a přímé detekce. těžký kov PC2 interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 51 omytí elektrody 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram PC2 2 adsorpce PC2 obnovení povrchu těžký kov PC2 interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 51 omytí elektrody 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram PC2 2 adsorpce PC2 těžký kov PC2 interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 511 omytí elektrody 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram PC2 22 adsorpce PC2 obnovení povrchu Obrázek 18.: Schéma adsorptivní rozpouštěcí přenosové techniky použité pro konstrukci biosensoru těžkých kovů; (1) obnova povrchu visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE); (2) adsorpce PC2 v kapce roztoku na povrch HMDE při otevřeném potenciálu; (3) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (4) interakce těžkých kovů (kadmium a zinek) v kapce roztoku s navrženým biosensorem za otevřeného potenciálu; (5) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (6) analýza PC2 metodou DPV v roztoku 0.5 M chloridu sodného, pH 6.4. R 2 = 0.9961 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 R 2 = 0.9997 R 2 = 0.9918 0 3 6 9 0 100 200 300 400 500 0 10 20 30 40 50 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 1 mM PC2 bez Cd(II) Potenciál (V) PC2 PC2(Cd) 0.5 nA CdPC2 1 mM PC2 + 60 M Cd(II) Koncentrace zinku (M) Výškapíku(nA) Výškapíku(pA) 1 mM PC2 bez Zn(II) 1 mM PC2 + 500 M Zn(II) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­ 0.3 ZnPC2 0.5 nA Potenciál (V) PC2 ,Výškapíku(nA) Výškapíku(pA) Koncentrace kadmia (M) PC2 PC2(Cd) ZnPC2 PC2 CdPC2 KADMIUM ZINEK A C B D R 2 = 0.9961 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 R 2 = 0.9997 0 3 6 9 0 100 200 300 400 500 0 10 20 30 40 50 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 R 2 = 0.9918 1 mM PC2 bez Cd(II) Potenciál (V) PC2 PC2(Cd) 0.5 nA CdPC2 1 mM PC2 + 60 M Cd(II) Koncentrace zinku (M) Výškapíku(nA) Výškapíku(pA) 1 mM PC2 bez Zn(II) 1 mM PC2 + 500 M Zn(II) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­ 0.3 ZnPC2 0.5 nA Potenciál (V) PC2 ,Výškapíku(nA) Výškapíku(pA) Koncentrace kadmia (M) PC2 PC2(Cd) ZnPC2 PC2 KADMIUM CdPC2 ZINEK A C B D Obrázek 19.: Typické DP voltamogramy 1 mM PC2 bez a s přídavkem 60 M kademnatých iontů (A), a 1 mM PC2 bez a s přídavkem 500 M zinečnatých iontů (B). Závislost výšek signálů CdPC2, PC2(Cd) a PC2 na koncentraci kademnatých iontů (C). Závislosti výšek signálů ZnPC2 a PC2 na koncentraci zinečnatých iontů (D). AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 300 s. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obr. 16. 45 7.3 Elektrochemické chování PC2 biosensoru v přítomnosti Cd(II) a Zn(II) Fytochelatin2 byl nejprve adsorbován na povrch HMDE po dobu 240 s. Poté byl takto navržený biosensor omyt v pufru a následně byl vystaven interakci s 500 M Cd(II) anebo Zn(II) po dobu 300 s, která byla zvolena jako nejvhodnější s ohledem na rychlost analýzy a dostatečnou sensitivitu. Získané voltamogramy jsou zobrazeny na obrázcích 19A a B. V přítomnosti kademnatých iontů jsme kromě původního signálu PC2 pozorovali také dva další, které jsme pojmenovali CdPC2 (­0.76 V) a PC2(Cd) (­0.45 V). Tyto dva signály pravděpodobně souvisí s interakcí kadmia s fytochelatinem popřípadě samotnou rtuťovou elektrodou [142]. Pozorované signály CdPC2 a PC2(Cd) vzrůstaly a signál PC2 klesal se vzrůstající koncentrací kademnatých iontů (Obr. 19C a Tab. 1). Limit kvantifikace Cd(II) byl okolo 0.6 pmolu v 5 l kapce (0.12 M). V případě stanovení zinečnatých iontů pomocí PC2 biosensoru jsme pozorovali pouze dva signály ve srovnání s kadmiem. K již dříve popsanému signálu PC2 se objevil při potenciálu ­1.09 V signál, který jsme pojmenovali ZnPC2. Signál PC2 lineárně klesal a ZnPC2 lineárně stoupal se vzrůstající koncentrací těžkého kovu (Obr. 19D a Tab. 1). Limit kvantifikace Zn(II) byl okolo 8 pmolů v 5 l kapce (1.6 M). Tabulka 1.: Vliv základního elektrolytu a biologické matrice (lidské moči a krevního séra) na PC2 signály při analýze kademnatých a zinečnatých iontů. Různá prostředí Těžký kov PC2 signályb Rovnice R2 CdPC2 y = 0.0999x + 4.8325 0.9997 Kadmium PC2(Cd) y = 0.0128x + 0.2085 0.9918 Zinek ZnPC2 y = 0.8496x + 18.598 0.9961 PtPC2 y = 0.0532x ­ 5.7079 0.9946 Základní elektrolyta Cisplatina PC2 y = -1.2976x + 1.0860 0.9948 a Základním elektrolytem byl 0.5 M NaCl. b Detailnější popis PC2 signálů je uveden v sekci ,,Výsledky a diskuse" anebo v následující práci [142]. 7.4 Stanovení Cd(II) a Zn(II) pomocí PC2 biosensoru v přítomnosti lidské moči V další části naší práce jsme se rozhodli otestovat náš PC2 biosensor analýzou zinečnatých a kademnatých iontů v prostředí biologické matrice (lidská moč). Námi navržený biosensor byl vystaven interakci s kademnatými (25, 50, 100, 225, 400 a 600 M) anebo zinečnatými (50, 100, 200, 400, 600 a 800 M) ionty, které byly přidány 46 v daných výsledných koncentracích do vzorku 10 × zředěné lidské moči. Pozorovali jsme velmi podobné chování a počet píků ve vzorcích lidské moči ve srovnání s pufrovaným prostředím pro oba analyzované kovy. Pouze jejich výšky byly ve srovnání s pufrovaným prostředím nižší (rozdíly se pohybovali v rozmezí od 10 do 15 %), což je zřejmě způsobeno interferenty obsaženými v reálném vzorku. 7.5 Analýza cisplatiny pomocí PC2 biosensoru Dále jsme se rozhodli použít námi navržený PC2 biosensor pro stanovení protirakovinového léčiva ­ cisplatiny. Připravený roztok cisplatiny byl analyzován biosensorem a výsledný voltamogram je ukázán na Obr. 20A. Kromě signálu samotného biosensoru (PC2) jsme pozorovali signál, který odpovídal komplexu cisplatiny s fytochelatinem a byl pojmenován PtPC2 (­0.96 V). Byl studován vliv různé doby interakce biosensoru s cisplatinou na pozorované signály. Jako nejvhodnější doba interakce bylo na základě získaných výsledků vybráno 300 s. Závislost výšek píků PC2 a PtPC2 na koncentraci cisplatiny je ukázána na Obr. 20B. Signál PC2 klesal a PtPC2 rostl lineárně se vzrůstající koncentraci cisplatiny v rozmezí od 100 do 750 M (Tab. 1 a Obr. 20B). Limit kvantifikace pro cisplatinu byl okolo 1 pmolu v 5 l kapce (0.2 M). Výškapíku(pA) Koncentrace cisplatiny (M) Výškapíku(pA) 0 10 20 30 40 0 250 500 750 0 400 800 1200 A B PtPC2PC2 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 1mMPC2bezPt 1mMPC2+750MPt Potenciál (V) 0.25 nA Výškapíku(pA) Koncentrace cisplatiny (M) Výškapíku(pA) 0 10 20 30 40 0 250 500 750 0 400 800 1200 A B PtPC2PC2 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 1mMPC2bezPt 1mMPC2+750MPt Potenciál (V) 0.25 nA ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 1mMPC2bezPt 1mMPC2+750MPt Potenciál (V) 0.25 nA Obrázek 20.: Cisplatina ­ [PtII (NH3)2Cl2]0 . Typické DP voltamogramy 1 mM PC2 bez a s přídavkem 750 M cisplatiny (A). Závislosti výšek signálů PtPC2 a PC2 na různé koncentraci cisplatiny (B). AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 300 s. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obr. 16. 8. Metalothionein Po úspěšné aplikaci rostlinného peptidu fytochelatinu2 jako biologické složky biosensoru jsme se rozhodli použít složitější savčí (králičí) protein metalothionein, který je 47 1 omytí elektrody 3 metalothionein 2 adsorpce metalothioneinu elektrochemická detekce 4 obnovení povrchu 11 omytí elektrody 3 omytí elektrody 3 metalothionein 2 adsorpce metalothioneinu elektrochemická detekce 4 elektrochemická detekce 4 schopen vázat do své struktury těžké kovy [159]. Elektrochemické chování metalothioneinu bylo studováno pomocí různých elektrochemických technich jak např. chronopotenciometrické rozpouštěcí analýzy [97, 114, 136, 137, 160-162], cyklické voltametrie [130, 163-166], diferenční pulsní voltammetrie [130, 167-181] a dalších [182- 185]. Pro naše účely charakterizace modifikace HMDE metalothioneinem byla opět zvolena diferenční pulzní voltammetrie v kombinaci s adsorptivní přenosovou technikou (Obr. 21). obnovení povrchu Obrázek 21.: Schéma adsorptivní rozpouštěcí přenosové techniky použité pro detekci metalothioneinu; (1) obnova povrchu visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE); (2) adsorpce MT v kapce roztoku na povrch HMDE při otevřeném potenciálu; (3) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (4) analýza MT metodou DPV v prostředí 0.5 M chloridu sodného, pH 6.4. 8.1 Adsorptivní přenosová technika pro analýzu metalothioneinu MT studovaný pomocí DPV poskytuje několik elektrochemických signálů, za které jsou zřejmě zodpovědné komplexy MT s těžkými kovy přítomnými v roztoku, tj. MT(Cd); MT(Zn), CdT`, ZnT`, CdT a ZnT ­ komplexy MT s těžkými kovy přítomnými v analytu [169, 173, 186]. Navíc bývá autory, kteří používají DPV bez AdTS techniky, popisována přítomnost redoxních signálů iontových forem Cd(II) a Zn(II) [170, 173, 186]. Proto nás zajímalo, jak bude vypadat elektrochemický záznam detekce MT, který obvykle ve svých klastrech Cd(II) a Zn(II) obsahuje, provedený pomocí AdTS DPV (Obr. 21). Získaný voltamogram 10 M MT, který byl akumulován na povrch pracovní elektrody po dobu 120 s, je znázorněn na Obr. 22Aa. Byly pozorovány všechny předpokládané elektrochemické signály MT komplexů s Cd(II) a Zn(II) ­ MT(Cd): ­0.42 V; MT(Zn): ­0.49 V, ZnT`: ­0.87 V, CdT: ­0.65 V a ZnT: ­0.99 V, žádný signál volných iontových forem Cd a Zn. Zjištěný fakt, potvrzuje předpoklad, že nízkomolekulární sloučeniny (volné ionty těžkých kovů) nejsou schopny přenosu, a tedy i následné detekce [142]. 