Genetika rostlin
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Struktura rostlinného genomu

Genetická informace rostlinných buněk je obsažena v molekulách DNA, chromozomech, a je součástí tří různých organel; jádra, chloroplastů a mitochondrií. Struktura chromozomů jednotlivých organel se liší. Jádra rostlinných buněk obsahují lineární molekuly DNA, jejichž počet a délka je u jednotlivých rostlinných druhů odlišná (tab. 1.1). Chloroplasty a mitochondrie také obsahují DNA, ale ve formě kružnicových molekul; organely obsahují více kopií genomu.

Druh	Jednoděložné (J) Dvouděložné (D)	Počet chromozomů (n)	Ploidie	Velikost genomu (bp)
Arabidopsis thaliana	D	5	2	1,25x108
Oryza sativa	J	12	2	4,20x108
Brassica oleracea	D	9	2	6,00x108
Lycopersicon esculentum	D	12	2	1,00x109
Brassica napus	D	19	2	1,23x109
Antirrhinum majus	D	8	2	1,54x109
Vicia sativa	D	6	2	1,60x109
Solanum tuberosum	D	12	4	1,80x109
Zea mays	J	10	2	2,70x109
Pisum sativum	D	7	2	4,10x109
Nicotiana tabacum	D	24	4	4,40x109
Hordeum vulgare	J	7	2	4,80x109
Secale cereale	J	7	2	9,50x109
Triticum aestivum	J	21	6	1,60x1010
Fritillaria assyriaca	J	12	2	1,30x1011

Jaderný genom

Velikost celého genomu určitého druhu není závislá na počtu chromozomů. Např. pšenice má v haploidním genomu 21 chromozomů, ale asi 10x více DNA ve srovnání s genomem bramboru, který obsahuje 12 chromozomů. Rozpětí velikostí genomů u vyšších rostlin je uvedeno v tab. 1.1. Široká rozmanitost existuje i u druhů v rámci téhož rodu. Např. Vicia faba má asi 10x větší množství jaderné DNA ve srovnání s blízce příbuzným druhem V. sativa, přestože tyto dva druhy mají stejný počet chromozomů. Obecně lze říci, že rostlinný genom je mnohem větší v porovnání s genomem živočichů. V. faba má téměř 4x větší množství jaderné DNA než je v genomu člověka (3,3 x 10⁹ bp). Arabidopsis thaliana má genom porovnatelný s živočišným modelovým druhem Drosophila melanogaster (1,65 x 10⁸ bp) a velikost genomu kukuřice (2,7 x 10⁹ bp) je srovnatelná s genomem člověka.

Také hodnota C nezreplikovaného haploidního jaderného genomu byla určena u řady kvetoucích rostlin bez ohledu na taxonomickou příbuznost a biologické vlastnosti a rozsah hodnot C je u rostlin velmi široký, od 0,2 pg u A. thaliana po 127,7 pg u Fritillaria assyriaca. Většina druhů má však méně než 10 pg DNA v haploidním genomu.

Jestliže bereme v úvahu druhy blízce příbuzné nebo naopak vzdáleně příbuzné, velikosti jejich genomů nekorelují s biologickou komplexností organizmů nebo s počtem genů (tzv. záhada C-hodnoty DNA). Rozdílnost ve velikosti genomů je spojena s rozdílností v délce intronů, což jsou nekódující sekvence uvnitř genů. Velikost intronů je v korelaci s nekódujícími sekvencemi mimo geny. Velikost intronů může hrát roli i v regulaci genové aktivity prostřednictvím kondenzace chromatinu. Předpokládá se, že všechny rostlinné druhy potřebují k zajištění svých funkcí přibližně stejný počet genů. Průměrná velikost genu bez intronů je 1,3 kb, s introny 4 kb. Nekódující sekvence na 5´ konci genu obvykle obsahují elementy, které mají funkci při regulaci transkripce genů. 3´ konec genu obsahuje elementy pro modifikaci mRNA a pro konec transkripce, ale i další regulační elementy. Určení, kde končí 3´ ohraničující oblast jednoho genu a kde začíná 5´ regulační oblast druhého genu, není jednoduché. Většina DNA rostlin s velkými genomy spadá právě sem a funkce a význam těchto nekódujících sekvencí se stále studují.

Existuje úzká spojitost mezi velikostí genomu a životním cyklem určitého rostlinného druhu. Jednoleté rostliny, především autogamní efemerní druhy, mají malé genomy, zatímco vytrvalé druhy mají genomy větší. To je také spojeno s relativně rychlejším buněčným cyklem u jednoletých druhů ve srovnání s vytrvalými druhy.

Struktura DNA

Dvouřetězcovou jadernou DNA lze působením vyšších teplot denaturovat do dvou jednořetězcových molekul. Za vhodných podmínek může nastat opět komplementární párování mezi jednořetězcovými molekulami. Jestliže všechny ostatní parametry zůstanou zachovány, rychlost párování bude záviset na koncentraci komplementárních sekvencí. Genotyp s repetitivní DNA má frakci s vysokým počtem opakování, která bude hybridizovat rychleji než sekvence, které jsou jedinečné a vyskytují se v genotypu pouze jednou. Taková analýza kinetiky renaturace homologické rostlinné jaderné DNA ukázala, že kromě jedinečných sekvencí (genů) je velká část rostlinného genomu tvořena repetitivními sekvencemi.

Protože průměrná velikost kódované oblasti rostlinného genu je asi 1300 bp, 25 tisíc genů by znamenalo 3,25 x 10⁷ bp jedinečných sekvencí DNA kódujících produkty genů. U Arabidopsis tento předpoklad ponechává určitý minimální prostor pro introny a hraniční regulační oblasti. Avšak u kukuřice se předpokládá, že méně než 1 % genomu tvoří kódující sekvence. Tento hrubý předpoklad se blíží počtu bp, které jsou transkribovány do mRNA u druhu se srovnatelným genomem. U tabáku (Nicotina, 4,40 x 10⁹ bp) jsou pouze 2% genomu transkribována do mRNA. Avšak biochemické analýzy ukazují, že až 40% genomu tabáku je tvořeno jedinečnými sekvencemi DNA. Zřejmě tedy tento genom obsahuje mnoho jedinečných sekvencí, které nejsou transkribovány. U mnoha genomů je skutečně pouze asi 1% transkribováno a translatováno v průběhu buněčného cyklu. Kódující kapacita rostlinných genomů s odlišnou velikostí je přibližně stejná a genomy kódují přibližně stejný počet genů.

V 80. a 90. letech 20. století byla pozornost věnována podstatě jaderné DNA, která je nezbytná pro identifikaci funkcí rostlinných genů. Hlavní frakce nekódujících sekvencí u rostlin jsou repetice DNA; konkrétní druh může mít v genomu 1 tisíc až 40 tisíc různých rodin repeticí. Tyto elementy jsou složeny asi ze 30 různých sekvenčních motivů, které mají délku od 1 bp po více než 10 tisíc bp. Daný motiv může tvořit 5 % ale i 50 % celkové velikosti genomu, jestliže se opakuje v rozsahu 10²krát až 10⁵krát. Existuje pozitivní korelace mezi velikostí genomu a rozsahem repetitivních sekvencí. Repetice jsou v genomu uspořádány jako tandemové nebo rozptýlené. Význam těchto repeticí je spojen s regulační funkcí při rekombinaci, replikaci a transkripci, rDNA je vhodným nástrojem studia evolučních vztahů mezi druhy určitého rodu i mezi druhy různých rodů, jsou vhodným zdrojem genetických markerů využívaných v základním výzkumu i ve šlechtění.

Repetitivní sekvence je možné rozdělit na:

• málo až středně se opakující sekvence,
• vysoce se opakující sekvence.

Větší rostlinné genomy obsahují více repetitivní DNA. Např. Pisum sativum (4,10 x 10⁹ bp) obsahuje až 70 % repetitivní DNA, Vigna radiata s menším genomem (5,00 x 10⁸ bp) má pouze 40% repeticí. Hordeum vulgare má asi 80 % repeticí a Oryza sativa, která má nejmenší genom z obilovin, pouze 50 % a genom Arabidopsis thaliana obsahuje pouze asi 14 % repeticí.

Málo- a středně repetitivní sekvence DNA se opakují maximálně několik tisíckrát a jsou často rozptýleny v chromozomech mezi jednokopiovými sekvencemi. Některé z těchto sekvencí mají známou funkci. Např. histonové geny a geny ribozomální RNA (rRNA) 5,8S, 18S a 28S jsou soustředěny na chromozomu do určitého místa, tzv. organizátoru jadérka. Tyto typy RNA jsou transkribovány jako jediný prekurzor. Jaderný genom Vicia faba má asi 4750 rRNA genů, zatímco V. sativa s menším genomem má jen 1875 těchto genů.

Vysoce repetitivní sekvence DNA jsou obvykle krátké sekvence, které jsou přítomny v 10⁵ až 10⁷ kopiích na genom. Tento typ DNA často souvisí se strukturou chromozomů (např. centromera). Velké úseky vysoce repetitivních sekvencí mohou také souviset s různou formou kondenzace DNA během buněčného cyklu ve srovnání se zbývající částí genomu, což má za následek různou intenzitu barvení těchto oblastí chromozomu (heterochromatin).

Většina repetitivních sekvencí jsou tandemové repetice, včetně sekvencí spojených se strukturami chromozomů jako jsou centromery a telomery, tzv. satelitní DNA, tvořená heterochromatinem a geneticky inaktivní. Zatímco u většiny živočichů a kvasinek je satelitní DNA bohatá na báze A-T, u rostlin je bohatá na báze G-C. Rozptýlené repetice zahrnují transpozony a retrotranspozony.

Centromera

Většina chromozomů eukaryot obsahuje specializovanou oblast tvořenou heterochromatinem – centromeru. Podle její polohy jsou chromozomy klasifikovány na metacentrické, akrocentrické a telocentrické. Tyto primární chromozomové konstrikce jsou důležité při segregaci chromozomů v mitóze a meióze. Během profáze jaderného dělení se vytváří složitá proteinová struktura, tzv. kinetochor. Centromerický chromatin je vysoce kondenzovaný. Centromerická oblast může být 1 Mb např. u A. thaliana nebo více než 100 Mb u pšenice. Opakování repetice asi 180 bp a vysoce heterochromatinový stav naznačuje, že tato struktura je potřebná pro aktivitu centromery. Ačkoli je organizace a uspořádání repetic v oblasti centromery vysoce konzervativní, mezi organismy, dokonce mezi příbuznými druhy, je vysoce variabilní.

Telomera

Konce eukaryotických jaderných chromozomů (telomery), jsou nezbytné pro stabilitu chromozomů a chrání je před strukturními přestavbami a exonukleázovou degradací. U mnoha organizmů včetně rostlin jsou telomery tvořeny krátkými jednoduchými repetitivními sekvencemi DNA s vysoce konzervativními sekvencemi C_n T_m A_n/T_n A_m G_n, kde m = 0 až 1, n = 2 až 4. Například telomery člověka a trypanosom mají telomery tvořeny stejným motivem TTAGGG. Motiv telomer Arabidopsis je TTTAGGG. Připojení těchto repeticí k chromozomové DNA je katalyzováno enzymem terminální telomerovou transferázou (telomerázou). Telomeráza je enzym, který zajišťuje kompletní replikaci chromozomů a kompenzuje tak neúplnou replikaci 5΄-konců chromozomů DNA polymerázou. Je to reverzní transkriptáza, která ke 3΄-konci telomerového G-řetězce přidává další telomerové repetice. Enzym obsahuje RNA molekulu, která je komplementární s 3΄-koncem chromozomové DNA. Telomeráza není schopna prodlužovat tupé konce dvouvláknové DNA, ale jako substrát využívá pouze přesahující jednořetězcové 3΄-konce DNA. Zvláštní forma replikace konců lineárních DNA molekul je nezbytná pro připojení DNA polymerázy a její pohyb po templátu ve směru 3΄ → 5΄. Konce DNA molekul jsou pravděpodobně citlivé k exonukleázám. Nereplikující se telomera tvoří komplex s proteinem, který má ochrannou funkci. Telomery mohou navíc obsahovat další oblast repeticí, která je lokalizována proximálně (blíže k centromeře) od telomerových repeticí. U žita tvoří tato DNA 12 až 18 % genomu.