48 0 10 20 30 40 50 0 200 400 10 1 250 0 10 20 30 40 50 0 2 4 6 8 10 Koncentrace MT (M) ZnT CdT MT(Zn) ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA B MT(Cd) ZnT` b 0 10 20 30 0.0 0.5 1.0 1.5 Koncentrace MT (M) Výškapíku(nA) CdT Výškapíku(nA) Čas akumulace (s) 10 M 1 M 250 nM a CdT A ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA MT(Zn) CdT ZnT`ZnT CdT` 10 M MT bez 1 mM TCEP 10 M MT s 1 mM TCEP scan MT(Cd) a b Výškapíku(nA) 0 10 20 30 40 50 0 200 400 10 1 250 0 10 20 30 40 50 0 2 4 6 8 10 Koncentrace MT (M) ZnT CdT MT(Zn) ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA B MT(Cd) ZnT` b 0 10 20 30 0.0 0.5 1.0 1.5 Koncentrace MT (M) Výškapíku(nA) Výškapíku(nA) Čas akumulace (s) CdT 10 M 1 M 250 nM a CdT A ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA MT(Zn) CdT ZnT`ZnT CdT` 10 M MT bez 1 mM TCEP 10 M MT s 1 mM TCEP scan MT(Cd) a b Výškapíku(nA) 0 10 20 30 40 50 0 200 400 10 1 250 0 10 20 30 40 50 0 2 4 6 8 10 Koncentrace MT (M) ZnT CdT MT(Zn) ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA10 nA B MT(Cd) ZnT` b 0 10 20 30 0.0 0.5 1.0 1.5 Koncentrace MT (M) Výškapíku(nA) Výškapíku(nA) Čas akumulace (s) CdT 10 M 1 M 250 nM a CdT A ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) 10 nA10 nA MT(Zn) CdT ZnT`ZnT CdT` 10 M MT bez 1 mM TCEP 10 M MT s 1 mM TCEP scan MT(Cd) a b Výškapíku(nA) V případě redukce MT fosfinem (TCEP) (c = 1 mM) jsme pozorovali průkazně snížené výšky signálu ZnT'. Na druhé straně výšky signálů CdT a MT(Cd) vzrostly asi o 30 ­ 40% ve srovnání se signály fosfinem neredukovaného MT. Navíc signál CdT' vymizel (Obr. 22Ab). Pozorované změny mohou být způsobené redukcí disulfidických můstků ve struktuře MT. Z důvodu vyšších pozorovaných signálů jsme použili 1 mM TCEP pro redukci MT při každé následující analýze. Co se týče povahy a způsobu vzniku pozorovaných signálu, domníváme se, že MT(Cd) a MT(Zn) signály pravděpodobně souvisí s redukcí navázaného kovu v MT [186]. Na základě našich výsledků předpokládáme, že signál CdT pravděpodobně souvisí s oxidací SH skupin metalothioneinu. Signály ZnT', CdT' a ZnT zřejmě vznikají na základě elektrochemických reakcí mezi metalothioneinem, těžkými kovy a rtuťovou elektrodou. Obrázek 22.: Typický voltamogram 10 M MT bez (Aa) a s 1 mM TCEP ­ tris(2- karboxyethyl)fosfin (Ab) získaný pomocí AdTS DPV techniky. DPV parametry byly následující: počáteční potenciál ­1.2 V, konečný potenciál ­0.3 V, modulační čas 0.057 s, časový interval 0.2 s, 49 potenciálový krok 1.05 mV/s, modulační amplituda 5 mV, Eads = 0 V. Vliv různých dob akumulace (Ba) a MT koncentrace (Bb a vložený obrázek v Bb) na výšku CdT signálu. Další experimentální podmínky jsou popsány v sekci ,,Materiály a metody". V předešlých námi publikovaných pracích jsme prokázali, že MT může být adsorbován na povrch HMDE [97, 114, 136, 137, 160]. Závislost proudové odezvy MT na době akumulace pro tří různé koncentrace (250 nM, 1 M a 10 M) je znázorněn na Obr. 22Ba. Dokonalé pokrytí povrchu elektrody, neboli tvorby ,,SAM" (self assembled monolayer, povrchová monomolekulární vrstva), bylo pravděpodobně dosaženo časem delším než 240 s pro 1 a 10 M protein (Obr. 22Ba). Při nižší koncentraci MT (250 nM) jsme pozorovali exponenciální závislost proudové odezvy metalothioneinu na době akumulace. Plného pokrytí povrchu elektrody pravděpodobně nebylo dosaženo ani po 360 s adsorpci. V případě 10 M MT použitého pro detekci těžkých kovů, jsme vybrali čas akumulace 240 s trvající (Obr. 22Ba). Koncentrační závislost byla studována v rozsahu 50 nM ­ 10 M MT. U nižších koncentrací MT (50 nM ­ 1.3 M MT) jsme pozorovali striktně lineární závislost proudové odezvy CdT na koncentraci MT (y = 21.37x ­ 0.0575; R2 = 0.9983), viz Obr 22Bb. 8.2 Modifikace HMDE metalothioneinem ­ navržení MT biosensoru pro detekci těžkých kovů V našich experimentech bylo využito HMDE jako fyzikálně chemické části a metalothioneinu jako biologické části biosensoru pro stanovení těžkých kovů. Jak bylo popsáno výše, neprokázali jsme, že by bylo možné přenášet na povrchu HMDE samotný ion těžkého kovu a je známo, že MT velmi dobře váže do svých struktur těžké kovy [163, 170-172, 180, 187-191]. Proto bylo možné provést následující experimenty: i) na povrch pracovní elektrody HMDE adsorbovat MT při otevřeném potenciálu, ii) odstranit přebytečný MT, iii) vystavit naadsorbovaný MT působení těžkého kovu a iv) detekovat změnu signálu MT (Obr. 16). 8.3 Elektrochemické chování navrženého biosensoru v přítomnosti Cd(II) a Zn(II) Nejprve jsme použili metalothioneinem modifikovanou HMDE pro stanovení kadmia(II) a zinku(II). MT (10 M) byl adsorbován (240 s) na povrch HMDE a takto modifikovaná elektroda byla následně vystavena interakci s Cd(II) (10 M) a 50 těžký kov MT interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 51 omytí elektrody 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram MT 2 adsorpce MT těžký kov MT interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 511 omytí elektrody 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram MT 22 adsorpce MT Zn(II) (100 M) po dobu 120 s při otevřeném potenciálu. Poté byla elektroda omyta (0.5 M NaCl) a umístěna do měřící nádobky obsahující elektrolyt (0.5 M NaCl; pH = 6.4, viz Obr. 23). Signály (10 M) MT bez a s interakcí s 10 M Cd(II) a 100 M Zn(II) jsou znázorněny na Obr. 24A. V případě Cd(II) jsme získali čtyři signály předpokládaných komplexů metalothioneinu s Cd(II) ­ CdT`: ­0.82 V; CdT: ­0.63 V; MT(Zn): ­0.46 V a MT(Cd): ­0.40 V. Zatímco po přídavku Zn(II) vznikly pouze signály tři: CdT: ­0.68 V, MT(Zn): ­0.46 V a ZnT: ­1.1 V (Obr. 24A). Obrázek 23.: Schéma adsorptivní rozpouštěcí přenosové techniky použité pro konstrukci biosensoru těžkých kovů; (1) obnova povrchu visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE); (2) adsorpce MT v kapce roztoku na povrch HMDE při otevřeném potenciálu; (3) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (4) interakce těžkých kovů (kadmium a zinek) v kapce roztoku s navrženým biosensorem za otevřeného potenciálu; (5) omytí elektrody roztokem chloridu sodného (0.5 M, pH 6.4); (6) analýza MT metodou DPV v roztoku 0.5 M chloridu sodného, pH 6.4. Studovali jsme vliv doby akumulace na interakci MT s těžkými kovy na základě pozorování změn elektrochemických signálů (koncentrace MT a těžkých kovů byla konstantní). MT (10 M) byl adsorbován (240 s) na povrch HMDE, a následně byl studován vliv doby interakce s 10 M Cd(II) na výšku a povahu pozorovaných signálů. Objevili jsme, že výška signálu CdT klesla v průměru o 6 % po 60 s dlouhé interakci s těžkým kovem. Signál CdT tedy klesl o více 50 % po 420 s dlouhé interakci (Obr. 24B). Výška signálu MT(Zn) se změnila pouze o 3 % s rostoucím časem interakce. Na počátku experimentu jsme pozorovali signál o potenciálu ­0.40 V, který jsme nazvali MT(Cd). Zmíněný signál pozvolna vzrůstal s rostoucí dobou interakce do 250 s, poté jsme pozorovali výrazné zvýšení píku MT(Cd), viz. Obr. 24B. Při negativnějším potenciálu byl zjištěn jiný signál, pojmenovaný jako CdT`, který se objevil po 180-ti sekundové interakci (Obr. 24B). Dále se zvyšující se dobou interakce způsobuje pokles signálu CdT a vzrůst signálů MT(Cd) a CdT`. Na základě získaných výsledků jsme zvolili dobu interakce 300 s pro stanovení těžkých kovů, protože zvolený čas zajišťuje dostačující výšku píku a zároveň relativně rychlý průběh analýzy. 51 0 25 50 75 100 0 150 300 450 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 10 M MT + 10 M Cd(II) MT(Cd) Čas interakce (s) Výškapíku(%) CdT MT(Zn)CdT A B 5 nA 10 M MT bez přídavku těžkého kovu 10 M MT + 100 M Zn(II) MT(Cd) ZnT CdT' CdT' MT(Zn) Interakce těžkých kovů s MT modifikovaným povrchem HMDE 0 25 50 75 100 0 150 300 450 ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) Čas interakce (s) Výškapíku(%) CdT MT(Zn)CdT 10 M MT + 10 M Cd(II) MT(Cd) A B 5 nA5 nA 10 M MT bez přídavku těžkého kovu 10 M MT + 100 M Zn(II) MT(Cd) ZnT CdT' CdT' MT(Zn) Interakce těžkých kovů s MT modifikovaným povrchem HMDE Obrázek 24.: Typický DP voltamogram 10 M MT bez přídavku Cd(II) a Zn(II), 10 M MT + 10 M Cd(II) a 10 M MT + 100 M Zn(II) (A). DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 120 s. Závislost výšky píků CdT, CdT', MT(Cd) a MT(Zn) na času interakce (B). Další experimentální podmínky můžete nalézt v legendě Obrázku 22. R 2 = 0,9978 R 2 = 0.9969 R 2 = 0.9983 0 10 20 30 40 50 0 250 500 750 1000 10 M Cd(II) 1000 M Cd(II) 50 M Cd(II) 100 M Cd(II) 250 M Cd(II) 5 nA 500 M Cd(II) KADMIUM MT(Zn) CdT CdT' MT(Cd) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­ 0.3 Potenciál (V) 10 M Zn(II) 1000 M Zn(II) ZnT ZINEK CdT MT(Zn) 5 nA 500 M Zn(II) R 2 = 0,9929 R 2 = 0,9953 R 2 = 0.9942 0 10 20 30 40 50 0 250 500 750 1000 0 2 4 6 8 10 Koncentrace zinku (M) Výškapíku(nA) ,Výškapíku(nA) ZnT MT(Zn) CdT Výškapíku(nA) CdT CdT´MT(Cd) Koncentrace kadmia (M) A a b B a b R 2 = 0,9978 R 2 = 0.9969 R 2 = 0.9983 0 10 20 30 40 50 0 250 500 750 1000 10 M Cd(II) 1000 M Cd(II) 50 M Cd(II) 100 M Cd(II) 250 M Cd(II) 10 M Cd(II) 1000 M Cd(II) 50 M Cd(II) 100 M Cd(II) 250 M Cd(II) 5 nA 500 M Cd(II)500 M Cd(II) 5 nA KADMIUM MT(Zn) CdT CdT' MT(Cd) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­ 0.3 Potenciál (V) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­ 0.3 Potenciál (V)Potenciál (V) 10 M Zn(II) 1000 M Zn(II) 10 M Zn(II) 1000 M Zn(II) ZnT ZINEK CdT MT(Zn) 5 nA 500 M Zn(II)500 M Zn(II) 5 nA R 2 = 0,9929 R 2 = 0,9953 R 2 = 0.9942 0 10 20 30 40 50 0 250 500 750 1000 0 2 4 6 8 10 Koncentrace zinku (M) Výškapíku(nA) ,Výškapíku(nA) ZnT MT(Zn) CdT Výškapíku(nA) CdT CdT´MT(Cd) Koncentrace kadmia (M) A a b B a b Obrázek 25.: Typický DP voltamogram 10 M MT bez přídavku Cd(II) a Zn(II), 10 M MT + 10 M Cd(II) a 10 M MT + 100 M Zn(II) (A). DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 120 s. Závislost výše píků CdT, CdT', MT(Cd) a MT(Zn) na času interakce (B). Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 22. Vliv koncentrace zvoleného těžkého kovu byl studován jako další parametr elektrochemické detekce. Voltamogramy získané při různých koncentracích Cd(II) a Zn(II) jsou znázorněny na Obr. 25Aa a Ab. Signály CdT' a MT(Cd) se lineárně zvyšovaly 52 s rostoucí koncentrací kademnatých iontů (Obr. 25Ba). Oproti tomu se pík CdT lineárně snižoval s rostoucí koncentrací kademnatých iontů (Tab. 2). Limit kvantifikace pro kademnaté ionty byl 160 femtomolů v 5 l kapce (32 nM). Předpokládáme, že signál CdT nejspíše souvisí s interakcí proteinových SH skupin se rtutí (SH-protein + Hg = HgS-protein). Oproti tomu těžké kovy navázané do SH klastrů zabraňují interakci mezi SH skupinami a povrchem rtuťové elektrody. To je také důvodem, proč je možné sledovat změny v CdT signálu se vzrůstající koncentrací těžkého kovu (Obr. 25A,B). Změny v signálu MT komplexů se vzrůstající koncentrací Zn(II) jsou zobrazeny na Obr. 25Bb. Ze získaných výsledků je zřejmé, že signál CdT klesal a MT(Zn) signál se zvyšoval s rostoucí koncentrací zinečnatých iontů (Tab. 2). Limit kvantifikace pro zinečnaté ionty byl 220 femtomolů v 5 l kapce (44 nM). 8.4 Stanovení Cd(II) a Zn(II) pomocí MT biosensoru v přítomnosti lidské moči Dále jsme se rozhodli ověřit náš MT biosensor těžkých kovů pomocí detekce Cd(II) a Zn(II) v přítomnosti biologické matrice (lidská moč) metodou standardního přídavku. Metalothionein (10 M) byl adsorbován (240 s) na povrch HMDE. Poté byla modifikovaná elektroda vystavena interakci s Cd(II) a Zn(II) v přítomnosti lidské moči (10 × zředěné) po dobu 300 s. Následně byla elektroda omyta (0.5 M NaCl) a umístěna do elektrochemické cely obsahující elektrolyt (0.5 M NaCl; pH = 6.4). Lidská moč obsahovala přídavky kademnatých (25, 50, 100, 225, 400 a 600 M) anebo zinečnatých (50, 100, 200, 400, 600 a 800 M) iontů. Typické voltamogramy MT biosensory vzniklé přídavkem Cd(II) nebo bez přídavku těžkého kovu v přítomnosti lidské moči jsou znázorněny na Obr. 26A. Ze získaných výsledků vyplývá, že v případě přídavku Cd(II) se objevují čtyři píky: CdT', CdT, MT(Cd) a MT(Zn). V přítomnosti Zn(II) jsme získali tři píky (CdT, ZnT a MT(Zn)). Výsledky dobře korespondují s voltamogramy získanými z analýzy provedené v přítomnosti pufru, kterým by 0.5 M chlorid sodný (Obr. 24). Po interakci těžkých kovů s MT biosensorem byly také pozorovány čtyři respektive tři signály (Obr. 24 a 26). V případě vzrůstající koncentrace Cd(II), výšky píků MT(Cd) a CdT' se zvyšovaly a výška píku CdT klesala (Obr. 26Ba a Tab. 2). Vzrůstající koncentrace Zn(II) způsobila lineární růst výšky píku MT(Zn) a pokles píku CdT (Obr. 26Bb a Tab. 2). Všechny studované signály vykazovaly stejné elektrochemické chování v průběhu jejich analýzy v roztoku pufru a v biologické matrici (Obr. 24 a 26). V přítomnosti lidské moči byly 53 výšky všech studovaných signálů nižší než v roztoku základního elektrolytu (rozdíly od 0.25 do 15 nA). Tento efekt je pravděpodobně způsoben komplexní matricí reálného vzorku, který může interagovat s adsorbovaným MT, a tím měnit elektrochemický signál. Limity kvantifikace kademnatých a zinečnatých iontů analyzovaných v prostředí lidské moči byly 290 femtomolů (58 nM) pro Cd(II) a 250 femtomolů (50 nM) pro Zn(II) v 5 l kapce. Detekční limity pro oba kovy byly vypočítány z poklesu signálu CdT. Tabulka 2.: Vliv základního elektrolytu a biologické matrice (lidské moči a krevního séra) na MT signály při analýze kademnatých a zinečnatých iontů. Různá prostředí Těžký kov MT signályc Rovnice R2 MT(Cd) y = 0.0256x + 0.1324 0.9978 CdT´ y = 0.0242x + 0.2207 0.9992Kadmium(II) CdTb y = -0.0446x + 45.047 0.9969 MT(Zn) y = 0.0053x + 12.090 0.9953 Základní elektrolyta Zinek(II) CdTb y = -0.0442x + 47.559 0.9929 MT(Cd) y = 0.0055x ­ 0.1784 0.9962 CdT´ y = 0.0067x ­ 0.0888 0.9970Kadmium(II) CdTb y = -0.0321x + 33.534 0.9888 MT(Zn) y = 0.0030x ­ 0.2021 0.9973 Lidská moč Zinek(II) CdTb y = -0.0385x + 39.143 0.9915 MT(Cd) y = 0.0066x ­ 0.3839 0.9950 CdT´ y = 0.0094x ­ 0.1079 0.9925Kadmium(II) CdTb y = -0.0216x + 23.960 0.9920 MT(Zn) y = 0.0035x + 0.1107 0.9997 Lidské krevní sérum Zinek(II) CdTb y = -0.0254x + 29.228 0.9997 a Základním elektrolytem byl 0.5 M NaCl. b CdT signál byl použit pro kvantifikaci stanovovaných kovů. c Detailnější popis MT signálů je uveden v sekci ,,Výsledky a diskuse" anebo v následujících pracích [145, 175, 186, 188, 191]. 8.5 Stanovení Cd(II) a Zn(II) MT biosensorem v přítomnosti lidského krevního séra Navržený biosensor byl dále testován pro detekci těžkých kovů v lidském krevním séru. Přidali jsme Cd(II) a Zn(II) o výsledných koncentracích 50, 100, 200, 400 a 800 M do analyzovaných vzorků lidského krevního séra. Typické voltamogramy získané měřením 54 s a bez přídavku Cd(II) za přítomnosti lidského krevního séra jsou zobrazeny na Obr. 26C. Jak je vidět na tomto obrázku, můžeme pozorovat dobře vyvinutý signály CdT', MT(Cd) a CdT. Signál CdT klesal s rostoucí koncentrací Cd(II). Na druhou stranu signály CdT' a MT(Cd) lineárně vzrůstaly (Obr. 26Da a Tab. 2). Stejná závislost sledovaných signálů MT biosensoru byla pozorována i v případě analýzy kademnatých iontů. Je zřejmé, že signál CdT klesal a MT(Zn) vzrůstal s rostoucí koncentrací Zn(II) (Obr. 26Db a Tab. 2). Limity kvantifikace pro Cd(II) a Zn(II) byly 470 femtomolů v 5 l kapce (94 nM) a 400 femtomolů v 5 l kapce (80 nM). 0 10 20 30 0 250 500 750 7 8 9 10 0 10 20 30 0 500 0 2 4 6 8 0 20 40 0 500 1000 0 1 2 3 0 20 40 0 200 400 600 0 2 4 Lidská moč Lidské krevní sérum MT bez Cd(II) CdT MT(Zn) MT(Cd) MT + 500 M Cd(II) ­ 0.46 V­ 0.39 V MT(Zn) CdT' ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 MT(Cd) Potenciál (V) 5 nA CdT MT bez Cd(II) MT + 800 M Cd(II) CdT' MT(Zn) MT(Cd) 5 nA ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) Koncentrace Cd(II) (M) Koncentrace Zn(II) (M) Výškapíku(nA) CdT CdT Výškapíku(nA) Cd(II) Zn(II) Koncentrace Zn(II) (M) Výškapíku(nA) CdT Koncentrace Cd(II) (M) Výškapíku(nA) CdT CdT' MT(Zn) CdT' MT(Zn) A B C D a b a bCd(II) Zn(II) MT(Cd) MT(Cd) 0 10 20 30 0 250 500 750 7 8 9 10 0 10 20 30 0 500 0 2 4 6 8 0 20 40 0 500 1000 0 1 2 3 0 20 40 0 200 400 600 0 2 4 Lidská moč Lidské krevní sérum MT bez Cd(II) CdT MT(Zn) MT(Cd) MT + 500 M Cd(II) ­ 0.46 V­ 0.39 V MT(Zn) CdT' ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 MT(Cd) Potenciál (V) 5 nA MT bez Cd(II) CdT MT(Zn) MT(Cd) MT + 500 M Cd(II) ­ 0.46 V­ 0.39 V MT(Zn) CdT' ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 MT(Cd) Potenciál (V) ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V)Potenciál (V) 5 nA5 nA CdT MT bez Cd(II) MT + 800 M Cd(II) CdT' MT(Zn) MT(Cd) 5 nA ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) CdT MT bez Cd(II) MT + 800 M Cd(II) CdT' MT(Zn) MT(Cd) 5 nA5 nA ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V) ­1,2 ­0,9 ­0,6 ­ 0,3 Potenciál (V)Potenciál (V) Koncentrace Cd(II) (M) Koncentrace Zn(II) (M) Výškapíku(nA) CdT CdT Výškapíku(nA) Cd(II) Zn(II) Koncentrace Zn(II) (M) Výškapíku(nA) CdT Koncentrace Cd(II) (M) Výškapíku(nA) CdT CdT' MT(Zn) CdT' MT(Zn) A B C D a b a bCd(II) Zn(II) MT(Cd) MT(Cd) Obrázek 26.: Biologická matrice ­ lidská moč. Typický DP voltamogram 10 M MT bez přídavku Cd(II) a 10 M MT + 500 M Cd(II) získaný v přítomnosti desetkrát zředěné lidské moči (A), vložený obrázek: píky MT(Zn) a MT(Cd) po použití matematické úpravy korekce na základní hladinu. Vliv různých koncentrací kademnatých (Ba) anebo zinečnatých (Bb) iontů na výšky píků CdT, CdT', MT(Cd) anebo CdT, MT(Zn). Lidské krevní sérum. Typický DP voltamogram 10 M MT bez přídavku Cd(II) a 10 M MT + 800 M Cd(II), a 10 M MT + 800 M Zn(II) v přítomnosti tisíckrát zředěného lidského krevního séra (C). Vliv různých koncentrací kademnatých (Da) anebo zinečnatých (Db) na výšky píků CdT, CdT', MT(Cd) anebo CdT, MT(Zn). Koncentrace MT byla 10 M. DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 300 s. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 25. 8.6 Porovnání MT biosensoru s technikou diferenční pulsní anodickou rozpouštěcí voltametrií Dále jsme se rozhodli porovnat standardní elektrochemickou metodu (diferenční pulsní anodickou rozpouštěcí voltametrii ­ DPASV) obecně užívanou pro stanovení těžkých kovů s navrženým MT biosensorem. Zinek poskytoval dobře vyvinuté DPASV 55 Základní electrolyt Zinek(Biosensor Porovnání signály, které se lineárně měnily podle jejich rozdílné koncentrace (5 ­ 100 M koncentrace zinku) v přítomnosti roztoku 0.5 M NaCl. Stejné koncentrační rozpětí jsme analyzovali pomocí MT biosensoru. Získané výšky signálů byly následně vyneseny v závislosti MT biosensor na DPASV signálech (Obr. 27). Získaná závislost signálů zinku z MT biosensoru (MT(Zn) signál) na signálech zinku měřených pomocí DPASV byla lineární (R2 = 0.9929). ) Zinek (DPASV) y = 0.019x + 11.817 R 2 = 0.9929 11.5 12.0 12.5 13.0 0 10 20 30 40 Obrázek 27.: Korelace MT biosensoru a techniky diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV) použité pro stanovení zinku v přítomnosti 0.5 M NaCl, kde jsme přidali 5, 10, 20, 40, 60, 80 a 100 M Zn(II). DPASV parametry byly následující: potenciál akumulace ­1.2 V, doba akumulace 60 s, počáteční potenciál ­1.2 V, konečný potenciál ­0.7 V, modulační čas 0.057 s, časový interval 0.2 s, potenciálový krok 1.95 mV/s, modulační amplituda 5 mV. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 25. 8.7 Analýza cisplatiny pomocí MT biosensoru v přítomnosti základního elektrolytu Po ověření námi navrženého biosensoru porovnáním s běžně používanou technikou (Obr. 27), jsme se rozhodli otestovat tuto techniku pro stanovení platinového cytostatika ­ cisplatiny (Obr. 28Aa). Při zvolené době interakce 300 s jsme získali voltamogram, který je zobrazen na Obr. 28A (plná čára). Pozorovali jsme tři signály: CdT (při potenciálu ­0.66 V), ZnT' (­0.87 V) a signál (­1.11 V) námi nazvaný PtMT, který by mohl souviset s redukcí platiny navázané na metalothionein (Obr. 28A). Navíc jsme pozorovali velmi zajímavý jev, že dobře pozorovatelné signály MT(Cd), MT(Zn) a ZnT úplně zmizely. Tento jev pravděpodobně souvisí s nahrazením kadmia anebo zinku platinou. Tento předpoklad potvrzuje afinita platiny k MT, protože se platina váže na tento protein 30 × silněji než kadmium a dokonce 107 × silněji než zinek [192]. 56 0 40 80 0 200 400 600 0 2 4 6 0 200 400 7 14 21 28 35 Časinterakce(s) Výškapíku(nA) Koncentracecisplatiny(M) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 5nA PtMT ­1.11V 0.5nA CdT 10MMT+94Mcisplatina 10MMTbez cisplatiny MT(Zn) MT(Cd) ZnT`ZnT A CdT CdT C Výškapíku(nA) PtMT PtMT a Cl Pt ClH3N H3N Výškapíku(%) B scan 0 40 80 0 200 400 600 0 2 4 6 0 200 400 7 14 21 28 35 Časinterakce(s) Výškapíku(nA) Koncentracecisplatiny(M) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 5nA PtMT ­1.11V 0.5nA CdT 10MMT+94Mcisplatina 10MMTbez cisplatiny MT(Zn) MT(Cd) ZnT`ZnT A CdT CdT C Výškapíku(nA) PtMT PtMT a Cl Pt ClH3N H3N Výškapíku(%) B scan 0 40 80 0 200 400 600 0 2 4 6 0 200 400 7 14 21 28 35 Časinterakce(s) Výškapíku(nA) Koncentracecisplatiny(M) ­1.2 ­0.9 ­0.6 ­0.3 Potenciál (V) 5nA PtMT ­1.11V 0.5nA CdT 10MMT+94Mcisplatina 10MMTbez cisplatiny MT(Zn) MT(Cd) ZnT`ZnT A CdT CdT C Výškapíku(nA) PtMT PtMT a Cl Pt ClH3N H3N Výškapíku(%) B scan Obrázek 28.: Cisplatina ­ analýza v prostředí 0.5 M NaCl. Typické DPV voltamogramy 10 M MT bez a s přídavkem + 94 M cisplatiny (A); vložený obrázek: pík PtMT po aplikaci korekce na základní hladinu. AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 300 s. Chemická struktura cisplatiny (Aa). Vliv doby interakce na výšku CdT a PtMT píku (B). Výška píku 1.72 nA (PtMT signál) a výška píku 29.4 nA (CdT signál) koresponduje hodnotě 100 %. Závislost výšek píků PtMT a CdT na různé koncentraci cisplatiny (C). Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 22. Z našich výsledků jasně vyplývá, že se průběh a tvar elektrochemického záznamu biosensoru výrazně mění v přítomnosti cisplatiny v porovnání se záznamem získaným pouze v základním elektrolytu (Obr. 28A). A proto jsme se rozhodli studovat závislost času interakce biosensoru s cisplatinou na výšce signálů PtMT a CdT. Pozorovali jsme, že signál PtMT nejprve pomalu vzrůstal s rostoucím časem interakce, přičemž v čase 400 s došlo k prudkému nárůstu tohoto signálu. Tento prudký nárůst pravděpodobně souvisí s uvolňováním kadmia a zinku z metalothioneinu působením cisplatiny, což potvrzuje pokles výšek signálů MT(Cd), MT(Zn), ZnT' a ZnT (Obr. 28A). Signál CdT postupně klesal se vzrůstajícím časem interakce v celém testovaném rozsahu (Obr. 28B). Vybrali jsme dobu interakce 420 s jako nejvhodnější pro následující analýzu cisplatiny, protože jsme při zvoleném čase nepozorovali signály dalších kovů a zároveň byla výška pozorovaných signálů dostatečná pro citlivou kvantifikaci cisplatiny. Dále jsme studovali závislost výšek PtMT a CdT signálů na koncentraci cisplatiny (Obr. 28C). Ve studovaném koncentračním rozsahu cisplatiny (25 ­ 375 M) byla pozorovaná závislost lineární (Obr. 28C a Tab. 3). Limit kvantifikace cisplatiny byl okolo 1.6 pmolů v 5 l (0.32 M). 