Mikrosatelity

Mikrosatelity (STR – angl. short tandem repeats nebo SSR – angl. simple sequence repeats) jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících motivů 1 až 6 nukleotidů (např. (A)_n, (AG)_n, (GATA)_n). Jejich celková délka obvykle nepřesahuje 100 bp. Mikrosatelity jsou součástí nekódujících sekvencí genomu. Nejvíce informací o mikrosatelitech bylo získáno z živočišné říše, mnohem méně z říše rostlinné. Nejedná se o nadbytečnou DNA, ale DNA, která se podílí na regulaci rekombinace, replikace a transkripce.

Základní mikrosatelitní motiv bývá zastoupen v různém počtu opakování (n). Podle složení lze mikrosatelity rozdělit na:

• dokonalé,
• nedokonalé,
• složené.

Dokonalý mikrosatelit je tvořen souvislým motivem, např. (AG)₂₄, u nedokonalého mikrosatelitu je základní mikrosatelitní motiv přerušen sledem náhodných bazí. Složený mikrosatelit je tvořen několika různými motivy, např. (AG)₁₄(AT)₃₅. Počet dinukleotidových mikrosatelitů v genomu rostlin je asi desetkrát nižší než v lidském genomu. Odhaduje se, že mikrosatelit delší než 20 bp se v genomu rostlin vyskytuje průměrně na každých 23,3 kb. Nejhojnější jsou dinukleotidové mikrosatelity, nejméně časté jsou mono- a tetranukleotidové mikrosatelity. V rostlinných genomech je nejčastější motiv (AT)_n. Z trinukleotidových opakování jsou v genomu rostlin nejčetnější (AAG/CTT)_n a (AAT/ATT)_n. Oligonukleotidy odvozené od GATA- a GACA- mikrosatelitních motivů jsou jedny z nejčastěji používaných pro otisk DNA rostlinných genomů. Postupné poznávání mikrosatelitních sekvencí vedlo k vyvinutí postupů pro rychlou detekci jejich polymorfizmu. Toho lze využít při genetickém mapování.

Kromě chromozomů, které se pravidelně rozdělují do dceřiných buněk během mitotického a meiotického dělení jádra, se u mnoha rostlinných druhů hlavně z čeledě Poaceae, Liliaceae a Asteraceae, vyskytují tzv. přídatné neboli B chromozomy. Během miózy se tyto chromozomy nepárují s chromozomy základní sady, protože s nimi nejsou homologní, nerekombinují. Segregace těchto chromozomů během jaderného dělení je náhodná, uskutečňuje se mechanizmem non-disjunkce, a jednotlivé rostliny v populaci druhu mají odlišný počet těchto B chromozomů. Dědičnost B chromozomů je tedy nemendelistická. Jsou tvořeny především heterochromatinem a jejich funkce není zcela objasněna. Neobsahují stejný typ genetické informace jako standardní A chromozomy, ale mají fyziologický efekt, jako je např. u žita lepší zdatnost klíčních rostlin ve stresových podmínkách. Větší počet B chromozomů v genomu může negativně ovlivnit fertilitu rostlin. U rostlin byly poprvé identifikovány roku 1982, u kukuřice roku 1986, u žita roku 1993. Pravděpodobně vznikly introdukcí cizorodé DNA.

Rozptýlené repetice

Rozptýlené repetice tvoří významnou část genomu. Kopie jednotlivých repeticí jsou rozptýlené po genomu, nevyskytují se pohromadě. Mnohé z nich jsou transpozony a retrotranspozony, a u rostlin tvoří většinu rozptýlených repetic. Například více než 12 transpozonů odvozených od inaktivního transpozonu se vyskytuje v okolí genu Adh1 u kukuřice.

Metylace DNA

Cytozinová rezidua jaderných chromozomů rostlin jsou silně metylována. V genomu pšenice je asi 30 % všech cytozinových bazí a 82% CpG dinukleotidů metylováno. Pro porovnání v genomu živočichů je metylováno jen 1 až 7 % C bazí. Na rozdíl od živočichů jsou v rostlinném genomu metylovány kromě CpG dinukleotidů také cytoziny v trinukleotidech CpXpG. Inkorporace 5-metylcytozinu do DNA je postreplikační modifikací. V genomu živočichů je méně CpG dinukleotidů než se teoreticky očekává na základě zjišťování obsahu C+G. DNA Arabidopsis má extrémně nízký obsah metylcytozinu; pouze 4,6 % metylcytozinů je metylováno, což je nejnižší obsah známý u rostlin. Metylace DNA u rostlin má za následek modifikaci exprese příslušných genů (epimutace).

Struktura jaderných genů

Genom vyšších rostlin tvoří 25,5 tisíc (Arabidopsis) až 50 tisíc genů. Mnoho genů je přítomno v jediné kopii, ale velká část genů je přítomna jako více- a mnohogenové rodiny, které jsou tvořeny skupinami téměř identických genů v genomu. Základní struktura jaderných genů je obdobná jako u jiných eukaryotických organizmů. Obr. 1.1 ukazuje schematicky strukturu jaderného genu chromozomové DNA, primárního transkriptu (pre-mRNA) a mRNA.

Eukaryotický gen se skládá z několika částí: promotoru, zaváděcí sekvence, kódující sekvence a terminační sekvence. Promotor je místo, na které nasedá RNA-polymeráza. Sekvence promotoru nepodléhá transkripci, avšak rozhoduje o tom, kdy bude docházet k transkripci genu a s jakou intenzitou. Účinnost promotoru silně zvyšuje zesilovač transkripce. Je to regulační oblast, která může sousedit s promotorem, ale většinou bývá od promotoru vzdálená. Zaváděcí sekvence je umístěna za promotorem a je již přepisována do RNA, ale ještě se nepřekládá do struktury polypeptidů. Pak následuje kódující sekvence, která se zpravidla skládá z kódujících úseků (exonů), přerušených nekódujícími úseky (introny). Za ní následuje terminační sekvence, která spolurozhoduje o stabilitě mRNA.

Promotor

Promotor je oblast chromozomu ležící ve směru 5΄ od transkripční oblasti. Je to sekvence DNA, která má schopnost vázat RNA polymerázu, a tím zahajovat přepis genu. Aby mohl promotor plnit svoji regulační funkci, musí mít určitou sekvenční charakteristiku, danou specifickou sekvencí nukleotidů a určitým optimálním poměrem A + T/G + C. Zvláště důležité jsou určité krátké specifické sekvenční úseky (boxy), společné všem promotorům, které byly podle své konvenční sekvence označeny zjednodušeně symboly TATA a CAAT, případně AGGA. Kromě těchto obecně se vyskytujících sekvenčních úseků mají promotory další sekvenční úseky, které rozhodují o specifičnosti transkripce. Všechny tyto důležité sekvenční úseky mají afinitu k regulačním proteinům, které migrují mezi cytoplazmou a jádrem, případně některé se trvale nacházejí v jádře. Tyto regulační proteiny se za určitých podmínek (po své aktivaci) vážou na specifické sekvence promotorů, a tím promotory aktivují (nebo inaktivují). Promotor se obvykle dělí na dva základní úseky. Nejblíže počátku transkripce je tzv. TATA box, který váže specifický protein, jenž sám váže RNA polymerázu II. Tento úsek leží 16 až 54 bp od počátku transkripce. Pak následuje další úsek, předřazená sekvence (sekvence proti směru exprese genu). Jeho významnou doménou je krátký sekvenční úsek CAAT v poloze – 74 bp od počátku transkripce, který však může chybět. Často se na jeho místě nachází sekvenční úsek označovaný AGGA (obr. 1.1).

Zesilovač

Zesilovač (angl. enhancer element) obsahuje krátké sekvenční úseky, jež svou přítomností zesilují projev genu. Krátké sekvence zesilovačů mohou měnit stupeň projevu genů nezávisle na své orientaci a do vzdálenosti až několika kb od počátku transkripce. Např. u sóje zesilovač exprese genu pro zásobní protein conglycinin tvoří sekvence čtyř opakování A(A/G/C)CCA a zesiluje expresi genu asi 25x.

Zaváděcí sekvence

Zaváděcí sekvence je počáteční úsek struktury mRNA o délce několika desítek párů bazí, na níž se uchycují ribozomy a postupují naprázdno až k prvnímu iniciačnímu kodonu.

Sekvence kolem počátku translace, určeného prvním tripletem ATG za promotorem, rozhodují o účinnosti translace a podílejí se tedy na regulaci na úrovni translace. Sekvence počátků translace jsou u jednotlivých genů tzv. genových rodin vysoce konzervativní.

Kódující sekvence

Kódující sekvence rostlinných i ostatních eukaryotických genů (exony) jsou často na jednom nebo více místech přerušeny nekódujícími sekvencemi (introny), které na konci 5΄ začínají dinukleotidem GT a na konci 3΄ končí dinukleotidem AG. Sekvence počátků a konců intronů jsou i v delších úsecích u genových rodin značně konzervativní.

Terminační sekvence

10 až 33 bp před ukončením transkripce je obvykle polyadenylační signál, který má velmi konzervativní konvenční sekvenci AATAAA. Většina rostlinných genů má druhý polyadenylační signál blízko stop-kodonu. Nedaleko ve směru 3΄ od tohoto místa dochází k enzymatickému odstřižení konce molekuly RNA a navázání enzymaticky syntetizovaného úseku polyA (polyadenylace RNA) (obr. 1.2). Doplnění sekvence polyA na 3΄-konci je jedním z klíčových kroků projevu většiny eukaryotických genů, která zvyšuje stabilitu mRNA. Některé geny mají na 3΄-konci terminační sekvenci, kterou je struktura, schopná tvořit na vlákně DNA vlásenku, tedy převrácené opakování komplementárního úseku DNA. Tato struktura vede k ukončení transkripce.

Geny rostlinného genomu

Experimentální práce zabývající se klonováním rostlinných genů obvykle končí sekvenováním genů. Zpravidla jsou pak k dispozici dva typy sekvencí genů: sekvence klonu cDNA odvozeného od mRNA (odpovídající proteinovému produktu genu) a sekvence klonu z genové knihovny. Klon cDNA je komplementární k mRNA. Ten zahrnuje zaváděcí sekvenci, kódující sekvenci a terminační sekvenci. Nukleotidy jsou obvykle značeny od místa počátku translace ve směru 5´- 3´ od jednotky a na opačnou stranu od počátku translace se záporným znaménkem.

Úsek odvozený od klonu genu z genové knihovny je delší o promotorovou sekvenci (která není ve směru 5´přesně ohraničena). Na konci 3´ přesahuje konec transkripce. Kódující sekvence obsahuje nejen sekvenci exonů, ale také intronů. Číslování takového klonu obvykle začíná od počátku translace. V sekvenování se uvádí to vlákno DNA, které svou sekvencí odpovídá mRNA. Opakující se úseky v sekvenci nebo důležité regulační úseky se označují čarou nad sekvencí.

Základní klasifikace genů může být založena na tom, jakým typem RNA-polymerázy jsou geny transkribovány, protože každý z typů má jiné regulační sekvence (promotor, zaváděcí sekvenci, terminátor transkripce). Geny pro rRNA jsou transkribovány RNA-polymerázou I, geny pro tRNA RNA-polymerázou III. Tento typ genů můžeme zahrnout do společné skupiny jako geny složek genetického aparátu. Druhou skupinu tvoří geny kódující proteiny, které jsou transkribovány prostřednictvím RNA-polymerázy II.