57 8.8 Stanovení cisplatiny v přítomnosti lidského krevního séra Pro studium účinnosti protirakovinového léčiva je potřebné sledovat jeho terapeutickou hladinu. Zajímalo nás, zda námi navržený MT biosensor bude využitelný pro stanovení cisplatiny v přítomnosti lidského krevního séra. Z tohoto důvodu jsme přidali do lidského krevního séra rozdílnou koncentraci cisplatiny (10, 20, 40, 80, 160, 350, 450, 530 a 650 M). Pozorované změny CdT a PtMT signálů v závislosti na koncentraci cisplatiny jsou ukázány na Obr. 29A. Signál CdT se s rostoucí koncentrací cisplatiny lineárně snižoval (Tab. 3). Stejný jev jsme pozorovali i v případě analýzy kadmia a zinku. A navíc signál PtMT pomalu stoupal do koncentrace cisplatiny 350 M, a poté vzrostl výrazně (Obr. 29A). Pro analytické účely jsme se pokusili rozdělit PtMT křivku na dvě části: Obr. 29B (10 ­ 160 M) a Obr. 29C (350 ­ 650 M). Limit kvantifikace cisplatiny navrženým biosensorem se pohyboval kolem 1.2 M (R.S.D. byl 7.8 %, n = 5). Námi navržený postup ukazuje možnou cestu pro snadnou, senzitivní a rychlou detekci léčiva v tělních tekutinách na pikomolové úrovni (6 pmolů v 5 l kapce). A 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 Koncentrace cisplatiny (M) 0 10 20 30 40 300 500 700 0.0 0.5 1.0 1.5 0 50 100 150 Výškapíku(nA) PtMT CdT Výškapíku(nA) Výškapíku(nA) B C Výškapíku(nA) Koncentrace cisplatiny (M) A 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 Koncentrace cisplatiny (M) 0 10 20 30 40 300 500 700 0.0 0.5 1.0 1.5 0 50 100 150 Výškapíku(nA) CdT Výškapíku(nA) Výškapíku(nA) PtMT B C Výškapíku(nA) Koncentrace cisplatiny (M) Obrázek 29.: Cisplatina ­ analýza v prostředí lidského krevního séra. Závislost výšek píků PtMT a CdT (A), a výšky PtMT signálu (B a C) na různé koncentraci cisplatiny. AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 420 s. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 22. 58 Tabulka 3.: Vliv základního elektrolytu a biologické matrice (lidského krevního séra) na MT signály při analýze cisplatiny. Různá prostředí Stanovovaná sloučenina Koncentrace cisplatiny (M) MT signályc Rovnice R2 PtMT y = 0.0154x + 0.0833 0.9939Základní elektrolyta Cisplatina 25 ­ 375 CdTb y = -0.0683x + 32.8 0.9993 10 ­ 160 PtMT y = 0.0098x - 0.096 0.9953 350 ­ 650 PtMT y = 0.1046x - 34.42 0.9960 Lidské krevní sérum Cisplatina 10 ­ 650 CdTb y = -0.00670x + 25.8 0.9906 a Základním elektrolytem byl 0.5 M NaCl. b CdT signál byl použit pro kvantifikaci stanovovaných kovů. c Detailnější popis MT signálů je uveden v sekci ,,Výsledky a diskuse" anebo v následujících pracích [145, 175, 186, 188, 191]. 8.9 Studium interakcí mezi cisplatinou a DNA Protirakovinový efekt cisplatiny pravděpodobně souvisí s konformačními změnami ve struktuře DNA [20, 31]. Bylo navrženo několik možných modelů možných Pt(II) komplexů s DNA [30, 32-34, 67, 193]. Interakce Pt(II) komplexů pravděpodobně probíhá na molekule guaninu (G) v DNA. Dva modely zmíněných interakcí Pt(II) s DNA: a) chelatace s guaninem a b) adukt uvnitř jednoho vlákna, jsou ukázány na Obr. 30A. V dřívějších pracích bylo ukázáno, že pomocí elektrochemických technik je možné studovat vznik aduktů Pt(II) s DNA [135, 194, 195]. DNA poskytuje na HMDE dva signály, redukční signál adeninu a cytosinu (CA) a oxidační signál redukčního produktu guaninu (G) [196-199]. V naší práci jsme pozorovali interakci cisplatiny s dvouřetězcovou (ds)DNA pomocí cyklické voltametrie (CV). Jak jsme předpokládali, dsDNA (100 g.ml-1 ) poskytla oba očekávané signály jak CA tak G (Obr. 30B). A navíc bylo publikováno, že pík G se snižuje v případě vzniku aduktu DNA s Pt(II) [135]. V našem experimentu byla DNA modifikována v přítomnosti 10 mM NaClO4 při 37 °C. CV voltamogramy DNA v závislosti na vzrůstající koncentraci cisplatiny jsou ukázány na Obr. 30Ba,b,c,d. Z obrázku je patrné, že signály guaninu se vzrůstající koncentrací cisplatiny klesaly. Z výšek jednotlivých signálů jsme vytvořili závislost, která je zobrazena na Obr. 31A. Výška píku G výrazně klesala do koncentrace cisplatiny 50 M, a poté klesala pouze mírně. Pro analytické účely jsme získanou závislost rozdělili na dvě části, 0 ­ 50 M: y = -1.1442x + 119.34, R2 = 0.9999 a 100 ­ 450 M: y = -0.0208x + 60.948, R2 = 0.9944 (Obr. 31A). 59 Dalším studovaným parametrem byla doba, po kterou byla DNA vystavena interakci s cisplatinou. Vazbu jsme sledovali pomocí poklesu elektrochemického signálu guaninu. Pík G se snižoval s narůstající dobou modifikace DNA a po více jako 150 min. byl signál píku G snížen o více než 30 % (Obr. 31B). Po více než 24 h dochází k poklesu signálu píku G o více jako 60 %. Pokles signálu píku G souvisí pravděpodobně se vznikem aduktů Pt(II) s guaninem v molekule DNA. Pro následující experimenty jsme využili dobu interakce 24 hodin z důvodu předpokládaného vysokého výtěžku Pt(II)DNA aduktu. N NH N N NH2 Pt O NH3H3N 2+ DNA Pt NH3 NH3N(7)G N(7)G DNA 2+ ­1.5 ­1.0 ­0.5 0.0 CA pík G pík a b ­0.35 ­0.15 c d A 100 nA 50 nA scan Potenciál (V) B DNA bez přídavku cisplatiny Změna píku G DNA s cisplatinou a b Potenciál (V) N NH N N NH2 Pt O NH3H3N 2+ DNA N NH N N NH2 Pt O NH3H3N 2+ DNA Pt NH3 NH3N(7)G N(7)G DNA 2+ Pt NH3 NH3N(7)G N(7)G DNA 2+ ­1.5 ­1.0 ­0.5 0.0 CA pík G pík a b ­0.35 ­0.15­0.35 ­0.15 c d A 100 nA100 nA 50 nA scan Potenciál (V) B DNA bez přídavku cisplatiny Změna píku G DNA s cisplatinou a b Potenciál (V) Obrázek 30.: DNA ­ detekce DNA pomocí cyklické voltametrie. Dva pravděpodobné modely interakce cisplatiny s DNA: chelatace s guaninem (Aa) a adukt uvnitř jednoho vlákna (Ab). Typický cyklický voltamogram DNA bez přídavku cisplatiny (vlevo) a píků guaninu v DNA vystavené interakci s cisplatinou o různé koncentraci (a ­ 0, b ­ 10, c ­ 25 a d ­ 50 M); signály byly upraveny korekcí na základní hladinu (B). Jako základní elektrolyt pro analýzu DNA byl použit 0.3 M mravenčan amonný, pH 6.5. CV parametry byly následující: počáteční potenciál 0 V, potenciál obratu ­1.8 V a koncový potenciál 0 V, potenciálový krok 2 mV/s, rychlost polarizace 1 V/s, potenciál akumulace ­1.7 V, čas akumulace 3 s. 8.10 Kvantifikace Pt(II)-DNA aduktů Při přípravě samotného Pt(II)-DNA aduktu jsme předpokládali, že vzniklá směs bude obsahovat kromě vzniklého aduktu také ještě nenavázanou cisplatinu a nemodifikovanou DNA. Proto jsme se rozhodli celou analyzovanou směs zjednodušit a použili jsme se postup schématicky zobrazený na Obr. 32. Využili jsme ultrafiltrace pro odstranění všech nízkomolekulárních látek, především nenavázané cisplatiny. Poté jsme 60 použili cyklickou voltametrii (změna výšky píku G) a MT biosensor (změna výšky píku CdT) pro analýzu získané směsi (Obr. 32). Koncentraci Pt(II)-DNA aduktu jsme určili pomocí různé vstupní koncentrace cisplatiny použité pro modifikaci DNA. 40 60 80 100 120 0 250 500 R 2 = 0.9944 40 45 50 55 60 65 0 200 400 600 R 2 = 0.9999 50 70 90 110 0 20 40 60 40 60 80 100 0 50 100 150 Čas interakce (min) Změna výšky píku guaninu Výškapíku(pA) Guanin Koncentrace cisplatiny (M) Výškapíku(%) A B 40 60 80 100 120 0 250 500 R 2 = 0.9944 40 45 50 55 60 65 0 200 400 600 R 2 = 0.9999 50 70 90 110 0 20 40 60 40 60 80 100 0 50 100 150 Čas interakce (min) Výškapíku(pA) Guanin Koncentrace cisplatiny (M) Výškapíku(%) A B Změna výšky píku guaninu Obrázek 31.: DNA ­ detekce DNA pomocí cyklické voltametrie. Závislost výšky píku G na různé koncentraci cisplatiny (A) a době interakce (B). Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 30. 24 hodin Pt(II)-DNA aduktPt(II) komplex DNA + Pt(II)-DNA adukt + Ultrafiltrace + DNAPt(II) komplex Změny G pík ­ cyklická voltametrie Změny CdT píku ­ biosensor Detekce Pt(II)- DNA aduktů DNA + Obrázek 32.: Schéma přípravy a náasledné detekce Pt(II)-DNA aduktů. 61 38 42 46 50 0 250 500 0 25 50 75 100 0 20 40 60 50 70 90 0 5 10 15 20 20 23 26 0 250 500 CdT CdT Výškapíku(%) Čas interakce (min) Výškapíku(pA) Výškapíku(nA) 0 25 50 75 100 0 200 400 Koncentrace Pt-DNAaduktu(g/mL) Změna Gpíku Výškapíku(nA) Koncentrace Pt-DNAaduktu (g/mL) A B a b C 38 42 46 50 0 250 500 0 25 50 75 100 0 20 40 60 50 70 90 0 5 10 15 20 20 23 26 0 250 500 CdT CdT Výškapíku(%) Čas interakce (min) Výškapíku(pA) Výškapíku(nA) 0 25 50 75 100 0 200 400 Koncentrace Pt-DNAaduktu(g/mL) Změna Gpíku Výškapíku(nA) Koncentrace Pt-DNAaduktu (g/mL) A B a b C Obrázek 33.: Detekce Pt(II)-DNA aduktů ­ cyklická voltametrie. Závislost výšky píku G na různé koncentraci Pt(II)-DNA aduktu (A). MT biosensor. Závislosti výšky píku CdT na různé době interakce biosensoru s Pt(II)-DNA aduktem (B) a na koncentraci Pt(II)DNA aduktu (C). AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 240 s, doba interakce 400 s. Další experimentální podmínky jsou popsány v legendě Obrázku 22 (MT biosensor) a Obrázku 30 (cyklická voltametrie). Změny výšky píku G v závislosti na různé koncentraci Pt(II)-DNA aduktu jsou ukázány na Obr. 33A. Pro analytické účely jsme rozdělili získanou závislost na dvě části: 0 ­ 50 M: y = -0.9153x + 95.476, R2 = 0.9999 a 100 ­ 450 M: y = -0.0166x + 48.758, R2 = 0.9944 (Obr. 33A). V případě, že jsme pro analýzu Pt(II)-DNA aduktů použili cyklickou voltametrii, detekovali jsme nejen Pt(II)-DNA adukty ale i nemodifikovanou DNA, která se ve směsi pravděpodobně vyskytovala (Obr. 32 a 33A). Proto jsme použili MT biosensor, který je schopen detekovat pouze Pt(II)-DNA adukty z důvody přítomnosti platiny v této molekule. Nejprve jsme studovali vliv různé doby interakce na CdT signál MT biosensoru (Obr. 33B). Již po prvních 60 s jsme pozorovali pokles CdT signálu o 5 % ve srovnání s výškou CdT signálu bez přítomnosti Pt(II)-DNA aduktu. CdT signál výrazně klesal do prvních deseti minut interakce, poté se snižoval jen mírně. Pro následující experimenty jsme využili dobu interakce 5 minut z důvodu rychlosti stanovení. Závislost výšky CdT signálu na koncentraci Pt(II)-DNA aduktu je ukázána na Obr. 33C. Limit kvantifikace Pt(II)-DNA aduktu byl okolo 200 ng.ml-1 . 62 VI. ZÁVĚR V této práci byl navržen jednoduchý biosensor pro stanovení těžkých kovů a platinového cytostatika využívající modifikace povrchu fytochelatinem anebo metalothioneinem modifikované kapkové rtuťové elektrody. Získané výsledky ukazují na možné využití této technologie pro snadnou, rychlou a levnou detekci těžkých kovů přítomných v životním prostředí anebo v biologii či medicíně. Další výhodou námi navržené techniky je možnost miniaturizace celého detekčního systému a aplikace při monitoringu prostředí v reálném čase. Navíc byla v této práci studována interakce cisplatiny s DNA pomocí MT biosensoru. Cisplatina je stále velmi hojně používané cytostatikum při léčbě nádorových onemocněních, ovšem přesný mechanismus účinku není stále znám. Její cytoxicita zřejmě spočívá ve schopnosti vázat se do DNA a zabránit tak replikaci. Pro studium tohoto procesu se používá velmi časové a finančně náročné analytické techniky. Námi navržený biosensor je schopen velmi snadno rozlišit DNA od DNA modifikované cisplatinou, což otevírá nové možnosti ve studiu vazby platinových interkalátorů do DNA. 63 VII. SHRNUTÍ Znečištění životního prostředí toxickými těžkými kovy je výsledkem mnoho lidských aktivit jako je těžký těžební a hutní průmysl. Následný vliv těchto kovů na ekosystémy má obrovský význam nejen z hlediska významu pro lidské zdraví, ale také z hlediska ekonomického, protože tyto prvky a nejsou biodegradovatelné a jsou akumulovány v různých živých systémech. Kromě ,,standardních" toxických kovů jako je kadmium, olovo a rtuť, jejichž koncentrace v životním prostředí je monitorována po mnoho let, se v poslední době zaměřuje pozornost na platinové kovy (platinu a rhodium) z důvodu zavedení katalyzátorů. A navíc platinové komplexy hrají velmi významnou roli v chemoterapii různých druhů nádorových onemocnění. Jako následek vzrůstajícího používání platiny jak v průmyslu, tak pro zdravotnické účely, je nezbytné vyvíjet techniky nejen pro stanovení ,,standardních" kovů, ale také platinových sloučenin a monitorovat tak jejich hladinu v různých složkách životního prostředí a živých systémech. Vývoj různých biosensorů pro tyto účely a jejich použití namísto robustních analytických technik má obrovský potenciál z důvodu výhod, které využití biosenorů poskytuje jako např. specifita, nízké náklady, jednoduché použití a možnost monitoringu v reálném čase. Cílem této práce bylo navrhnout biosensory pro stanovení těžkých kovů založené na interakci těžké kovy vázajících látek (fytochelatin ­ PC2 a metalothionein ­ MT) pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí (AdTS) diferenční pulsní voltametrie (DPV). Nejprve jsme využili PC2 biosensor pro stanovení kademnatých a zinečnatých iontů, a cisplatiny. Limity kvantifikace byly pro Cd(II) 0.6 pmolu, Zn(II) 8 pmolu a pro cisplatinu 1 pmolu v 5 l kapce vzorku. Poté, co jsme prokázali, že jsme schopni navrhnout biosensor prostřednictvím modifikace visící rtuťové kapkové elektrody, jsme se pokusili využít protein metalothionein namísto PC2 pro stejné účely. Nejprve jsme studovali elektrochemické chování MT na povrchu visící rtuťové kapkové elektrody pomocí AdTS DPV. Dokonalého pokrytí povrchu elektrody bylo pravděpodobně dosaženo po 240 s při adsorpci 10 M MT. Dosažené limity kvantifikace analyzovaných těžkých kovů (kadmia(II) a zinku(II)) v přítomnosti základního elektrolytu (0.5 M NaCl, pH 6.4) byly 160 fmolů Cd(II) a 220 fmolů Zn(II) v 5 l kapce vzorku. Dále jsme aplikovali MT biosensor na analýzu těžkých kovů v lidských tělních tekutinách (lidská moč a krevní sérum) a porovnali s metodou DPASV. MT biosensor byl na závěr použit pro studium interakcí mezi cisplatinou a dsDNA a pro kvantifikaci Pt(II)-DNA aduktů. 64 VIII. SUMMARY The pollution of the environment with toxic metals is a result of many human activities, such as mining and metallurgy, and the effects of these metals on the ecosystems are of large economic and public-health significance, because these substances are not biodegradable and retained by the ecological system. Besides "standard" toxic metals such as cadmium, lead and mercury, which have been monitoring for many years, following the introduction of automobile catalytic converters the platinum group metals (platinum and rhodium) gain on increasing interest in environmental research. Moreover platinum complexes play an important role in the chemotherapy of various tumour diseases. As a consequence of the increasing employment of platinum for exhaust purification, in industry and tumour diseases treatment, it became necessary to determine not only "standard" toxic metals but also platinum compounds in a wide range of biological and environmental matrices. Suggestion of biosensors could be very suitable for these purposes instead of robust analytical techniques, because biosensors have the advantages of specificity, low cost, ease of use, portability and the ability to furnish continuous real time signals. The aim of this work was to suggest new heavy metal biosensors based on interaction of metals (cadmium and zinc) with heavy metal binding biological compounds (phytochelatin ­ PC2 and/or metallothionein ­ MT), using adsorptive transfer stripping (AdTS) differential pulse voltammetry (DPV). Primarily, we utilized PC2 biosensor to determine cadmium, zinc and cisplatin. The quantification limits (3 S/N) of Cd(II), Zn(II) and cisplatin were about 0.6, 8 and 1 pmole in 5 l, respectively. After that we did proved that we were able to suggest biosensor through modification of hanging mercury drop electrode, we attempted to utilize metallothionein instead of PC2 for the same purposes. We studied the electrochemical behaviour of MT on the surface of hanging mercury drop electrode by AdTS DPV. Perfect coverage of the electrode surface ­ forming of the surface assembled monolayer ­ was probably reached at time about 240 s for 10 M protein concentration. The quantification limits of the analysed heavy metals (cadmium(II) and zinc(II)), which were analysed in the presence of 0.5 M NaCl (pH 6.4), were 160 and 220 fmole in 5 l drop, respectively. In addition, we applied the MT biosensor to analyse heavy metals in human body liquids (human blood serum and human urine) and to compare with differential pulse anodic stripping voltammetry. Moreover, we used MT biosensor to investigate interactions between cisplatin and dsDNA and to quantify the Pt(II)-DNA adducts. 65 IX. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] J. Zehnalek, V. Adam, and R. Kizek, "Influence of heavy metals on production of protecting compounds in agriculture plants," Listy Cukrov, vol. 120, pp. 222-224, 2004. [2] N. N. Greenwood and Earnshaw, Chemie prvku I., II. Praha: Informatorium, 1993. [3] D. Voet and J. G. Voet, Biochemie, 1. ed. Praha: Victoria Publishing, 1995. [4] K. Konoha, Y. Sadakane, and M. Kawahara, "Zinc neurotoxicity and its role in neurodegenerative diseases," J. Health Sci., vol. 52, pp. 1-8, 2006. [5] M. Stefanidou, C. Maravelias, A. Dona, and C. Spiliopoulou, "Zinc: a multipurpose trace element," Arch. Toxicol., vol. 80, pp. 1-9, 2006. [6] A. S. Prasad, A. Miale, Z. Farid, H. H. Sandsted, A. R. Schulert, and W. J. Darby, "Biochemical studies on dwarfism, hypogonadism, and anemia," Arch. Inter. Med., vol. 111, pp. 407-428, 1961. [7] E. Mocchegiani, C. Bertoni-Freddari, F. Marcellini, and M. Malavolta, "Brain, aging and neurodegeneration: Role of zinc ion availability," Prog. Neurobiol., vol. 75, pp. 367-390, 2005. [8] C. J. Frederickson, J. Y. Koh, and A. I. Bush, "The neurobiology of zinc in health and disease," Nat. Rev. Neurosci., vol. 6, pp. 449-462, 2005. [9] M. M. Brzoska and J. Moniuszko-Jakoniuk, "Interactions between cadmium and zinc in the organism," Food Chem. Toxicol., vol. 39, pp. 967-980, 2001. [10] S. Satarug, M. R. Haswell-Elkins, and M. R. Moore, "Safe levels of cadmium intake to prevent renal toxicity in human subjects," Brit. J. Nutr., vol. 84, pp. 791-802, 2000. [11] P. Hotz, J. P. Buchet, A. Bernard, D. Lison, and R. Lauwerys, "Renal effects of low-level environmental cadmium exposure: 5-year follow-up of a subcohort from the Cadmibel study," Lancet, vol. 354, pp. 1508-1513, 1999. [12] S. Benoff, A. Jacob, and I. R. Hurley, "Male infertility and environmental exposure to lead and cadmium," Hum. Reprod. Update, vol. 6, pp. 107-121, 2000. [13] M. Castelli, B. Rossi, F. Corsetti, A. Mantovani, G. Spera, C. Lubrano, L. Silvestroni, M. Patriarca, F. Chlodo, and A. Menditto, "Levels of cadmium and lead in blood: an application of validated methods in a group of patients with endocrine/metabolic disorders from the Rome area," Microchem J., vol. 79, pp. 349-355, 2005. [14] D. Il'yasova and G. G. Schwartz, "Cadmium and renal cancer," Toxicol. Appl. Pharmacol., vol. 207, pp. 179-186, 2005. [15] M. Waisberg, P. Joseph, B. Hale, and D. Beyersmann, "Molecular and cellular mechanisms of cadmium carcinogenesis," Toxicology, vol. 192, pp. 95-117, 2003. [16] R. H. Holm and E. I. Solomon, "Bioinorganic enzymology - Preface," Chem. Rev., vol. 96, pp. 2237-2237, 1996. [17] C. Orvig and M. J. Abrams, "Medicinal inorganic chemistry: Introduction," Chem. Rev., vol. 99, pp. 2201-2203, 1999. [18] P. J. Sadler, "Inorganic-Chemistry and Drug Design," Adv. Inorg. Chem., vol. 36, pp. 1-48, 1991. [19] E. Raymond, S. Faivre, S. Chaney, J. Woynarowski, and E. Cvitkovic, "Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin," Mol. Cancer. Ther., vol. 1, pp. 227-235, 2002. [20] M. A. Fuertes, J. Castilla, C. Alonso, and J. M. Perez, "Cisplatin biochemical mechanism of action: From cytotoxicity to induction of cell death through interconnections between apoptotic and necrotic pathways," Curr. Med. Chem., vol. 10, pp. 257-266, 2003. [21] B. Rosenberg, L. Van Camp, and T. Krigas, "Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode," Nature, vol. 205, pp. 698-699, 1965. [22] E. Wong and C. M. Giandomenico, "Current status of platinum-based antitumor drugs," Chem. Rev., vol. 99, pp. 2451-2466, 1999. [23] W. P. McGuire, W. J. Hoskins, M. F. Brady, P. R. Kucera, E. E. Partridge, K. Y. Look, D. L. ClarkePearson, and M. Davidson, "Cyclophosphamide and cisplatin compared with 66 paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer," N. Engl. J. Med., vol. 334, pp. 1-6, 1996. [24] R. S. Go and A. A. Adjei, "Review of the comparative pharmacology and clinical activity of cisplatin and carboplatin," J. Clin. Oncol., vol. 17, pp. 409-422, 1999. [25] H. T. See, R. S. Freedman, A. P. Kudelka, T. W. Burke, D. M. Gershenson, S. Tangjitgamol, and J. J. Kavanagh, "Retrospective review: re-treatment of patients with ovarian cancer with carboplatin after platinum resistance," Int. J. Gynecol. Cancer, vol. 15, pp. 209-216, 2005. [26] D. Arango, A. J. Wilson, Q. Shi, G. A. Corner, M. J. Aranes, C. Nicholas, M. Lesser, J. M. Mariadason, and L. H. Augenlicht, "Molecular mechanisms of action and prediction of response to oxaliplatin in colorectal cancer cells," Brit. J. Cancer, vol. 91, pp. 1931-1946, 2004. [27] A. Grothey and R. M. Goldberg, "A review of oxaliplatin and its clinical use in colorectal cancer," Expert Opin. Pharmaco., vol. 5, pp. 2159-2170, 2004. [28] F. Zak, J. Turanek, A. Kroutil, P. Sova, A. Mistr, A. Poulova, P. Mikolin, Z. Zak, A. Kasna, D. Zaluska, J. Neca, L. Sindlerova, and A. Kozubik, "Platinum(IV) complex with adamantylamine as nonleaving amine group: Synthesis, characterization, and in vitro antitumor activity against a panel of cisplatin-resistant cancer cell lines," J. Med. Chem., vol. 47, pp. 761-763, 2004. [29] A. Kozubik, V. Horvath, L. Svihalkova-Sindlerova, K. Soucek, J. Hofmanova, P. Sova, A. Kroutil, F. Zak, A. Mistr, and J. Turanek, "High effectiveness of platinum(IV) complex with adamantylamine in overcoming resistance to cisplatin and suppressing proliferation of ovarian cancer cells in vitro," Biochem. Pharmacol., vol. 69, pp. 373-383, 2005. [30] S. G. Chaney, S. L. Campbell, B. Temple, E. Bassett, Y. B. Wu, and M. Faldu, "Protein interactions with platinum-DNA adducts: from structure to function," J. Inorg. Biochem., vol. 98, pp. 1551-1559, 2004. [31] D. Wang and S. J. Lippard, "Cellular processing of platinum anticancer drugs," Nat. Rev. Drug Discov., vol. 4, pp. 307-320, 2005. [32] J. D. Page, I. Husain, A. Sancar, and S. G. Chaney, "Effect of the diaminocyclohexane carrier ligand on platinum adduct formation, repair, and lethality," Biochemistry, vol. 29, pp. 1016-1024, 