Některé geny jsou v genomu jedinečné, jiné se vyskytují v rodinách s 20 až 25 členy. Geny však netvoří tandemové repetice, i když mohou být v genetické vazbě. Jedním příkladem je rodina genů pro zein u kukuřice, které kódují zásobní proteiny semen. Rodinu tvoří dvě podjednotky, každá s přibližně 25 členy. Homologie kódujících oblastí v rámci podjednotky je vysoká (více než 90% identita aminokyselinových sekvencí), ale homologie mezi skupinami je nižší.

Geny kódující 25S – 18S rRNA

Eukaryotické ribozomy obsahují čtyři typy rRNA (Tab. 1.2). Z nich tři, a to a) 25 až 28S, b) 5,8S a c) 5S jsou součástí větší (60S) podjednotky ribozomů a d) 17 – 18S rRNA je součástí menší (40S) podjednotky ribozomů. V rostlinném genomu je genová rodina lokalizována obvykle v jediném bloku haploidního genomu jako mnohokrát se opakující série kopií genového bloku pro 18S – 5,8S – 28S rRNA. Tyto typy RNA jsou transkribovány jako jediný prekurzor, jehož posttranslační úpravou vznikají uvedené tři typy rRNA. Část DNA, na základě které se transkribuje tato prekurzorová rRNA (rDNA) je přítomna v genomu jako blok tandemových sérií s počtem opakování řádově 10³ až 10⁴krát. Nejmenší počet opakování na haploidní genom je 125 kopií u pomerančovníku a nejvyšší 31 900 u hyacintu. Délka segmentu DNA se pohybuje v rozmezí 7 800 až 185 000 bp. Počet opakování je všeobecně asi o jeden řád vyšší než u podobných genových rodin v živočišném genomu. Tuto opakující se jednotku rDNA je možno lokalizovat do určitého chromozomu metodou hybridizace in situ, do tzv. organizátoru jadérka (ang. nucleolar organizer region – NOR).

Genom	Typy rRNA
	Větší podjednotky ribozomů	Menší podjednotky ribozomů
Bakteriální chromozom	23S, 4,5S, 5S	16S
Chloroplastová DNA	23S, 4,5S, 5S	16S
Mitochondriální DNA	23S, 4,5S, 5S	18S
Jaderná DNA rostlin	25–28S, 5,8S, 5S	17S–18S

Počet kopií základní jednotky rDNA se liší nejen mezi taxony, ale i mezi jednotlivými rostlinami. Diference byly dokonce zjištěny i mezi pletivy jedné rostliny. Mezi rostlinami ječmene (Hordeum spontaneum) byly nalezeny až šestinásobné rozdíly a mezi rostlinami bobu (Vicia faba) dokonce stonásobné rozdíly. Pletiva téže rostliny bobu se lišila počtem kopií rDNA až dvanáctinásobně. Příčinou rozdílů je nerovnoměrný somatický crossing-over.

Místo na chromozomu, v němž jsou geny rRNA lokalizovány, se vyznačuje v mitóze zaškrcením (sekundární konstrukce) a současně je v interfázi základem jadérka, které obsahuje rRNA transkribovanou z tohoto úseku. Předpokládá se, že existuje regulační protein, který má afinitu k promotorům genů rRNA. Svou vazbou na promotor působí protein jeho aktivaci. Aktivita genů rRNA je spojena s hypometylací cytosinu v úseku promotoru.

Geny pro 5S rRNA

Geny, které kódují ribozomální 5S rRNA, tvoří samostatnou velkou multigenní rodinu. Jsou lokalizované v tandemové repetici na jiném místě genomu než geny pro úsek 18S – 5,8S – 28S rRNA. Transkripce těchto genů se děje prostřednictvím RNA-polymerázy III. Geny existují v ještě větších tandemových repeticích než předchozí skupina (u lnu až 50 000 kopií). Geny jsou podstatně kratší, celková délka nepřesahuje 500 bp. Rozdíly jsou i ve stupni metylace cytozinu.

Geny tRNA

U rostlin byly popsány jednotlivé geny pro některé tRNA u sóji a fazolu. U sóji bylo zjištěno, že na genom připadá asi 400 genů. Tyto geny jsou v zásadě shodné s geny tRNA u prokaryot a ostatních eukaryot. Ve všech genomech je velký počet různých genů tRNA, které kódují téměř všech 61 smysluplných kodonů. V genomu existuje více typů tRNA s mírně odlišnými primárními sekvencemi, které jsou specifické pro stejný triplet. To jsou izoakceptorové tRNA. Kromě toho téměř všechny typy tRNA jsou kódovány malými genovými rodinami. Každá buňka obsahuje 50 až 100 různých typů tRNA. Délka molekul tRNA kolísá v rozmezí 79 až 90 nukleotidů. Geny tRNA jsou transkribovány jako prekurzorové molekuly, které jsou o něco delší než konečná délka tRNA. Transkripce začíná u purinového nukleotidu, obvykle méně než 10 nukleotidů ve směru 5´ před sekvencí upravené tRNA a končí u sekvence oligo T, která bývá v krátké vzdálenosti ve směru 3´ za délkou upravené tRNA. Úpravy obstarávají specifické nukleázy. Pak následuje přidání terminální sekvence CCA a modifikace specifických bazí.

Geny pro tRNA jsou v genomu obvykle uspořádány rozptýleně, ale jsou známy i tandemové repetice. Jen asi 10 až 20 % genů pro tRNA obsahuje introny, které jsou obvykle extrémně krátké (8 až 60 bp). Nejvýznamnějším rysem genů pro tRNA je, že jejich promotory jsou součástí vlastní sekvence tRNA. V přepisované sekvenci jsou dva promotorové úseky: jeden blízko konce 5´, obvykle začínající asi mezi 8. až 12. nukleotidem, druhý poblíž konce 3´ s počátkem v poloze asi 53 až 62. Pro úsek blízký konci 5´existuje tato konsensus sekvence: 5´ T Pu Pu N N A Pu Py G 3´. Účinek promotorů je modulován úseky DNA přilehlými ke kódující sekvenci. Ty jsou bohaté na páry bazí A a T a obsahují domény, které snižují, a jiné, které aktivují expresi genů tRNA. Geny pro tRNA jsou transkribovány působením RNA-polymerázy III. Jsou schopny tvořit s RNA-polymerázou III stabilní transkripční komplexy, které přetrvávají mnoho cyklů transkripce. Je charakteristický výskyt neaktivních pseudogenů. Jde o nepřesnou kopii strukturního genu, která vznikla pravděpodobně nepřesnou duplikací nebo mutací, kterou se původně aktivní gen v genové rodině inaktivoval.

Většina typů tRNA byla odvozena ze společného genu. Specifičnost genu pro tRNA může být změněna in vitro pouhou změnou několika nukleotidů. Značný konzervativní charakter existuje také mezi prokaryotickými a eukaryotickými tRNA. Gen, který kóduje tRNA pro tyrozin v genomu Arabidopsis, vykazuje vysoký stupeň homologie s mitochondriálním genem fenylalaninové tRNA u kukuřice.

Geny pro histony

Histony jsou proteiny, které jsou hlavní komponentou chromatinových proteinů. Pět genů pro histony je uspořádáno v repeticích s opakováním 10 až 600krát. Kódující oblast genů pro histony je vysoce konzervativní dokonce u různých druhů, ale jejich organizace v rámci repetice je odlišná. Během fáze S buněčného cyklu se obsah histonů zdvojnásobí a tyto histony jsou součástí nově replikované DNA.

Geny kódující proteiny

Geny zásobních proteinů semen a hlíz

Zásobní proteiny semen jsou syntetizovány v poměrně krátkém období několika týdnů po oplození vaječné buňky. V této době v buňkách vyvíjejících se děloh, případně endospermu zrajících semen, mRNA těchto genů tvoří velkou až převažující frakci typů mRNA v pletivech vyvíjejících se semen. To je optimální situace pro izolaci mRNA pro zásobní proteiny semen, konstrukci kopií cDNA reverzní transkripcí a ke klonování ve vektorových plazmidech E. coli.

Studium těchto genů má významnou praktickou aplikaci. U obilovin tvoří zásobní proteiny semen asi 10% sušiny endospermu obilek, u čeledě Fabaceae je obsah proteinů semen 20 až 40 % a u některých rostlinných druhů obsah zásobních proteinů semen činí až 50 % sušiny. Nutriční hodnota zásobních proteinů semen je značně snížena tím, že tyto proteiny nejsou plnohodnotné. Zásobní proteiny obilovin jsou chudé na lysin a threonin, případně lysin a tryptofan (u kukuřice) a zásobní proteiny luskovin jsou chudé na methionin a cystein.

Zásobní proteiny semen se dělí na tyto typy:

• Albuminy rozpustné ve vodě,
• Globuliny rozpustné v 5% solném roztoku,
• Prolaminy rozpustné v 70% alkoholu,
• Gluteliny rozpustné ve slabých kyselinách a hydroxidech.

Albuminy se vyskytují jako minoritní frakce v semenech téměř všech rostlinných druhů. Globuliny tvoří podstatnou část zásobních proteinů semen u čeledě Fabaceae, ale vyskytují se i v zásobních proteinech mnoha jiných čeledí. Prolaminy se vyskytují především v semenech obilovin. Jejich název je odvozen od toho, že obsahují velký podíl prolinu a glutaminu. Všeobecně obsahují velmi málo lysinu, threoninu a tryptofanu. Gluteliny se vyskytují rovněž především u obilovin.

Zásobní proteiny semen musí být po své syntéze v buňkách zásobních pletiv uloženy v nerozpustné formě. Jsou ukládány v proteinových tělíscích, což jsou modifikované vakuoly. Pro transport do proteinových tělísek mají zásobní proteiny specifický signální peptid. Rostlinný genom obsahuje tyto geny pro zásobní proteiny:

• Geny pro zeiny,
• Geny pro leguminy,
• Geny pro viciliny,
• Geny zásobních proteinů brazilského ořechu.

Dalšími skupinami genů s významnými funkcemi u rostlin jsou:

• Geny pro leghemoglobiny,
• Geny pro enzymy fotosyntézy,
• Geny pro stresové proteiny.

Geny pro zeiny

Geny pro zásobní proteiny kukuřice zeiny byly první rostlinné geny studované metodami genového inženýrství. Zeiny jsou směs prolaminů, z nichž nejhojnější mají Mr 22 kD a 19 kD, ale jsou i zeiny s Mr 15 kD a velmi malou frakci tvoří zeiny s Mr 10kD. Přes rozdíly molekulové hmotnosti je struktura proteinů a jejich primární pořadí aminokyselin u všech typů v zásadě shodná. V genomu kukuřice je asi 25 až 30 genů kódujících zeiny 22 kD, a stejný počet genů pro zeiny 19kD, dále 2 až 3 kopie genů pro zeiny 15kD a 1 až 23 kopie genů pro zeiny 10 kD. Jednotlivé geny každé skupiny se nepatrně liší svými sekvencemi, vykazují mikroheterogenitu. Podstatně se liší i intenzita jejich transkripce. Jen malý počet genů v každé skupině je transkribován intenzivně a některé geny jsou přepisovány poměrně vzácně nebo nejsou přepisovány vůbec.

Geny pro zeiny se vyskytují v genomu kukuřice v tandemových repeticích, lokalizovaných na třech místech genomu: na krátkém rameni chromozomu 7, na krátkém rameni chromozomu 4 a na chromozomu 10. Geny pro zeiny obsahují krátké sekvenční úseky promotorů obvyklé u promotorů jiných rostlinných genů: úsek TATA v poloze asi –35 a úsek AGGA v poloze asi –70. Některé geny pro zeiny však jsou zvláštní tím, že mají dva promotory, P1 a P2. Promotor P1 leží 900–100 bp před promotorem P2 ve směru 5´ a a promotor P2 leží 40–60 bp před počátkem kódující sekvence. Kódující sekvence genů pro zeiny nemají žádný intron. Na konci 3´ jsou dva polyadenylační úseky AATAAA.

K aktivaci genů pro zeiny dochází výhradně v průběhu vývoje obilek zcela specificky: specifická mRNA pro zeiny se objevuje v době 10 až 15 dnů po opylení, s maximem 35 dnů po opylení. K vysokému stupni exprese genů pro zeiny v této době přispívá i zvýšení obsahu DNA v jádrech endospermu. Obsah DNA v jádrech pak tvoří až dvěstěnásobek základní jednotkové hodnoty obsahu DNA (C) v haploidním jádře ve fázi buněčného cyklu G₁ na rozdíl od očekávaného trojnásobku. Nedochází však k selektivní amplifikci genů pro zeiny.

Geny pro leguminy

Základní formou zásobních proteinů luskovin jsou globuliny. Existují dva typy globulinů, které se vyskytují nejen u čeledě Fabaceae. První typ, který je podle základního proteinu nazván vicilinový, má sedimentační konstantu 7S a druhý typ, leguminový, má sedimentační konstantu 11S. Každá proteinová molekula leguminového typu je složena ze dvou tříd podjednotek: acidické α a bázické β, které jsou spojeny do dimeru a molekuly leguminu se skládají ze šesti takovýchto dimerů. Podjednotka α u hrachu má Mr asi 40 kD a podjednotka β asi 20 kD, které obsahují kovalentně vázanou jednu acidickou a jednu bázickou podjednotku. K úpravě dochází při průchodu membránou do proteinového tělíska. V místě spojení obou úseků nedochází k úpravě, ale k prostému zlomu. Prekurzor leguminů obsahuje krátký signální peptid, který umožňuje jeho transport do proteinových tělísek. Obě podjednotky jsou kodovány jedním genem. Geny pro leguminy tvoří malou genovou rodinu. K expresi genů dochází výhradně ve vyvíjejících se semenech. Geny byly opakovaně klonovány a sekvenovány.

Existují dva základní typy leguminů: A a B. Oba byly definovány na základě diferencí prekurzorového polypeptidu určených translací in vitro. Liší se také obsahem nedostatkové aminokyseliny methioninu. Typ A obsahuje více methioninu, typ B méně nebo žádný. U jednoho z klonovaných genů pro legumin B Vicia faba má kódující sekvence délku 1649 bp, zaváděcí sekvence 57 bp a na konci 3´ jsou 4 signální místa pro polyadenylaci. Gen kóduje pre-polypeptid, který má délku 484 aminokyselin a zahrnuje signální peptid délky 22 aminokyselin. Kyselý hydrofilní řetězec má 281 aminokyselin a bázický, poněkud hydrofobní řetězec má délku 181 aminokyselin. Oba úseky na sebe navazují. Každý z obou úseků je přerušen krátkým intronem. Introny mají délky 95 bp a 100 bp. Introny mají vyšší obsah A + T (76 %) než exony (53 %). Gen pro leguminy A sóji a hrachu mají introny ve stejných polohách, ale kromě toho mají ještě třetí intron. Byly také porovnávány promotorové sekvence na konci 5´a bylo zjištěno, že v poloze asi 100 nukleotidů od počátku transkripce mají všechny tři geny konzervativní sekvenci, která má délku nejméně 28 bp a byla nazvána leguminový box. Ten pravděpodobně podmiňuje specifičnost exprese ve vyvíjejících se semenech. Geny pro legumin tvoří malé genové rodiny s počtem méně než 10 genů na haploidní genom.

Geny pro viciliny

Druhou hlavní frakcí zásobních proteinů semen hrachu a vikve jsou viciliny. Jsou v semenech přítomny v množstvích, která odpovídají 25 až 75 % váhového množství leguminů. Viciliny mají molekulovou hmotnost 180 až 200 kD. Skládají se ze tří podjednotek, samostatných polypetidových řetězců, které mají u hrachu hmotnost 48, 50 a 72 kD a jsou kódovány třemi různými geny. U vicilinů dochází ke dvěma typům modifikací: 1. kotranslační modifikaci (odstranění signálních polypetidů o Mr menší než 1 kD při transportu do proteinových tělísek) a 2. posttranslační modifikaci, kdy dochází k narušení (nicking) polypeptidových řetězců a k jejich glykozylaci. Geny pro viciliny mají 5 intronů a jsou kódovány malou rodinou genů.

Geny zásobních proteinů brazilského ořechu

Paraořech (Bertholetia excelsa) obsahuje v pletivech endospermu zásobní proteiny zvláště bohaté na aminokyseliny obsahující síru, methionin a cystein. Ty jsou nedostatkové u luskovin. Uvedené aminokyseliny činí 8,3 až 9,1 % hmotnosti zásobních proteinů. Geny se tedy zdály výhodné pro vnášení do genomu luskovin. Paraořechy jsou však u některých lidí silně alergenní a tento protein patří k proteinům, které mohou způsobovat alergické reakce. Proto gen pro transgenozi u kulturních druhů nelze využít. Klonovaný gen pro zásobní protein je velmi zajímavý. Kódující sekvence má pouze 231 bp. Gen tedy kóduje polypeptid, který má 77 aminokyselin. Z nich je 14x zastoupen methionin a 6x cystein. Gen má značnou sekvenční homologii s jedním z genů pro zásobní proteiny semen skočce (Ricinus communis) a s jiným z řepky olejné.

Lektiny

Rostlinné lektiny (aglutininy) jsou proteiny, které mají alespoň jednu nekatalytickou doménu, kterou se specificky váží k určitému mono- nebo oligosacharidu. Jsou to obecně rostlinné obranné proteiny. Různé typy lektinů mohou mít antivirové, antibakteriální, antihoubové, antiinsekticidní nebo antifeedantní účinky. Některé typy lektinů také působí specificky toxicky pro vyšší živočichy a některé jsou toxické pro všechna eukaryota. Jsou známy např. náhodné otravy lidí syrovými nebo nedostatečně uvařenými fazolemi. Lektin se váže na střevní buňky a dochází k jeho endocytóze. Pak způsobuje zvýšenou metabolickou aktivitu a to vede k hypoplazii buněk tenkého střeva. Podobné účinky má také lektin akátu a bezu černého. Tyto stromy také nikdy nejsou poškozovány hlodavci a spárkatou zvěří. Některé lektiny působí zvětšení pankreasu a další toxické vlivy.

Lektiny se vyskytují především v semenech, ale na rozdíl od zásobních proteinů semen, mohou se vyskytovat také v jiných částech rostlin. Lektiny kořenů leguminózních rostlin se například účastní interakce rostlinných buněk s buňkami bakterií fixujících dusík.

Lektiny jsou kódovány všeobecně malými genovými rodinami. Tyto malé genové rodiny mají obvykle aktivní i neaktivní geny. U hrachu je například aktivní jen jeden ze čtyř genů, přítomných v genomu.

Lektiny se dělí na:

1. Merolektiny: váží se jen na jeden glycid. Nemají schopnost aglutinovat buňky.>
2. Hololektiny: váží se také výhradně na glycidy, ale mají dvě nebo více vazebných domén, takže mohou podmiňovat aglutinaci.
3. Chimérolektiny: fúzní proteiny, které mají karbohydrát vazebnou doménu kombinovanou s enzymaticku doménou (např. chitinázovou). Chovají se jako merolektiny nebo hololektiny, podle toho, kolik mají domén, nebo jsou schopny vázat glykoproteiny. Například typ 2 RIP je schopen štěpit chloroplastové proteiny.
4. Lektiny typu 2 RIP: Jsou to lektiny, které mají kromě domény, vážící se na karbohydráty ještě další doménu, která má přesně definovanou enzymatickou aktivitu. Typ 2 RIP má dokonce 2 domény, které se vážou na glykoproteiny. Lektiny typu 2 RIP jsou silně cytotoxické. Jejich řetězec B se váže na glykokonjugátový receptor na buněčném povrchu a dostává se dovnitř buněk. Řetězec A katalyticky inaktivuje ribozómy tím, že štěpí n-glykozidickou vazbu na velké rRNA. Tento protein je vysoce toxický pro všechna eukaryota.

Tento lektin obsahuje např. Ricinus communis – ricin. Lektin je toxický pro houby, ne pro bakterie, ale překvapivě podmiňuje také odolnost k rostlinným virům.

Z hlediska perspektiv přenosu genů do kulturních rostlin, geny pro lektiny jsou skupinou, se kterou je třeba zacházet velmi obezřetně. Některé lektiny totiž mohou být toxické i pro obratlovce (viz lektin sněženky – Gallanthus nivalis lektin GA-lektin nebo ricin).

Geny pro leghemoglobiny

Leghemoglobiny jsou proteiny, které se vyskytují v kořenových hlízkách leguminóz, které fixují vzdušný dusík v symbióze s bakterií rodu Rhizobium. Mají zde dvojí funkci: snižují hladinu volného kyslíku, čímž chrání enzym nitrogenázu katalyzující tvorbu amoniaku ze vzdušného dusíku. Enzym je poškozován již nízkými hladinami kyslíku. Fungují také jako přenašeči kyslíku k místům jeho terminálních akceptorů při dýchání.

Leghemoglobiny jsou tvořeny monomerními polypeptidy. Apoproteinovou složku kóduje rostlina, zatímco hemová složka je determinována genem rizobakterií. Leghemoglobiny jsou proteiny růžové až červené barvy. Tvoří až 30 % rozpustných proteinů kořenových hlízek a jsou lokalizovány v cytoplazmě buněk a způsobují tak načervenalé zbarvení hlízek. Při tvorbě kořenových hlízek jsou leghemoglobiny syntetizovány dříve než nitrogenáza, ale další zvyšování aktivity nitrogenázy je v korelaci se syntézou leghemoglobinů. Exprese genů pro leghemoglobiny v kořenových hlízkách je podmíněna nejen rostlinným genomem, ale i genomem rizobakterií. Primární regulace syntézy leghemoglobinů je na úrovni transkripce. Leghemoglobiny jsou kódovány malou genovou rodinou, která obsahuje také pseudogeny.

Struktura genů pro leghemoglobiny má mnoho společného se strukturou živočišných genů pro globiny. Živočišné globinové geny, které se účastní tvorby krevního barviva, mají jen dva introny, zatímco rostlinné geny pro leghemoglobiny mají tři introny. Lokalizace intronů v živočišných genech pro globiny odpovídá s přesností na nukleotid lokalizaci prvního a třetího intronu leghemoglobinových genů.

Globiny jsou v přírodě všeobecně rozšířeny. Zahrnují tetramerní hemoglobiny vyšších vertebrát, monomerní hemoglobiny prochordát, různé další globiny bezobratlých a dimerní globiny v kořenových pletivech neleguminózních rostlin fixujících dusík. Sekvenční shoda živočišných a rostlinných genů pro globiny se původně vysvětlovala tím, že došlo k přenesení živočišného genu do rostlin prostřednictvím neznámého vektoru. Dnes však převažuje názor, podle něhož geny pro globiny jsou přítomny již v rané fylogenezi u primitivních eukaryont a v průběhu fylogeneze se uchovaly, protože mají v rostlinách obecnou funkci. Leghemoglobinové geny byly podrobně studovány zejména u sóji a fazolu. V poslední době je věnována velká pozornost struktuře leghemoglobinových genů tropické rostliny Sesbania rostrata, která tvoří hlízky fixující vzdušný dusík nejen na kořenech, ale i na nadzemních částech rostliny. Projev leghemoglobinových genů u druhu S. rostrata je tedy odlišný od specifičnosti projevu odpovídajících genů u sóji. Příčinu těchto odlišností je třeba hledat ve struktuře promotorů. Při analýze sekvencí bází dvou leghemoglobinových genů S. rostrata a jednoho genu sóji byla shledána sekvenční podobnost od počátku translace až k poloze –240, ale dále byly již sekvence odlišné. Významné promotorové sekvenční úseky TATA a CAAT mají u různých leghemoglobinových genů shodnou polohu, obvyklou i u jiných rostlinných genů. Počátek transkripce v poloze –48 a druhý, méně často využívaný v poloze –44 jsou zvláštností leghemoglobinových genů. Analýza promotorů ukázala přítomnost několika významných krátkých sekvenčních úseků DNA, které se podílejí na regulaci leghemoglobinových genů. Byl zjištěn sekvenční úsek 16 bp, s konsenzus sekvencí NTNAATNNTTTATTTN, který se v úseku promotoru vyskytuje 3x. V buněčných jádrech buněk vyvíjejících se kořenových hlízek se podařilo prokázat protein, který pravděpodobně funguje jako transkripční faktor. To znamená, že se specificky váže na uvedený úsek DNA. Jedná se o regulační protein a jeho Mr je 50 kD. V promotorové oblasti –195 až –157 genu kódujícího leghemoglobin u S. rostrata byly zjištěny dva krátké sekvenční úseky AAAGAT a CTCTT, které jsou vysoce konzervativní u promotorů rostlinných genů, jež se projevují specificky v kořenových hlízkách.