1990. [33] J. M. Woynarowski, W. G. Chapman, C. Napier, M. C. S. Herzig, and P. Juniewicz, "Sequence- and region-specificity of oxaliplatin adducts in naked and cellular DNA," Mol. Pharmacol., vol. 54, pp. 770-777, 1998. [34] M. Kartalou and J. M. Essigmann, "Recognition of cisplatin adducts by cellular proteins," Mutat. Res-Fund. Mol. M., vol. 478, pp. 1-21, 2001. [35] A. Ericson, "Model systems for metal-DNA interactions," in Inorganic Chemistry. Lund, Sweden: Lund University, 1997, pp. 225. [36] U. Divrikli, S. Saracoglu, M. Soylak, and L. Elci, "Determination of trace heavy metal contents of green vegetable samples from Kayseri-Turkey by flame atomic absorption spectrometry," Fresenius Environ. Bull., vol. 12, pp. 1123-1125, 2003. [37] Y. Kojuncu, J. M. Bundalevska, U. Ay, K. Cundeva, T. Stafilov, and G. Akcin, "Atomic absorption spectrometry determination of Cd, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn, and Tl traces in seawater following flotation separation," Sep. Sci. Technol., vol. 39, pp. 2751-2765, 2004. [38] G. L. Donati, C. C. Nascentes, A. R. A. Nogueira, M. A. Z. Arruda, and J. S. Nobrega, "Acid extraction and cloud point preconcentration as sample preparation strategies for cobalt determination in biological materials by thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry," Microchem J., vol. 82, pp. 189-195, 2006. [39] M. Soylak, H. Colak, M. Tuzen, O. Turkoglu, and L. Elci, "Comparison of digestion procedures on commercial powdered soup samples for the determination of trace metal contents by atomic absorption spectrometry," J. Food Drug Anal., vol. 14, pp. 62-67, 2006. [40] S. Cancela and M. C. Yebra, "Flow-injection flame atomic absorption spectrometric determination of trace amounts of cadmium in solid and semisolid milk products coupling 67 a continuous ultrasound-assisted extraction system with the online preconcentration on a chelating aminomethylphosphoric acid resin," J. AOAC Int., vol. 89, pp. 185-191, 2006. [41] V. A. Lemos, E. M. Gama, and A. D. Lima, "On-line preconcentration and determination of cadmium, cobalt and nickel in food samples by flame atomic absorption spectrometry using a new functionalized resin," Microchim. Acta, vol. 153, pp. 179-186, 2006. [42] E. C. Lima, F. J. Krug, and K. W. Jackson, "Evaluation of tungsten-rhodium coating on an integrated platform as a permanent chemical modifier for cadmium, lead, and selenium determination by electrothermal atomic absorption spectrometry," Spectroc. Acta Pt. B- Atom. Spectr., vol. 53, pp. 1791-1804, 1998. [43] M. Foltin and T. Prochackova, "Analytical application of FIA-AAS combination for the determination of heavy metals in environmental samples," Chem. listy, vol. 92, pp. 978- 987, 1998. [44] K. Sutton, R. M. C. Sutton, and J. A. Caruso, "Inductively coupled plasma mass spectrometric detection for chromatography and capillary electrophoresis," J. Chrom., vol. 789, pp. 85-126, 1997. [45] P. K. Petrov, G. Wibetoe, and D. L. Tsalev, "Comparison between hydride generation and nebulization for sample introduction in the determination of lead in plants and water samples by inductively coupled plasma mass spectrometry, using external calibration and isotope dilution," Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr., vol. 61, pp. 50-57, 2006. [46] A. C. Davis, P. Wu, X. F. Zhang, X. D. Hou, and B. T. Jones, "Determination of cadmium in biological samples," Appl. Spectrosc. Rev., vol. 41, pp. 35-75, 2006. [47] D. E. Nixon and T. P. Moyer, "Routine clinical determination of lead, arsenic, cadmium, and thallium in urine and whole blood by inductively coupled plasma mass spectrometry," Spectroc. Acta Pt. B-Atom. Spectr., vol. 51, pp. 13-25, 1996. [48] A. J. Fernandez-Espinosa and M. Ternero-Rodriguez, "Study of traffic pollution by metals in Seville (Spain) by physical and chemical speciation methods," Anal. Bioanal. Chem., vol. 379, pp. 684-699, 2004. [49] A. A. Momen, G. A. Zachariadis, A. N. Anthemidis, and J. A. Stratis, "Development and validation of routine analysis methods for the determination of essential, nonessential, and toxic minor and trace elements in cereal and cereal flour samples by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry," J. AOAC Int., vol. 88, pp. 1797-1810, 2005. [50] A. Krejcova, D. Kahoun, T. Cernohorsky, and M. Pouzar, "Determination of macro and trace element in multivitamins preparations by inductively coupled plasma optical emission spectrometry with slurry sample introduction," Food Chem., vol. 98, pp. 171-178, 2006. [51] S. Ayrault, L. Galsomies, G. Amblard, M. D. Sciarretta, P. Bonhomme, and A. Gaudry, "Instrumental neutron activation analysis (INAA) and inductively coupled plasma/mass spectrometry (ICP-MS) for trace element biomonitoring using mosses," Int. J. Environ. Anal. Chem., vol. 82, pp. 463-473, 2002. [52] B. N. Lee, R. Dantzer, K. E. Langley, G. J. Bennett, P. M. Dougherty, A. J. Dunn, C. A. Meyers, A. H. Miller, R. Payne, J. M. Reuben, X. S. Wang, and C. S. Cleeland, "A cytokine-based neuroimmunologic mechanism of cancer-related symptoms," Neuroimmunomodulation, vol. 11, pp. 279-292, 2004. [53] G. de la Rosa, J. R. Peralta-Videa, M. Montes, J. G. Parsons, I. Cano-Aguilera, and J. L. Gardea-Torresdey, "Cadmium uptake and translocation in tumbleweed (Salsola kali), a potential Cd-hyperaccumulator desert plant species: ICP/OES and XAS studies," Chemosphere, vol. 55, pp. 1159-1168, 2004. [54] M. Grotti, M. L. Abelmoschi, F. Soggia, and R. Frache, "Determination of ultratrace elements in natural waters by solid-phase extraction and atomic spectrometry methods," Anal. Bioanal. Chem., vol. 375, pp. 242-247, 2003. [55] P. C. do Nascimento, M. D. Marques, M. Hilgemann, L. M. de Carvalho, D. Bohrer, S. G. Pomblum, and S. Schirmer, "Simultaneous determination of cadmium, copper, lead and zinc in amino acid parenteral nutrition solutions by anodic stripping voltammetry and sample digestion by UV irradiation," Anal. Lett., vol. 39, pp. 777-790, 2006. 68 [56] S. Legeai and O. Vittori, "A Cu/Nafion/Bi electrode for on-site monitoring of trace heavy metals in natural waters using anodic stripping voltammetry: An alternative to mercury- based electrodes," Anal. Chim. Acta, vol. 560, pp. 184-190, 2006. [57] S. Legeai, K. Soropogui, M. Cretinon, O. Vittori, A. H. De Oliveira, F. Barbier, and M. F. Grenier-Loustalot, "Economic bismuth-film microsensor for anodic stripping analysis of trace heavy metals using differential pulse voltammetry," Anal. Bioanal. Chem., vol. 383, pp. 839-847, 2005. [58] M. Kudrava and D. Rurikova, "Determination of bioavailable species of lead and cadmium in soils by differential pulse anodic stripping voltammetry," Chem. Listy, vol. 99, pp. 731- 736, 2005. [59] M. C. V. Mamani, L. M. Aleixo, M. F. de Abreu, and S. Rath, "Simultaneous determination of cadmium and lead in medicinal plants by anodic stripping voltammetry," J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 37, pp. 709-713, 2005. [60] D. Sancho, L. Deban, R. Pardo, and D. Valladolid, "Determination of zinc, cadmium, lead and copper in pellets and pulp of sugar beet," J. Sci. Food Agric., vol. 85, pp. 1021-1025, 2005. [61] J. Wang, J. M. Lu, S. B. Hocevar, P. A. M. Farias, and B. Ogorevc, "Bismuth-coated carbon electrodes for anodic stripping voltammetry," Anal. Chem., vol. 72, pp. 3218-3222, 2000. [62] Y. Bonfil, M. Brand, and E. Kirowa-Eisner, "Trace determination of mercury by anodic stripping voltammetry at the rotating gold electrode," Anal. Chim. Acta, vol. 424, pp. 65- 76, 2000. [63] Y. Bonfil, M. Brand, and E. Kirowa-Eisner, "Characteristics of subtractive anodic stripping voltammetry of lead, cadmium and thallium at silver-gold alloy electrodes," Electroanalysis, vol. 15, pp. 1369-1376, 2003. [64] S. B. Hocevar, J. Wang, R. P. Deo, and B. Ogorevc, "Potentiometric stripping analysis at bismuth-film electrode," Electroanalysis, vol. 14, pp. 112-115, 2002. [65] A. M. O. Brett, S. H. P. Serrano, T. A. Macedo, D. Raimundo, M. H. Marques, and M. A. LaScalea, "Electrochemical determination of carboplatin in serum using a DNA-modified glassy carbon electrode," Electroanalysis, vol. 8, pp. 992-995, 1996. [66] M. Fojta, "Electrochemical sensors for DNA interactions and damage," Electroanalysis, vol. 14, pp. 1449-1463, 2002. [67] S. S. Babkina and N. A. Ulakhovich, "Amperometric biosensor based on denatured DNA for the study of heavy metals complexing with DNA and their determination in biological, water and food samples," Bioelectrochemistry, vol. 63, pp. 261-265, 2004. [68] S. Rodriguez-Mozaz, M. P. Marco, M. J. L. de Alda, and D. Barcelo, "Biosensors for environmental applications: Future development trends," Pure Appl. Chem., vol. 76, pp. 723-752, 2004. [69] C. Berggren, B. Bjarnason, and G. Johansson, "Capacitive biosensors," Electroanalysis, vol. 13, pp. 173-180, 2001. [70] Y. Lu, J. W. Liu, J. Li, P. J. Bruesehoff, C. M. B. Pavot, and A. K. Brown, "New highly sensitive and selective catalytic DNA biosensors for metal ions," Biosen. Bioelectron., vol. 18, pp. 529-540, 2003. [71] A. M. Aiken, B. M. Peyton, W. A. Apel, and J. N. Petersen, "Heavy metal-induced inhibition of Aspergillus niger nitrate reductase: applications for rapid contaminant detection in aqueous samples," Anal. Chim. Acta, vol. 480, pp. 131-142, 2003. [72] S. V. Dzyadevych, A. P. Soldatkin, Y. I. Korpan, V. N. Arkhypova, A. V. El'skaya, J. M. Chovelon, C. Martelet, and N. Jaffrezic-Renault, "Biosensors based on enzyme field-effect transistors for determination of some substrates and inhibitors," Anal. Bioanal. Chem., vol. 377, pp. 496-506, 2003. [73] B. Krajewska, W. Zaborska, and M. Chudy, "Multi-step analysis of Hg2+ ion inhibition of jack bean urease," J. Inorg. Biochem., vol. 98, pp. 1160-1168, 2004. [74] B. Kuswandi, "Simple optical fibre biosensor based on immobilised enzyme for monitoring of trace heavy metal ions," Anal. Bioanal. Chem., vol. 376, pp. 1104-1110, 2003. 69 [75] J. Horswell, T. W. Speir, and A. P. van Schaik, "Bio-indicators to assess impacts of heavy metals in land-applied sewage sludge," Soil Biol. Biochem., vol. 35, pp. 1501-1505, 2003. [76] I. Bontidean, J. R. Lloyd, J. L. Hobman, J. R. Wilson, E. Csoregi, B. Mattiasson, and N. L. Brown, "Bacterial metal-resistance proteins and their use in biosensors for the detection of bioavailable heavy metals," J. Inorg. Biochem., vol. 79, pp. 225-229, 2000. [77] C.-M. Wu and L.-Y. Lin, "Immobilization of metallothionein as a sensitive biosensor chip for the detection of metal ions by surface plasmon resonance," Biosen. Bioelectron., vol. 20, pp. 864-871, 2004. [78] I. Bontidean, J. Ahlqvist, A. Mulchandani, W. Chen, W. Bae, R. K. Mehra, A. Mortari, and E. Csoregi, "Novel synthetic phytochelatin-based capacitive biosensor for heavy metal ion detection," Biosen. Bioelectron., vol. 18, pp. 547-553, 2003. [79] X. L. Luo, A. Morrin, A. J. Killard, and M. R. Smyth, "Application of nanoparticles in electrochemical sensors and biosensors," Electroanalysis, vol. 18, pp. 319-326, 2006. [80] N. Verma and M. Singh, "Biosensors for heavy metals," Biometals, vol. 18, pp. 121-129, 2005. [81] G. A. Rechnitz, "Biosensors into the 1990s," Electroanalysis, vol. 3, pp. 73-76, 1991. [82] P. Skladal, Biosenzory, 1. ed. Brno: Masarykova univerzita Brno, 2000. [83] D. C. Harris, Quantitative chemical analysis, Sixth ed. New York: W. H. Freeman and Company, 2003. [84] M. U. A. Bromba and H. Ziegler, "Application hints for Savitzky-Golay digital smoothing filtres," Anal.Chem., vol. 53, pp. 1583-1586, 1981. [85] K. Markusova, Elektrochemicke metódy, vol. 1. Kosice: Univerzita Pavla Jozefa Šafarika v Kosiciach, 2000. [86] J. Wang, Analytical Electrochemistry. New York: VCH Publishers, Inc., 1994. [87] J. Heyrovsky and J. Kuta, Zaklady polarografie. Praha: ČS AV, 1962. [88] J. Garaj, J. Bercik, D. Bustin, J. Čerňak, J. Štefanec, and M. Traiter, Fyzikalne a fyzikalnochemicke analyticke metódy. Bratislava: Vydavatelstvo technickej a ekenomickej literatury, 1977. [89] R. Solna and P. Skladal, "Amperometric flow-injection determination of phenolic compounds using a biosensor with immobilized laccase, peroxidase and tyrosinase," Electroanalysis, vol. 17, pp. 2137-2146, 2005. [90] M. Pohanka and P. Skladal, "Piezoelectric immunosensor for Francisella tularensis detection using immunoglobulin M in a limiting dilution," Anal. Lett., vol. 38, pp. 411-422, 2005. [91] R. Solna, E. Dock, A. Christenson, M. Winther-Nielsen, C. Carlsson, J. Emneus, T. Ruzgas, and P. Skladal, "Amperometric screen-printed biosensor arrays with co- immobilised oxidoreductases and cholinesterases," Anal. Chim. Acta, vol. 528, pp. 9-19, 2005. [92] S. E. Moriarty-Craige and D. P. Jones, "Extracellular thiols and thiol/disulfide redox in metabolism," Annu. Rev. Nutr., vol. 24, pp. 481-509, 2004. [93] A. Meister and M. E. Anderson, "Glutathione," Ann. Rev. Biochem., vol. 52, pp. 711-760, 1983. [94] D. M. Townsend, K. D. Tew, and H. Tapiero, "The importance of glutathione in human disease," Biomed. Pharmacother, vol. 57, pp. 145-155, 2003. [95] C. S. Cobbett, "Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification," Plant Physiol., vol. 123, pp. 825-832, 2000. [96] S. L. di Toppi and R. Gabbrielli, "Response to cadmium in higher plants," Environ. Exp. Bot., vol. 41, pp. 105-130, 1999. [97] R. Prusa, R. Kizek, L. Trnkova, J. Vacek, and J. Zehnalek, "Study of relationship between metallothionein and heavy metals by CPSA method," Clinical Chemistry, vol. 50, pp. A28- A29, 2004. [98] M. H. Zenk, "Heavy metal detoxification in higher plants - a review," Gene, vol. 179, pp. 21-30, 1996. 70 [99] P. M. Ridker, C. H. Hennekens, J. E. Buring, and N. Rifai, "C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women," N. Engl. J. Med., vol. 342, pp. 836-843, 2000. [100] D. Grill, M. Tausz, and L. J. D. Kok, Plant Ecophysiology, vol. 2. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 2001. [101] D. Grill, M. Tausz, and L. J. D. Kok, Significance of glutathione to plant adaptation to the Environment. London: Kluwer Academic Publisher, 2000. [102] H. Jefferies, J. Coster, A. Khalil, J. Bot, R. D. McCauley, and J. C. Hall, "Glutathione," Anz. J. Surg., vol. 73, pp. 517-522, 2003. [103] M. Asensi, J. Sastre, F. V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehner, J. Garcia-de-la Asuncion, and J. Vina, "Ratio of reduced to oxidized glutathione as indicator of oxidative stress status and DNA damage," Methods Enzymol., vol. 299, pp. 267-276, 1999. [104] M. E. Anderson, "Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation," Chem-Biol. Interact, vol. 112, pp. 1-14, 1998. [105] C. S. Cobbett, "Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification," Curr. Opin. Plant Biol., vol. 3, pp. 211-216, 2000. [106] C. S. Cobbett, "Heavy metal detoxification in plants: phytochelatin biosynthesis and function," IUBMB Life, vol. 51, pp. 183-188, 2001. [107] C. S. Cobbett and P. B. Goldsbrough, "Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis," Annu. Rev. Plant. Biol., vol. 53, pp. 159-181, 2002. [108] C. S. Cobbett, "A family of phytochelatin synthase genes from plant, fungal and animal species," Trends Plant Sci., vol. 4, pp. 335-337, 1999. [109] E. Grill, E.-L. Winnacker, and M. H. Zenk, "Phytochelatins: the principal heavy-metal complexing peptides of higher plants," Science, vol. 320, pp. 674-676, 1985. [110] E. Grill, S. Loffler, E.-L. Winnacker, and M. H. Zenk, "Phytochelatins, the heavy-metal- binding peptides of plants, are synthesized from glutathione by a specific - glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase)," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 6838-6842, 1989. [111] J. Thurmann, E. Grill, E.-L. Winnacker, and M. H. Zenk, "Reactivation of metal-requiring apoenzymes by phytochelatin-metal colmpex," FEBS Lett., vol. 284, pp. 66-69, 1991. [112] L. Sanita di Toppi and R. Gabbrielli, "Response to cadmium in higher plants," Environ. Exp. Bot., vol. 41, pp. 105-130, 1999. [113] R. Kizek, J. Vacek, V. Adam, and B. Vojtesek, "Vztah metalothioneinu k rakovine a protinadorove lecbe," Klin. Biochem. Metab., vol. 12, pp. 72-78, 2004. [114] R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, B. Klejdus, and L. Havel, "Application of catalytic reactions on a mercury electrode for electrochemical detection of metallothioneins," Chem. Listy, vol. 98, pp. 166-173, 2004. [115] K. Kasahara, Y. Fujiwara, K. Nishio, T. Ohmori, Y. Sugimoto, K. Komiya, T. Matsuda, and N. Saijo, "Metallothionein content correlates with the sensitivity of human small cell lung cancer lines to cisplatin," Cancer Res., vol. 51, pp. 3237-3242, 1991. [116] M. Studnickova, J. Turanek, H. Zabrsova, M. Krejci, and M. Kysel, "Rat liver metallothioneins are metal dithiolene clusters," J. Electroanal. Chem., vol. 421, pp. 25-37, 1997. [117] D. J. Otvos and I. M. Armitage, "Structure of the metal clusters in rabbit liver metallothinein," Biochemistry, vol. 77, pp. 7094-7098, 1980. [118] R. W. Olafson, "Electrochemical characterization of metallothionein metal mercaptide complexes - Application of cyclic voltammetry to investigation of metalloproteins," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 19, pp. 111-125, 1988. [119] J. H. R. Kägi and Y. Kojima, "Biochemistry of Metallothionein," Experientia. Suppl., vol. 52, pp. 25-61, 1987. [120] D. H. Hamer, "Metallothionein," Annu. Rev. Biochem., vol. 55, pp. 913-951, 1986. [121] Y. Kojima, "Definitions and nomenclature of metallothioneins," Methods Enzymol., vol. 205, pp. 8-10, 1991. 71 [122] A. R. Rodriguez, "Characterisation of mammalian Cd, Zn metallothioneis using differential pulse polarography," in Methallothionein IV, C. Klaassen, Ed. Basel/ Switzerland: Birkhauser Verlag Basel, 1999, pp. 85-91. [123] G. Henze and R. Neeb, Elektrochemische Analytik. Berlin: Springer Verlag, 1986. [124] P. Klouda, Moderni analyticka chemie. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. [125] L. Sommer, Z. Šimek, and P. Voznica, Analyticka chemie II. Brno: Vutium, 2000. [126] J. Wang, Analytical Chemistry. New York: VCH Publishing, 1994. [127] A. J. Bard and L. R. Faulkner, Electrochemical Methods. Fundamentals and Applications. New York: John Willey & Sons, 1980. [128] J. Mindl, Zaklady elektro organicke chemie. Praha: Academmia, 2000. [129] R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, and F. Jelen, "Cyclic voltammetric study of the redox system of glutathione using the disulfide bond reductant tris(2-carboxyethyl)phosphine," Bioelectrochemistry, vol. 63, pp. 19-24, 2004. [130] J. Petrlova, D. Potesil, R. Mikelova, O. Blastik, V. Adam, L. Trnkova, F. Jelen, R. Prusa, J. Kukacka, and R. Kizek, "Attomole voltammetric determination of metallothionein," Electrochim. Acta, vol. in press, 2006. [131] P. Dolezel and V. Kuban, "Mass spectrometric study of platinum complexes based on cisplatin," Chem Pap-Chem. Zvesti, vol. 56, pp. 236-240, 2002. [132] R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, B. Klejdus, and V. Kuban, "Electrochemical biosensors in agricultural and environmental analysis," Chem. Listy, vol. 97, pp. 1003-1006, 2003. [133] X. X. Qian, K. Nagashima, T. Hobo, Y. Y. Guo, and C. Yamaguchi, "High performance liquid chromatography of thiols with differential pulse polarographic detection of the catalytic hydrogen evolutin current," J. Chrom., vol. 515, pp. 257-264, 1990. [134] M. J. May, T. Vernoux, C. Leaver, M. Van Montagu, and D. Inze, "Glutathione homeostasis in plant: implications for environmental sensing and plant development," J. Exp. Bot., vol. 49, pp. 649-667, 1998. [135] V. Brabec, "DNA sensor for the determination of antitumor platinum compounds," Electrochim. Acta, vol. 45, pp. 2929-2932, 2000. [136] M. Strouhal, R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova, and M. Nemec, "Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolytica," Bioelectrochemistry, vol. 60, pp. 29-36, 2003. [137] L. Trnkova, R. Kizek, and J. Vacek, "Catalytic signal of rabbit liver metallothionein on a mercury electrode: combination of derivative chronopotentiometry with adsorptive transfer stripping," Bioelectrochem., vol. 56, pp. 57-61, 2002. [138] I. Sestakova, H. Vodickova, and P. Mader, "Voltammetric methods for speciation of plant metallothioneins," Electroanalysis, vol. 10, pp. 764­770, 1998. [139] R. Kizek, L. Havran, T. Kubicarova, B. Yosypchuk, and M. Heyrovsky, "Voltammetry of two single-stranded isomeric end-labeled -SH deoxyoligonucleotides on mercury electrodes," Talanta, vol. 56, pp. 915-918, 2002. [140] B. H. Cruz, J. M. Diaz-Cruz, I. Sestakova, J. Velek, C. Arino, and M. Esteban, "Differential pulse voltammetric study of the complexation of Cd(II) by the phytochelatin (gamma-Glu-Cys)(2)Gly assisted by multivariate curve resolution," J. Electroanal. Chem., vol. 520, pp. 111-118, 2002. [141] V. Dorcak and I. Sestakova, "Electrochemical behavior of phytochelatins and related peptides at the hanging mercury drop electrode in the presence of cobalt(II) ions," Bioelectrochemistry, vol. 68, pp. 14-21, 2006. [142] V. Adam, J. Zehnalek, J. Petrlova, D. Potesil, B. Sures, L. Trnkova, F. Jelen, J. Vitecek, and R. Kizek, "Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ions biosensor," Sensors, vol. 5, pp. 70-84, 2005. [143] M. Fojta, M. Fojtova, L. Havran, H. Pivonkova, V. Dorcak, and I. Sestakova, "Electrochemical monitoring of phytochelatin accumulation in Nicotiana tabacum cells exposed to sub-cytotoxic and cytotoxic levels of cadmium," Anal. Chim. Acta, vol. 558, pp. 171-178, 2006. 