Geny pro enzymy fotosyntézy

Přestože fotosyntéza probíhá v chloroplastech, celá řada enzymů tohoto procesu je kódována jaderným genomem. K translaci dochází v cytoplasmě a pak jsou proteiny transportovány do chloroplastů. Při transportu dochází k jejich posttranslační úpravě, odštěpení transportního proteinu při průchodu membránou chloroplastů.

Jaderné geny pro enzymy fotosyntézy tvoří malé genové rodiny. Některé z těchto genů patří k nejlépe prostudovaným rostlinným genům z hlediska primární struktury. První závažný výsledek, který byl při studiu fotosyntézy na úrovni genů získán, je zjištění, že celá řada proteinů chloroplastů, účastnících se při fotosyntéze, se skládá z podjednotek, které jsou kódovány chloroplastovou DNA, a jiných, kódovaných jadernými geny. Nejvýznamnějším výsledkem studia genových rodin enzymů fotosyntézy je poznání regulace aktivity genů. Bylo umožněno nejen porovnáním sekvencí bází úseků promotorů, ale také pokusy, v nichž byly různým způsobem modifikované klonované geny přenášeny do jiných genomů.

Geny pro menší podjednotky enzymu Rubisco

Enzym ribulóza-1,5-bisfosfátkarboxyláza/oxygenáza (Rubisco, rbc, RuBPC) je výchozí enzym fotosyntetické redukce CO₂ a fotorespirační oxidace uhlíku. Katalyzuje karboxylaci a hydrolytické štěpení ribulóza-1,5-bisfosfátu na dvě molekuly 3-fosfoglycerátu. Uplatňuje se jak v Calvinově cyklu, tak v C4 fotosyntetickém cyklu, který je aktivní v buňkách pochev cévních svazků. Také u rostlin s fotosyntetickým cyklem C3 je tento enzym pletivově specifický. Vyskytuje se především v listech, méně v ostatních zelených pletivech, ale nevyskytuje se v kořenech, pokud nejsou zelené. Aktivní enzym se skládá z osmi jednotek a každá jednotka je složena ze dvou podjednotek: menší, která je kódována jaderným genomem (gen rbcS) a má velikost asi 14 kD a větší, která má velikost 53 kD a je kódována chloroplastovým genomem (gen rbcL). Uspořádání aktivního enzymu z podjednotek se uskutečňuje v chloroplastech. Prekurzor menší podjednotky má velikost 20 kD a má signální (transportní) část o Mr asi 8 kD, která se odděluje posttranslační úpravou při aktivním transportu do chloroplastů. Tohoto procesu se účastní ATP.

Geny pro menší podjednotku jsou přítomny v genomu jako multigenní rodina, obvykle o 6 až 12 členech. Geny mají jeden, dva nebo tři introny. Aktivita genů pro menší podjednotku je regulována světlem. Uplatňují se přitom na světlo reagující signální proteiny, fytochromy. Ty nepůsobí přímo jako regulační proteiny na promotory, ale jejich působení je zprostředkováno dalšími proteiny. Velikost úseku promotoru, který ovlivňuje expresi při regulaci světlem i orgánovou specifičností v plné intenzitě, je asi 1 kb. Promotor obsahuje proximální krátké specifické sekvenční úseky a distální zesilovače. Aktivita jednotlivých genů genové rodiny se mění v různých pletivech a během vývoje rostliny. Část genů existuje v tandemových repeticích a část je jich na dalších místech genomu jednotlivě. Například u rajčete se genová rodina skládá z pěti genů, z nichž dva existují izolovaně na různých místech genomu a tři tvoří tandemovou repetici, jejíž délka na chromozómu činí 10 kb. Srovnání sekvencí bází DNA pro rbcS z různých genomů ukázalo vysoký stupeň homologie mezi kódujícími i regulačními sekvencemi všech genů. Geny mají tři, dva nebo jeden intron a poloha intronů je u různých genů stálá.

Geny pro menší i větší podjednotku enzymu byly nalezeny také u některých bakterií a sinic. Původně byly geny pro menší a větší podjednotku na DNA řazeny tandemově. Toto seřazení genů, kde gen pro větší podjednotku (rbcL) sousedí ve směru 3´ s genem pro menší podjednotku (rbcS) a oba dohromady tvoří operon. Tato organizace existuje také u sinic. V průběhu evoluce byly geny pro menší podjednotku enzymu (rbcS) přeneseny do jádra a genové produkty pak mohly získat jiné funkce. Především to bylo připojení transportního peptidu pro transport do chloroplastů. Musely vzniknou i nové regulační signály ke koordinaci genů větší a menší podjednotky. To obstarává působení fytochromů.

Dalšími geny podílejícími se svými produkty exprese na fotosyntéze jsou geny pro proteiny světlosběrných komplexů (CAB – angl. chlorophyll a/b binding proteins) fotosystému II a fotosystému I. Geny pro všechny typy proteinů CAB jsou kódovány malými genovými rodinami, které se obvykle skládají z 7 až 16 členů. Další komponentou jsou geny pro fosfoenolpyruvátkarboxylázu.

Geny pro stresové proteiny

Existuje několik skupin stresových proteinů kódovaných geny, jejichž promotory jsou aktivovány při různých typech stresů. Většina těchto genů je přítomna v genových rodinách, ale některé jsou zastoupeny jen dvakrát, popř. v jsou jedinečné. Podle typu stresového faktoru, můžeme geny rozdělit na následující typy:

• Geny proteinů aktivovaných patogeny,
• Geny proteinů aktivovaných nízkými teplotami,
• Geny proteinů tepelného šoku,
• Geny proteinů aktivovaných nedostatkem kyslíku při zaplavení,
• Geny proteinů aktivovaných poraněním.

Regulace genové exprese

Naskýtá se otázka, jak vznikají rozdíly mezi různými typy buněk, když každé jádro mnohobuněčného organizmu obsahuje kompletní genetickou informaci (totipotence). Odpověď je jednoduchá; ne všechny geny jsou stále aktivní ve všech buňkách. Exprese genů je regulována vývojovými signály a signály z prostředí, které jsou detekovány regulačními oblastmi genů a podle toho dochází k aktivaci nebo supresi exprese genů.

Exprese genů rostlin a syntéza enzymů a bílkovin je regulována v několika různých stupních:

1. konformace chromatinu,
2. kontrola transkripce,
3. kontrola úprav transkriptu a transport,
4. stabilita mRNA,
5. kontrola translace,
6. kontrola posttranslačních procesů, jako je fosforylace proteinů,
7. transport bílkovin.

Budou popsány elementy DNA regulující transkripci RNA a diskutováno, jak geny detekují a odpovídají na signály aktivující transkripci.

Orgánově a buněčně specifická regulace

Buňky, které jsou součástí jednotlivých pletiv a orgánů, mají aktivovány různé skupiny genů pro regulační proteiny (trans-aktivační faktory). Ty působí na soubor genů a genových rodin se společnými krátkými promotorovými sekvenčními úseky. Orgánově specifickou regulaci genových aktivit nelze oddělit od ontogeneze rostliny. Velké skupiny genů, které jsou aktivní během embryonálního vývoje a raných fází vývoje semen, jsou zapínány a vypínány současně a s pokračujícím vývojem se jejich aktivace mění. Stejné rozdíly jsou i mezi orgány, pletivy orgánů a buňkami pletiv a spektrum právě aktivovaných genů se mění v průběhu vývoje rostliny. Současně se mění kvalita i kvantita regulačních signálů i stupeň odpovědi na tyto signály.

Polyzómy všech rostlinných orgánů transkribují tisíce až desetitisíce typů mRNA; část je společných, ale každý orgán má specifické jinde se nevyskytující typy mRNA. Například u embryí bavlníku se transkribuje asi 30 tisíc různých sekvencí mRNA.

Dobře charakterizovaný gen kukuřice, který má důležitou funkci v determinaci průběhu buněčného dělení, je Knotted1 (Kn1). Tento gen je nezbytný při zachování meristému výhonu a dochází-li k jeho expresi v listech, kde je normálně inaktivní, stimuluje proliferaci cévních buněk, které tvoří „hrbolky“ pletiva, protože buňky se dělí mimo plochu listu. Toto abnormální buněčné dělení se vyskytuje poté, co proliferace buněčného dělení by se měla zastavit u čepele plně diferencovaného listu. Knotted1 je označován za dominantní nebo aktivační mutaci (angl. gain of function), protože fenotyp vzniká na základě exprese genu spíše než na základě ztráty exprese. Geny podobné tomuto byly identifikovány i u jiných druhů – KNAT1 u Arabidopsis, a vždy mají funkci v morfologii a vývoji listů.

Vnitřními signály genové regulace jsou rostlinné hormony – auxiny, cytokininy, gibereliny, kyselina abscisová (ABA) a etylén, které působí na regulaci různých genů rostlinného genomu přímo na úrovni transkripce, ale současně i na dalších úrovních. Toto působení se děje modifikačním vlivem na regulační proteiny. Auxiny regulují buněčné dělení, prodlužování a diferenciaci buněk. Byla pozorována jak pozitivní tak negativní regulace auxinem. Cytokininy působí na mnoha úrovních. Aktivují buněčné dělení, stimulují růst buněk, snižují apikální dominanci rostliny, oddalují stárnutí buněk, aktivují chloroplastový aparát, způsobují otevření průduchů, mají ochranný vliv vůči nepříznivým faktorům prostředí. Gibereliny výrazně ovlivňují růst rostlin, významně se uplatňují při regulaci klíčení semen a kvetení. Klasickým příkladem vlivu giberelinů na transkripční úrovni je indukce aktivity amyláz v počátečních fázích klíčení obilek ječmene. Kyselina abscisová reguluje mnoho významných vývojových procesů jako je vývoj a klíčení semen, funkci průduchů, odpověď rostliny na vodní deficit. Je antagonistou giberelinu. ABA inhibuje předčasné klíčení semen, ale stimuluje normální embryogenezi. Etylén ovlivňuje klíčení semen, růst klíčních rostlin, odpověď na poranění a jiná stresová působení a také zrání plodů.

Regulace podněty z prostředí

Vnější prostředí rostliny vysílá směrem k rostlině řadu podnětů, které fungují jako signály pro aktivaci transkripce genů. Takovými hlavními podněty jsou světlo, délka dne, denní (cirkadiální) rytmy, patogeni, poranění a jiné stresy, které se často překrývají. Například sucho způsobuje stres vlivem nedostatku vody pro kořeny a indukuje aktivaci genů pro syntézu rostlinného hormonu ABA. ABA potom iniciuje kaskádu procesů končících ztrátou iontů z ochranných buněk, tím zavírání průduchů s cílem minimální transpirace a ztráty vody.