72 [144] G. Scarano and E. Morelli, "Determination of phytochelatins by cathodic stripping voltammetry in presence of copper(II)," Anal. Chim. Acta., vol. 319, pp. 13-18, 1996. [145] B. Yosypchuk, I. Šestakova, and L. Novotny, "Voltammetric determination of phytochelatins using copper solid amalgam electrode," Talanta, vol. 59, pp. 1253-1258, 2003. [146] K. Knauer, B. Ahner, H. B. Xue, and L. Sigg, "Metal and phytochelatin content in phytoplankton from freshwater lakes with different metal concentrations," Environ. Toxicol. Chem., vol. 17, pp. 2444-2452, 1998. [147] E. Palecek, "Adsorptive transfer stripping voltammetry - determination of nanogram quanitities of DNA immobilized at the electrode surface," Anal. Biochem., vol. 170, pp. 421-431, 1988. [148] E. Palecek, "New trends in electrochemical analysis of nucleic acids.," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 20, pp. 171-194, 1988. [149] E. Palecek, "Electrochemical behaviour of biological macromolecules," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 15, pp. 275-295, 1986. [150] E. Palecek, "Probing of DNA structure in cells with osmium tetroxide, 2,2'-bipyridine.," Meth. Enzymol., vol. 212, pp. 305-318, 1992. [151] M. Fojta, L. Havran, S. Billova, P. Kostecka, M. Masarik, and R. Kizek, "Two-surface strategy in electrochemical DNA hybridization assays: Detection of osmium-labeled target DNA at carbon electrodes," Electroanalysis, vol. 15, pp. 431-440, 2003. [152] D. Ozkan, P. Kara, K. Kerman, B. Meric, A. Erdem, F. Jelen, P. E. Nielsen, and M. Ozsoz, " DNA and PNA sensing on mercury and carbon electrodes by using methylene blue as an electrochemical label," Bioelectrochemistry, vol. 58, pp. 119-126, 2002. [153] M. Fojta, L. Havran, J. Fulneckova, and T. Kubicarova, "Adsorptive transfer stripping AC voltammetry of DNA complexes with intercalators," Electroanalysis, vol. 12, pp. 926-934, 2000. [154] M. Heyrovsky, "Early polarographic studies on proteins," Electroanalysis, vol. 16, pp. 1067-1073, 2004. [155] M. Heyrovsky, P. Mader, S. Vavricka, V. Vesela, and M. Fedurco, "The anodic reactions at mercury electrode due to cysteine," J. Electroanal. Chem., vol. 430, pp. 103-117, 1997. [156] S. O. Kelley, N. M. Jackson, M. G. Hill, and J. K. Barton, "Long-range electron transfer through DNA films," Angewandte Chemie-International Edition, vol. 38, pp. 941-945, 1999. [157] A. Tlili, A. Abdelghani, S. Hleli, and M. A. Maaref, "Electrical characterization of a thiol SAM on gold as a first step for the fabrication of an immunosensors based on a quartz crystal microbalance," Sensors, vol. 4, pp. 105-114, 2004. [158] W. R. Fawcett, M. Fedurco, Z. Kovacova, and Z. Borkowska, "Adsorption study of cysteine, N-acetylcystamine, cysteinesulpfinic acid and cysteic acid on a polycrystalline gold electrode," J. Electroanal. Chem., vol. 368, pp. 275-280, 1994. [159] J. H. R. Kagi and A. Schaffer, "Biochemistry of Metallothionein," Biochemistry, vol. 27, pp. 8509-8515, 1988. [160] R. Kizek, L. Trnkova, and E. Palecek, "Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry," Anal. Chem., vol. 73, pp. 4801- 4807, 2001. [161] R. Prusa, O. Blastik, D. Potesil, L. Trnkova, J. Zehnalek, V. Adam, J. Petrlova, F. Jelen, and R. Kizek, "Analytic method for determination of metallothioneins as tumor markers," Clin. Chem., vol. 51, pp. A56-A56, 2005. [162] I. Sestakova, M. Kopanica, L. Havran, and E. Palecek, "Constant current chronopotentiometric stripping analysis of Cd-metallothionein on carbon and mercury electrodes. Comparison with voltammetry," Electroanalysis, vol. 12, pp. 100-104, 2000. [163] M. Dabrio, A. R. Rodriguez, G. Bordin, M. J. Bebianno, M. De Ley, I. Šestakova, M. Vasak, and M. Nordberg, "Recent developments in quantification methods for metallothionein," J. Inorg. Biochem., vol. 88, pp. 123-134, 2002. 73 [164] C. Harlyk, G. Bordin, O. Nieto, and A. R. Rodriguez, "Electrochemical behaviour of a metallothionein related peptide in the presence of cadmium using cyclic voltammetry," J. Electroanal. Chem., vol. 446, pp. 139-150, 1998. [165] C. Harlyk, O. Nieto, G. Bordin, and A. R. Rodriguez, "Electrochemical study of a metallothionein related peptide in the presence of zinc using cyclic voltammetry," J. Electroanal. Chem., vol. 451, pp. 267-272, 1998. [166] C. Harlyk, O. Nieto, G. Bordin, and A. R. Rodriguez, "Electrochemical study of metallothioneins using cyclic voltammetry," J. Electroanal. Chem., vol. 458, pp. 199-208, 1998. [167] V. Adam, J. Petrlova, D. Potesil, J. Zehnalek, B. Sures, L. Trnkova, F. Jelen, and R. Kizek, "Study of metallothionein modified electrode surface behaviour in the presence of heavy metal ions - biosensor," Electroanalysis, vol. 17, pp. 1649-1657, 2005. [168] M. Dabrio and A. R. Rodriguez, "Characterisation of zinc metallothioneins by electroanalytical techniques," Anal. Chim. Acta, vol. 385, pp. 295-306, 1999. [169] M. Dabrio and A. R. Rodriguez, "Electrochemical study of human foetal liver metallothionein: influence of the additions of cadmium and zinc," Anal. Chim. Acta., vol. 406, pp. 171-181, 2000. [170] M. Dabrio and A. R. Rodriguez, "Study of complexing properties of the -metallothionein domain with cadmium and/or zinc, using differential pulse polarography," Anal. Chim. Acta., vol. 424, pp. 77-90, 2000. [171] M. Dabrio and A. R. Rodriguez, "Complexing properties of the beta metallothionein domain with cadmium and/or zinc, studied by differential pulse polarography," Analusis, vol. 28, pp. 370-381, 2000. [172] M. Dabrio and A. R. Rodriguez, "Study of zinc metallothionein from rat liver using electrochemical techniques," Electroanalysis, vol. 12, pp. 1026-1033, 2000. [173] M. Erk and B. Raspor, "Evaluation of cadmium-metallothionein stability constants based on voltammetric measurement," Anal. Chim. Acta., vol. 360, pp. 189-194, 1998. [174] M. Erk and B. Raspor, "Advantages and disadvantages of voltammetric method in studying cadmium-metallothionein interactions," Cell. Mol. Biol., vol. 46, pp. 269-281, 2000. [175] M. Erk, D. Ivanković, B. Raspor, and J. Pavicić, "Evaluation of different purification procedures for the electrochemical quantification of mussel metallothioneins," Talanta, vol. 57, pp. 1211-1218, 2002. [176] D. Ivankovic, J. Pavicic, B. Raspor, I. Falnoga, and T. Tusek-Znidaric, "Comparison of two SH-based methods for estimation of metallothionein level in the digestive gland of naturally occurring mussels, Mytilus galloprovincialis," Int. J. Environ. An. Ch., vol. 83, pp. 219-231, 2003. [177] J. Limson and T. Nyokong, "Voltammetric behavior of cysteine and metallothionein on cobalt(II) tetrasulfonated phthalocyanine modified glassy carbon electrode," Electroanalysis, vol. 9, pp. 255-260, 1996. [178] R. W. Olafson and R. G. Sim, "An electrochemical approach to quantification and characterization of metallothionein," Anal. Biochem., vol. 100, pp. 343-351, 1979. [179] B. Raspor, M. Paić, and M. Erk, "Analysis of metallothioneins by modified Brdicka procedure," Talanta, vol. 55, pp. 109-115, 2001. [180] I. Sestakova and T. Navratil, "Voltammetric methods in metallothionein research," Bioinorg. Chem. Appl., vol. 3, pp. 43-53, 2005. [181] J. Yang, Y. Cao, and M. S. Yang, "Determination of metallothionein content in hepatoma cells by differential cells by differential pulse polarography," Chemico-Biological Inter., vol. 115, pp. 109-116, 1998. [182] M. El Hourch, A. Dudoit, and J. C. Amiard, "An optimization procedure for determination of metallothionein by square wave cathodic stripping voltammetry: application to marine worms," Anal. Bioanal. Chem., vol. 378, pp. 776-781, 2004. [183] M. Esteban, C. Harlyk, and A. R. Rodriguez, "Cadmium binding properties of the C- terminal hexapeptide from mouse metallothionein: study by linear sweep voltammetry and multivariate curve resolution analysis," J. Electroanal. Chem., vol. 468, pp. 202-212, 1999. 74 [184] J. Mendieta, M. S. Diaz-Cruz, A. Monjonell, R. Tauler, and M. Esteban, "Complexation of cadmium by the C-terminal hexapeptide Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala from mouse metallothionein: study by differential pulse polarography and circular dichroism spectroscopy with multivariate curve resolution analysis," Anal. Chim. Acta., vol. 390, pp. 15-25, 1999. [185] G. Scarano and E. Morelli, "Cathodic stripping voltammetric determination of metallothioneins," Electroanalysis, vol. 8, pp. 396-398, 1996. [186] M. Erk and B. Raspor, "Interference of Pb leaching from the pH electrode on Cd- metallothionein complex," Anal. Chim. Acta., vol. 442, pp. 165-170, 2001. [187] M. S. Diaz-Cruz, J. Mendieta, A. Monjonell, R. Tauler, and M. Esteban, "Study of the zinc-binding properties of glutathione by differential pulse polarogryphy and multivariate curve resolution," J. Inorg. Biochem., vol. 70, pp. 91-98, 1998. [188] M. S. Diaz-Cruz, J. Mendieta, R. Tauler, and M. Esteban, "Cadmium-binding properties of glutathione: a chemometrical analysis of voltammetric data," J. Inorg. Biochem., vol. 66, pp. 29-36, 1997. [189] M. S. Diaz-Cruz, J. M. Diaz-Cruz, J. Mendieta, R. Tauler, and M. Esteban, "Soft- and hard-modeling approaches for the determination of stability constants of metal-peptide systems by voltammetry," Anal. Biochem., vol. 279, pp. 189-201, 2000. [190] M. S. Diaz-Cruz, M. Esteban, and A. R. Rodriguez, "Square wave voltammetry data analysis by multivariate curve resolution: application to the mixed-metal system," Anal. Chim. Acta., vol. 428, pp. 285-299, 2001. [191] M. S. Diaz-Cruz, J. Mendieta, and M. Esteban, "Combined use of differential pulse plarography and multivariate curve resolution: as applied to the study of metal mixed comples of the metallohionein related hexapeptide Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala," Electroanalysis, vol. 14, pp. 50-56, 2002. [192] J. Zhang, J. Matthews, L. Ward, and R. Simpson, "Disruption of the disulfide bonds of recombinant murine interleukin-6 induces formation of a partially unfolded state.," Biochemistry, vol. 36, pp. 2380-2389, 1997. [193] S. Mani, M. A. Graham, D. B. Bregman, P. Ivy, and S. G. Chaney, "Oxaliplatin: A review of evolving concepts," Cancer Invest., vol. 20, pp. 246-263, 2002. [194] O. Vrana and V. Brabec, "Electrochemical analysis of antitumor platinum drugs and their complexes with DNA," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 19, pp. 145-160, 1988. [195] O. Vrana, V. Brabec, and V. Kleinwächter, "Polarographic studies on the conformation of some platinum complexes : relations to anti-tumour activity," Anti-Cancer Drugs Design, vol. 1, pp. 95-109, 1986. [196] F. Jelen, M. Tomschik, and E. Palecek, "Adsorptive stripping square-wave voltammetry of DNA," J. Electroanal. Chem., vol. 423, pp. 141-148, 1997. [197] F. Jelen, M. Fojta, and E. Palecek, "Voltammetry of native double-stranded, denatured and degraded DNAs.," J. Electroanal. Chem., vol. 427, pp. 49-56, 1997. [198] M. Studnickova, L. Trnkova, J. Zetek, and Z. Glatz, "Reduction of Guanosine at a Mercury Electrode," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 21, pp. 83-86, 1989. [199] L. Trnkova, M. Studnickova, and E. Palecek, "Electrochemical Behaviour of Guanine and its Derivatives. I. Fast Cyclic Voltammetry.," Bioelectrochem. Bioenerg., vol. 7, pp. 644- 658, 1980. 75