Regulační elementy promotoru

Většina regulačních elementů genů je umístěna proti směru (5´) transkripce, jako promotor. Regulační elementy umístěné na stejném řetězci DNA jako kódující oblast genu, se nazývají cis-elementy. Je to především TATA box, který je u většiny eukaryotických genů, v pozici -30 (tj. 30 nukleotidů od začátku transkripce). Vedle něj je lokalizován další cis-element – CAAT box. TATA je místem vazby RNA polymerázy II. Inducibilní geny obvykle obsahují TATA box a alespoň dva další cis elementy, které mají významnou funkci v konečných fázích přenosu signálu z prostředí.

Regulační elementy jsou často i dále od TATA boxu proti směru transkripce, i ve směru transkripce, v netranslatované oblasti a dokonce i v intronech. Tyto elementy obvykle fungují jako zesilovače a přispívají k efektivnosti RNA polymerázy II při aktivaci transkripce genu.

Sekvence zesilovače často tvoří stovky bp a mohou obsahovat kazety repetic, z nichž každá může fungovat nezávisle jako cis-element. Zesilovače mohou fungovat v obou směrech i ve značné vzdálenosti od kódující oblasti genu. Působí-li jako cis-elementy, musí být na stejném řetězci DNA jako oblast genu, který ovlivňují. Zesilovače mohou také regulovat specificitu exprese, kdy je určitý gen exprimován jen v určitém pletivu nebo orgánu. Tato funkce je zachována i v případě, že je zesilovač odstraněn z obvyklého místa a umístěn v jiném genu, kde aktivuje tkáňově specifickou expresi nového hostitelského genu. Strukturálně podobné umlčovače fungují proti regulaci exprese genu.

Zesilovače je možné v rostlinném genomu identifikovat prostřednictvím systému pasti na zesilovače, který souvisí s aktivitou transpozonů. Ac element je modifikován, takže nedochází k jeho transpozici, a kódující sekvence transponázy jsou pod kontrolou promotoru 35S CaMV. Jde tedy o Ds element obsahující bezpromotorový gen pro β-glukuronidázu (GUS). Jestliže se konstrukt Ds/GUS transponuje před promotor v blízkosti vhodného zesilovače, buňka exprimuje enzym GUS, což lze detekovat kalorimetricky.

Rostlinné geny s podobnou funkcí mají elementy promotoru podobné. Například řada genů aktivovaných signály z vnějšího prostředí má konzervativní cis-element nazývaný G-box (5´-TCCACGTGGC-3´), který rozpoznává tento typ signálů. Deleční a mutační analýzy promotorů citlivých ke světlu, UV záření, ABA, kumarové kyselině (fenolická látka), chladu a dehydrataci ukazují, že změna G-boxu ovlivňuje schopnost promotoru reagovat na konkrétní signál. Významným rysem všech těchto promotorů je nezbytná přítomnost ještě jednoho cis-elementu kromě G-boxu, aby transkripce genu byla dostatečná. Jeden z nich je ABA-responzivní element ABRE v promotorech několika genů, které jsou aktivovány ABA. Mutační a deleční analýza s promotory obsahujícími ABRE element ukazuje, že ačkoli je G-box nezbytný pro funkci genů s ABRE elementem, přítomnost G-boxu není dostačující pro rozpoznání signálu zprostředkovaného ABA. G-box asi plní funkcí při vazbě nějakého obecného transkripčního faktoru, který funguje v kombinaci se specifickými regulačními proteiny při aktivaci RNA polymerázy II.

Transkripční faktory

Cis-elementy promotorů fungují ve spojitosti s proteiny (transkripční faktory, trans-elementy), které se vážou na DNA, a umožňují navázání RNA polymerázy II. Transkripční faktory mají alespoň dvě domény; jedna funguje při rozpoznání a navázání k cis-elementu a druhá při vazbě s dalšími proteiny, které se účastní aktivace transkripce. Transkripční faktory jsou kódovány rodinami genů vždy pro populaci příbuzných proteinů.

Transkripce genů je řízena multifaktoriálním nukleoproteinovým transkripčním komplexem. Modelová situace je uvedena na obr. 1.2. Aktivita RNA polymerázy II vyžaduje spolupráci řady základních transkripčních faktorů, bílkovin, které se vážou na TATA box (TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH) spolu s TATA vazebným proteinem (TFIID). Kromě toho je do transkripce RNA polymerázou II zahrnut specifický transkripční faktor (aktivátor), který se váže na distální promotorové elementy. Tyto transkripční faktory určují typ exprese určitého genu.

Protein	Druh	Motiv	Regulační funkce	DNA-vazebné místo
Cl	Zea mays	Myb	Syntéza antokyanu	–
P	Zea mays	Myb	Syntéza antokyanu	–
Kn1	Zea mays	Homeo-doména	Vývoj listů	–
DEFA	Antirrhinum majus	SRF	Vývoj květů	–
AG	Arabidopsis thaliana	SRF	Vývoj květů	–
Gl1	Arabidopsis thaliana	Myb	Vývoj trichomů	–
TGA1b	Nicotiana tabacum	bZIP	Histonové geny	TGACGT
HBP-1a	Triticum aestivum	bZIP	Histonové geny	ACGTA
EmBP-1	Triticum aestivum	bZIP	Indukce ABA	GTACGTGG
GT-1	Nicotiana tabacum	–	Regulace světlem	GTGTGGTTAATATG

Sekvence distálních promotorových elementů byla identifikována u řady genů:

Box leguminu TCCATAGCCATGCAAGCTGCAGAATGTC determinuje regulaci genů pro tvorbu leguminu během vývoje semen.

1. Element ABRE (angl. abscisic acid-responsive element) CGAGCAGGC byl zjištěn v promotorových oblastech několika genů, které jsou regulovány rostlinným hormonem kyselinou abscisovou.
2. Element LRE (angl. light-responsive element) s boxem GATAAG, s boxem II – GTGTGGTTAATATG a boxem III – ATCATTTTCACT byl zjištěn u některých genů kódujících fotosyntézu, které jsou regulovány světlem.
3. Element ARE (angl. anaerobic responsive element)

Specializované transkripční faktory, které se mohou vázat na distální promotorové elementy, byly izolovány u některých rostlinných druhů. Byl klonován transkripční faktor EmBP-1 pšenice. Interaguje specificky s elementem ABRE. Některé transkripční faktory a vazebná místa promotorů jsou uvedena v tab. 1.3.

Proteiny s homeodoménami jsou kódovány geny s tzv. homeoboxy, což jsou sekvence dlouhé 180 bp. Tyto proteiny fungují jako transkripční faktory při regulaci různých vývojových stadií rostlin a specifitě mnoha orgánů a pletiv. Geny s homeoboxy byly poprvé identifikovány u Drosophila. Mutace těchto genů mají za následek značné vývojové defekty, jako je tvorba jiných orgánů. U kukuřice jsou takovými geny Knotted1 a ZMH1/ZMH2. Knotted1 byl prvním takovým genem identifikovaným u rostlin.

Funkce chromatinu

Hlavním kritériem pro aktivní transkripci genu RNA polymerázou II je dostupnost DNA, která je naopak determinována konformací chromatinu.

Histony pomáhají regulovat transkripci prostřednictvím stupně kondenzace DNA. Specifické enzymy jako je histonová acetyl transferáza mohou modifikovat histony a tak inhibovat kondenzaci a tím vytvořit oblast genomu přístupnou pro transkripční faktory. Odstranění acetylových skupin z histonů prostřednictvím deacetylázy zvyšuje kompaktnost chromatinu a způsobuje, že geny jsou méně přístupné pro RNA polymerázu.

Genomy vyšších eukaryot jsou pravděpodobně organizovány do smyčkových domén chromatinu prostřednictvím připojení k jaderné síti (angl. scaffold). Smyčky, které jsou v rozsahu 5 až 200 kb, jsou zde připojeny v místech MAR (angl. matrix attachment region). MAR jsou bohaté na motiv DNA AT a jsou dlouhé 200 až 1000 bp. MAR plní funkci ve strukturní organizaci genomu a mohou usnadňovat transkripci genů nebo skupin genů prostřednictvím tvorby méně kondenzované struktury chromatinu. Chromatinové vlákno je k oblasti MAR připojeno proteinem MAR. Oblasti MAR obklopují kódující oblasti genů a často jsou spojeny s regulačními elementy. MAR byly charakterizovány u genů sóje, tabáku, hrachu a kukuřice. Také gen pro β-fazeolin u fazolu je ohraničen takovou sekvencí MAR na 5´ konci a při transkripci funguje společně se zesilovačem genu. Také bylo zjištěno, že tato oblast genu má zvýšenou citlivost k DNáze I.

Epigenetické mechanizmy genové regulace

Exprese genů může být ovlivněna epigenetickými změnami v genomu, které jsou dědičné a reverzibilní.

• Imprinting
• Paramutace
• Kosuprese
• Metylace

Transpozony

Transpozony jsou sekvence DNA, které mají schopnost měnit svoji lokalizaci v genomu transpozicí, kterou umožňují produkty genů, které jsou součástí daného nebo příbuzného elementu. Transpozony mohou být rychle a poměrně stabilně fixovány v populaci, přestože snižují zdatnost rostlin a mají mutagenní účinek.

Podobně jako u jiných eukaryot, také u rostlin byly objeveny transpozony. Transpozony tak odlišných organizmů jako je Drosophila, kvasinky a kukuřice mají značně konzervativní způsob transpozice. Vlastnímu objevu transpozonů předcházely neobvyklé výsledky hybridizačních analýz u kukuřice. V roce 1938 analyzoval Marcus Rhoades neobvyklé výsledky po samosprášení mexické kukuřice. Linie, která se vyznačovala zbarvenými obilkami, dala po samosprášení rostliny se zbarvenými, skvrnitými a bezbarvými obilkami v palici v modifikovaném mendelovském dihybridním štěpném poměru 12 : 3 : 1. Analýza ukázala, že se jednalo o mutace ve dvou genech, genu pro zbarvení (tvorba pigmentu) A₁/a₁ a genu podmiňujícího skvrnitost Dt/dt. Formální genetické vysvětlení tohoto štěpného poměru bylo založeno na tom, že původní linie byla genotypu A₁A₁ dt dt a mutacemi se změnila na dihybridní A₁a₁ Dt dt, kde alela A₁ podmiňuje zbarvení obilek a alela Dt skvrnitost. Barevné skvrny se však mohou fenotypově projevit pouze na pozadí jinak nezbarvených obilek. Po samosprášení dihybridního genotypu vzniklo potomstvo: 9/16 A₁- Dt- a 3/16 A₁- dt dt se zbarvenými obilkami, 3/16 a₁a₁ Dt- se skvrnitými obilkami a 1/16 a₁a₁ dt dt s obilkami bezbarvými.

Rhoades předpokládal, že skvrnitost by mohla být zapříčiněna reverzními mutacemi alely a₁ na A₁ v somatických buňkách, avšak velký počet skvrn na obilkách by zároveň znamenal extrémně vysokou rychlost reverze. Různým křížením nakonec prokázal, že alela a₁ je opravdu nestabilní mutantní alelou, u které s vysokou četností dochází k reverzním mutacím. Tato nestabilita je však závislá na přítomnosti alely Dt jiného nevázaného genu.

Podobné pokusy u kukuřice prováděla v padesátých letech i Barbara McClintock, jejíž výsledky vedly k objevu transpozonů u kukuřice.

B. McClintock (nar. v r. 1902) se zabývala v laboratořích Cold Spring Harbor v USA cytogenetikou kukuřice. Prováděla velká množství křížení, při kterých zjistila i projevy různé genetické nestability. V těchto případech zjistila chromozomové zlomy a tvorbu skvrn v somatickém pletivu kukuřičného zrna. Tyto své výsledky zveřejnila v roce 1951 formou přednášky a poté v r. 1953 je publikovala. Avšak její genetické analýze jevu, který, jak dnes víme, byl podmíněn chováním transpozonů, bylo obtížné porozumět, a proto se její práce nesetkala s odezvou ve vědecké komunitě (dostala pouze dvě žádosti o separát své publikace z r. 1953). McClintock objevila autonomní a neautonomní transpozony u kukuřice (slovo transpozice použila poprvé v r. 1949). Našla genetický faktor Ds (disociátor), který podmiňuje vysokou náchylnost k chromozomovým zlomům v místě, kde se nachází. Tyto zlomy mohou být lokalizovány buď cytologicky nebo geneticky (obr. 1.3). Navíc se zjistilo, že tato nestabilita je závislá na přítomnosti nevázaného genu Ac (aktivátoru), podobně jako nestabilita a₁ byla závislá na přítomnosti Dt.

Když se McClintock pokusila lokalizovat gen Ac na chromozom, zjistila, že to není možné, neboť se u rostlin téže linie nacházel v různých místech. Také lokus Dt měnil svou polohu na rameni chromozomu, jak se zjistilo podle exprese různých recesivních fenotypů projevujících pseudodominanci (obr. 1.3). Na základě dalších pokusů bylo zjištěno, že se u kukuřice vyskytují mobilní elementy, které se mohou přemísťovat v jaderném genomu a způsobovat nestabilní mutace genu, do nichž se začlení. Její práce byla přijata až za deset let, kdy byly transpozony objeveny u bakterií.

Teprve molekulární analýza potvrdila pozorování a vysvětlení tohoto jevu a třicet let po publikování svých výsledků dostala B. McClintock za svou práci Nobelovu cenu (1983).

Obecná charakteristika transpozonů

Transpozony či mobilní elementy jsou části DNA, které se mohou přemísťovat (transponovat) v jaderném genomu.

U kukuřice bylo nalezeno několik systémů podobných a₁/Dt a Ds/Ac. Jejich působení je obdobné – mají cílový gen, který je inaktivován inzercí nějakého receptorového elementu do jeho struktury, a samotný regulátorový gen udržující mutační nestabilitu. Například mobilní element Ds se může začlenit do genu waxy, který podmiňuje charakter endospermu (škrobový či voskový) a způsobit za přítomnosti Ac jeho nestabilitu. Uvedené příklady jsou příkladem neautonomního transpozonu, který pro svou transpozici vyžaduje přítomnost jiného mobilního elementu v genomu. Autonomní transpozony se naopak mohou přemísťovat v genomu nezávisle na jakémkoli jiném elementu.

Transpozony často způsobují inzerční mutace tím, že se začlení do funkčních genů a poruší tak jejich integritu. Následné vyčlenění transpozonu z mutantního genu (a tedy obnova funkce genu) způsobí somatické reverzní mutace v příslušných buňkách. Tyto mutace se často projeví jako skvrnitost nebo variegace barvy nebo struktury pletiva, které vzniklo dělením buněk, v nichž byl příslušný gen aktivován. Na rozdíl od variegace způsobené virovými chorobami, chimérickým stavem nebo chloroplastovými mutacemi, jeví mutace způsobené transpozony mendelistickou dědičnost.

Struktura mobilních elementů Ac a Ds kukuřice

Element Ac je dlouhý 4563 bp s koncovými 11 bp dlouhými obrácenými repeticemi. Transpozon kóduje transkript o 3,5 kb a výsledný protein s 807 aminokyselinami s transponázovou aktivitou. Gen pro transponázu je rozdělen na exony, jak ukazuje schematický obrázek 1.4. V genomu je přítomna vždy jedna jeho kopie. Při větším počtu kopií by docházelo k jejich vzájemné inaktivaci. Elementů Ds může být až 10 kopií v genomu.

Struktura Ds elementů vykazuje rozsáhlou homologii s Ac; tyto elementy jsou však kratší a zjevně vznikly delecí vnitřní části čtecího rámce Ac. Poněvadž Ds elementy nemají úplný čtecí rámec, nemohou produkovat aktivní transponázu, a proto se nemohou samy autonomně transponovat. Mobilizace jejich transpozice je možná pouze za přítomnosti transponázy produkované elementy Ac. Ne všechny elementy Ds kukuřice vykazují deleci ve srovnání s Ac. Byly nalezeny i jiné s velmi malou homologií s Ac, např. Ds2 nebo Ds5933. Celkem bylo identifikováno asi 20 členů rodiny Ds.

U kukuřice byly popsány i další systémy působení mobilních elementů a jejich struktura, například systém En/Spm (angl. enhancer/supresor mutator).

Strukturně podobný jako Ac je mobilní element Tam3 objevený u hledíku (Antirrhinum majus); má však 12 bp dlouhé invertované repetice a obsahuje čtecí rámec bez intronů. Produkovaný protein vykazuje asi 60% identitu aminokyselin s transponázou Ac. Oba srovnávané elementy mají 8 bp dlouhé cílové místo pro včlenění do DNA. Srovnání Tam1 hledíku s Spm kukuřice odhalil téměř identickou sekvenci terminálních repetic i exonů obou elementů. Tyto elementy při začleňování do DNA vytváří 3 bp dlouhé duplikace. Při sekvenování DNA se podle těchto duplikací odhalí místo, ve kterém byl transpozon začleněn. Duplikace a neúplné duplikace jsou způsobeny při transpozici nepřesným štěpením DNA a tvorbou jednovláknových zlomů působením transponázy. V místech transpozice tak dojde k posunutí o určitý počet nukleotidů (3 až 12). Při reparačním procesu je struktura rostlinné DNA uzavřena dosyntetizováním jednovláknových úseků a ligací obou konců vláken DNA.

Transpozice elementů Tam je silně ovlivňována prostředím. Při množení rostlin hledíku při 15ºC se frekvence transpozice zvyšuje až 1000krát ve srovnání s množením při 25ºC. Transpozony se začleňují do genů pallida a nivea, které podmiňují syntézu antokyanu. Inaktivace těchto genů se projeví fenotypově různě pigmentovanými a skvrnitými květy.

Při klonování genu Rugosus (R/r) Pisum sativum byla identifikována duplikace dlouhá 12 bp, která je homologní s terminálními sekvencemi elementu Ac kukuřice. Svědčí to o minulé přítomnosti transpozonu. Gen tvoří enzym SBEI (angl. starch branching enzyme) zodpovědný za větvení molekuly škrobu. Při inaktivaci genu transpozicí dochází k akumulaci sacharózy, zvýšení obsahu vody a změnám v osmotickém tlaku. Při zrání semen genotypu rr tato ztrácí více vody než semena genotypu R- a v důsledku toho se vytváří charakteristický svraštělý fenotyp.

Transpozonové mutace (transpozon tagging)

Sekvence transpozonů lze využít jako sondy při klonování transpozonů stejného typu a izolaci mutantních genů.

Mobilní element Ac, který byl nalezen u jednoděložné rostliny, je schopen transpozice i do genomu různých dvouděložných druhů rostlin (heterologní transpozice) jako je Arabidopsis, tabák, rajče, sója nebo brambor. To otevřelo možnost použít tyto elementy pro získávání nových mutací. Byly navrženy postupy efektivního vyhledávání a izolace inzerčních transpozonových mutací. Schéma tohoto postupu je na obr. 1.5. Element Ds a stabilizovaný element Ac (sAc) byly vneseny zvlášť do genomu jednotlivých rostlin standardního typu. Tyto rostliny se následně mezi sebou kříží. Poněvadž rostliny F₁ obsahují oba typy elementů, bude Ds mobilizován transponázou produkovanou elementem Ac. Mobilizovaný Ds se může náhodně začlenit do příslušného žádoucího genu (Ph) za vzniku inzerční mutace Ph::Ds. Vznikne-li začleněním elementu mutace recesivního typu, je možno ji detekovat křížením F₁ s rostlinami homozygotně recesivními pro tento gen (ph ph). Většina potomstva z tohoto křížení bude heterozygotní (Ph ph) a standardního fenotypu, avšak budou zde i rostliny, které zdědily od jedinců F₁ alelu s transpozonem a ty budou mutantní, genotypu Ph::Ds ph.

Jinou možností indukce transpozonové inzerční mutace je využití autonomního elementu Ac. Ten je součástí konstruktu vytvořeného z T-DNA Agrobacterium tumefaciens (v zaváděcí sekvenci markerového genu pod řízením promotu 35S). Po transformaci rostlin tímto konstruktem může dojít k excizi Ac a aktivaci markerového genu. Expresi tohoto genu je možné detekovat jen v určitých pletivech, tedy v potomstvech buněk, u nichž došlo k excizi. Po excizi se může Ac začlenit do sousedního genu a způsobit jeho inaktivaci.

Retrotranspozony

U vyšších rostlin, jako například u Arabidopsis nebo Nicotiana, byly objeveny částice strukturálně podobné retrovirům a byly nazvané retrotranspozony. Jsou to úseky DNA schopné vkládat své vlastní kopie do nových pozic v genomu. Jsou virového původu a jako retroviry mají gen kódující reverzní transkriptázu, která umožňuje přepis RNA (vzniká transkripcí retrotranspozonu) do komplementární DNA. Tato DNA je přesnou kopií původního retrotranspozonu a je vložena do nového místa v genomu (retropozice). Přímým důsledkem transpozice retrotranspozonů je zvyšování jejich počtu. Genom kukuřice je jimi tvořen až z 50%. V oblasti genu Adh1 je několik kopií retrotranspozonu Opie. U bobu představují elementy typu Ty1-copia kolem 40 % genomu. Konkrétní retrotranspozon se může vyskytovat i v několika desítkách kopií, například Tnt1 se vyskytuje v genomu tabáku v několika stovkách kopií. V genomu ječmene je přítomen element bis1, který tvoří několik procent celkové genomové DNA.

Délka retroelementů je v rozmezí 1 až 13 kb. Těmto rostlinným retrotranspozonům však chybí sekvence homologní s oblastí env kódující strukturální bílkovinu plášťového obalu, která je nezbytná pro pohyb mezi buňkami. To znamená, že retrotranspozony nemohou tvořit částice podobné virům. Strukturní podobnost mezi retroviry a retrotranspozony je pravděpodobně výrazem jejich evoluční příbuznosti. Pro retroelementy jsou typické sekvence: gen gag kódující strukturální protein, gen prot (proteáza), gen pro reverzní transkriptázu, RNázu H a integrázu. V současné době se studuje jejich schopnost retropozice do různých rostlinných genomů. Podobně jako transpozony mohou sloužit jako nástroje k cílenému vnášení požadovaných genů do různých genomů, jsou zdrojem rozmanitosti vlivem své schopnosti inaktivace genu po svém začlenění retropozicí.

Retrotranspozon kukuřice Mu (Mutátor) transponuje tak často, že dochází až k 50krát vyšší četnosti mutací než v genomu bez tohoto elementu a mutace jsou většinou nestabilní. V genomu se vyskytuje 20 až 40 kopií. Při křížení kukuřice s Mu1 s kukuřicí bez něj, dojde k retropozici Mu1 a integraci do nových míst genomu, přičemž počet kopií se doplní na původní počet. V hostitelském genomu tvoří Mu 9 bp dlouhou repetici. Od konce 70. let minulého století, kdy byl Mu objeven, byla pomocí něho získána u kukuřice řada mutací.

Další elementy kódující transponázy

První skupina obsahuje elementy s charakteristickou obrácenou terminální sekvencí, které se pohybují po chromozomu prostřednictvím mnohonásobných zlomů a ligací. Jsou to např. elementy TphI u petúnie a TagI u huseníčku. K transpozici dochází převážně do genů na témže chromozomu.

Byly identifikovány dvě další rodiny mobilních elementů této skupiny. Alespoň u některých druhů rostlin se vyskytují ve velkém počtu kopií. Elementy trav Tourist se často vyskytují u kukuřice (přibližně na každých 30 kb genomu) ve více než 10 tisících kopiích. Element Stowaway je široce rozšířen u jednoděložných i dvouděložných druhů. Jsou malé, mají konzervativní terminální obrácenou repetici a začleňují se do sekvencí TA.

Mimojaderná DNA

Jedním z hlavních rysů eukaryotických buněk, ve srovnání s prokaryotickými, je přítomnost různých vnitrobuněčných organel. Organely jako jsou mitochondrie a chloroplasty mají svůj původ v symbióze s primitivními buňkami a na rozdíl od dalších organel mají vlastní genetickou informaci. Během evoluce eukaryot byla řada jejich genů přenesena do jaderných genomů. Dlouhé úseky organelové DNA byly přeneseny do jaderných chromozomů až později během evoluce. Tyto sektory jsou snadno detekovatelné prostřednictvím hybridizace s klonovanou chloroplastovou DNA. Důsledkem původu plastidů a mitochondrií jsou shodné znaky s prokaryotickými organizmy, jako je např. organizace jejich genomů do operonů nebo charakter ribozomální RNA.

Existence chloroplastové a mitochondriální DNA byla objevena před 40 lety a výzkum směřuje ke studiu struktury a funkce těchto genomů. Funkce genů jednotlivých organel je silně regulována jadernými geny a dochází ke koordinaci exprese jaderných, chloroplastových a mitochondriálních genů. Některé sekvence jaderné, chloroplastové a mitochondriální DNA jsou homologní. To dokazuje existenci mechanizmů, které umožňují přenos (výměnu) genetického materiálu mezi organelami. Dědičnost organel a tím i jejich genomů je u vyšších rostlin většinou uniparentální.

Chloroplastová DNA

Chloroplasty jsou organely, které se diferencují na světle z cytoplazmatických organel nazvaných proplastidy přítomných v meristematických buňkách. Chloroplasty jsou 5 až 10 μm velké čočkovité struktury obklopené dvojitou membránou. Buňky listového mezofylu obsahují až 100 chloroplastů.

Dvojitá membrána chloroplastu obklopuje vlastní tělo chloroplastu, které obsahuje enzymy pro fixaci oxidu uhličitého, biosyntézu aminokyselin a metabolizmus lipidů. Uvnitř těla je systém thylakoid, který obsahuje proteiny pro světelnou reakci fotosyntézy. Chloroplasty jsou organely, které mají schopnost množit se a obsahují mnoho kopií dvouřetězcového kružnicového chromozomu, který je tvořen DNA. Jednotlivé buňky se liší počtem jeho kopií v každém chloroplastu. Buňky mezofylu mladých listů jich obsahují až 100, zatímco chloroplasty starých listů mají jen 20 až 30 kopií. Počet kopií chloroplastového chromozomu v jednotlivých buňkách listu se tak pohybuje kolem 500 až 10 000 a tvoří 10 až 20 % DNA přítomné v buňkách listů.

Chloroplastové chromozomy se nacházejí uvnitř těla chloroplastu a některými rysy své struktury se podobají prokaryotickým chromozomům. Jsou to kružnicové molekuly DNA, které na rozdíl od jaderných chromozomů netvoří komplex s histony. Replikace chloroplastové DNA (cpDNA) a její distribuce mezi dceřinými proplastidy je komplexním procesem. U většiny rostlin je cpDNA dlouhá 120 až 160 kb. Celý chloroplastový chromozom druhů A. thaliana, Nicotiana tabacum, Marchantia polymorpha (porostnice mnohotvárná), ale i Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Pinus thumbergii, Spinacia oleracea, Medicago truncatula a Lotus japonicus byl již sekvenován. Jsou známy kompletní sekvence chloroplastových geonomů více nez 100 druhů rostlin.

Chromozom tvoří obvykle čtyři segmenty: velká a malá oblast s jednokopiovými geny, a dvě kopie invertovaných repetic, které tyto dvě oblasti oddělují. Chloroplastové genomy byly klasifikovány do tří typů. První skupinu tvoří čeleď Pinaceae a leguminózy (včetně hrachu a fazolu), které mají chloroplastové chromozomy bez obrácené repetice. Chloroplastové chromozomy ostatních vyšších rostlin mají velkou (6 až 76 kb) obrácenou repetici. Do třetí skupiny patří řasa Euglena gracilis s pěti tandemovými repeticemi.

Organizace chloroplastového genomu

Chloroplastové genomy obsahují 120 až 140 genů. Poznatky o těchto genech byly získány genetickou analýzou, studiem syntézy proteinů u izolovaných chloroplastů, RNA-DNA hybridizací (která umožnila identifikovat některé geny pro rRNA a tRNA) a klonováním společně se sekvenační analýzou. Další geny kódují některé proteiny ribozomů, podjednotky RNA polymerázy a některé procesy fotosyntézy.

Syntéza proteinů

Chloroplastový genom obsahuje většinu genetické informace pro syntézu chloroplastem kódovaných proteinů a 4 geny rRNA, které jsou součástí velké obrácené repetice (u druhů s touto obrácenou repeticí). Další geny determinující chloroplastové proteiny zahrnují geny pro ribozomové proteiny, geny asi pro 30 tRNA a geny pro RNA polymerázu a elongační faktory.

Syntéza chloroplastových proteinů má podobný mechanizmus jako u prokaryot. Chloroplastové ribozomy (70S) jsou menší než eukaryotické cytoplazmatické ribozomy (80S) a na rozdíl od nich jsou inhibovány antibiotikem chloramfenikolem. V tab. 1.4 jsou uvedeny rRNA chloroplastových ribozomů kukuřice. Molekuly 23S a 16S jsou podobné ekvivalentním molekulám prokaryotických ribozomů. Molekula 5S je přítomna ve všech ribozomech kromě ribozomů hub a živočichů, ale molekula 4,5S rRNA se vyskytuje pouze u chloroplastů. Chloroplastové ribozomy obsahují asi 60 různých proteinů a asi jedna třetina z nich je pravděpodobně kódována chloroplastovou DNA. Podobné uspořádání genů chloroplastového operonu rpl23 tabáku a homologních genů spc a α operonu E. coli S10 naznačuje, že geny E. coli a tabáku mohou pocházet od společného předka.

Introny

Chloroplastové ribozomové geny tabáku rpl2 a rpl16 obsahují intron stejně jako několik dalších chloroplastových genů. Většina těchto genů obsahuje jediný intron. Ne všechny chloroplastové genomy mají stejnou strukturu.

U chloroplastových genomů byl zjištěn způsob trans sestřihu stejně jako u mitochondrií (kap. Mitochondriální DNA).

Podjednotka	rRNA	Počet nukleotidů	Poznámka
Velká podjednotka	23S	2860	Podobné prokaryotickým ribozomům
	5S	122	U všech ribozomů kromě mitochondrií hub a živočichů
Malá podjednotka	4,5S	95	Pouze u chloroplastů vyšších rostlin
	16S	1450	Podobné prokaryotickým ribozomům

Dědičnost chloroplastových genů

Chloroplasty se dědí po mateřské linii, nemohou tedy být přenášeny samčími gametami. Tento způsob dědičnosti byl poprvé dokázán roku 1909 Corrensem u Mirabilis jalapa. Odrůda albomaculata tohoto druhu má žlutobílé skvrny. Rostliny obsahují dva typy chloroplastů; normální zelené chloroplasty, které obsahují chlorofyl, a chloroplasty, které jsou v důsledku mutace v chloroplastovém genu bezbarvé. Buňky listových primordií obsahují směs těchto dvou typů chloroplastů. Příležitostně mohou být výhony tvořeny meristematickými buňkami, které neobsahují chlorofyl, takže celý výhon je žlutobílý. Naopak jsou zde i výhony vzniklé z meristematických buněk obsahujících pouze normální chloroplasty, takže tyto výhony jsou zelené.

Květy těchto jednobarevných výhonů lze využít při kontrolních kříženích ke studiu dědičnosti zbarvení listů a tedy i typu chloroplastů. Z různých kombinací křížení vznikne potomstvo vždy pouze jednoho typu, a to mateřského rodiče (tzv. maternální dědičnost). Fenotyp výhonů nesoucí květy, které byly použity jako zdroj pylu, se u potomstva neprojeví. Tato chloroplastová mutace je letální a žlutobílé klíční rostliny se dále nevyvíjejí.

Replikace cpDNA

Každý chloroplast obsahuje mnoho kopií jednoho chromozomu, často až 150. Vysoký počet molekul DNA v chloroplastech odráží vysoké nároky na expresi proteinů aktivních při fotosyntéze. Podstatně menší množství molekul DNA bylo zjištěno v amyloplastech a dalších nefotosyntetizujících plastidech. Poznání replikace cpDNA není úplné, ale je známo, že replikace DNA v organelách je většinou nezávislá na replikaci DNA v jádře. Replikace DNA je regulována četností iniciace replikace DNA, buď v synchronizaci s buněčným cyklem u rychle se dělících buněk, nebo mechanizmem nezávislým na buněčném cyklu během diferenciace buněk.

Mechanizmy replikace cpDNA jsou podobné mechanizmům replikace u E. coli. V dlouhé obrácené repetici je lokalizován začátek replikace a místa specifická pro rekombinaci. U tabáku začíná replikace ve specifickém počátku replikace blízko genu pro 16S rRNA. U hrachu, i když nemá obrácenou repetici, je počátek replikace také blízko genu pro rRNA. Plastidové genomy mohou obsahovat ještě další replikační začátky než ty spojené s rRNA operonem.

Všechny enzymy a regulační proteiny nezbytné pro replikaci cpDNA jsou kódovány jaderným genomem. V plastidech rostlin byly detekovány specifické enzymy jako jsou DNA polymerázy, primázy, topoizomerázy a helikázy. Jejich funkce v procesu replikace se studuje.

Kontrola exprese chloroplastových genů

Kontrola transkripce

Studium promotorů šesti chloroplastových genů odhalilo podobné motivy jako u promotorů E. coli. Jsou to pozice kolem nukleotidu -35 (konvenční sekvence TTGACA) a pozice kolem nukleotidu -10 (konvenční sekvence TATACT). Sekvence podobná jadernému TATA boxu leží mezi těmito dvěma prokaryotickými promotorovými motivy.

Většina chloroplastových genů je transkribována jako polycistron podobně jako geny prokaryot, takže více než 120 genů je seskupeno asi do 50 transkripčních jednotek. Na rozdíl od prokaryot tyto jednotky obsahují i funkčně odlišné geny.

Rostlinné chloroplasty mají dva typy RNA polymeráz. Prvním typem je RNA polymeráza podobná prokaryotické RNA polymeráze E. coli. Její podjednotky α, β a β´ jsou determinovány chloroplastovými geny, gen pro podjednotku δ je jaderný a slouží jako další důkaz kooperace obou genomů a regulace chloroplastové transkripce. Plastidová RNA polymeráza rozpoznává chloroplastové promotory obsahující -10 a -35 prokaryotické konsenzuální sekvence. Poslední poznatky naznačují, že chloroplastové geny mohou být transkribovány také RNA polymerázou sestávající z jedné podjednotky. Tato polymeráza je podobná polymeráze bakterofága T3 a T7 a je determinována jaderným genem. Tento typ RNA polymerázy chloroplastů nahrazuje funkci RNA polymerázy prvního typu jestliže nějaký inhibitor zablokuje translaci v chloroplastech a nevznikají podjednotky α, β a β´. Jaderným genem kódovaná polymeráza pokračuje v transkripci chloroplastových genů. Promotorové sekvence pro pro tento druhý typ RNA polymerázy nejsou známé.

Post-transkripční kontrola

Některé chloroplastové geny jsou konstitutivně transkribovány, ačkoli se transkripční úrovně mění. To naznačuje, že post-transkripční zpracování primárních transkriptů je důležitým krokem v kontrole chloroplastových genů.

Akumulace transkriptů genů během vývoje chloroplastů byla sledována u řady rostlinných druhů.

Prokaryotické charakteristiky chloroplastového genomu:

1. Kružnicová dvouřetězcová molekula DNA.
2. DNA netvoří komplex s histony.
3. Obsah bazí G/C je podobný jako u bakterií (36 – 40 %).
4. Žádné metylcytosiny.
5. Prokaryotické motivy promotorů.
6. Polycistronová mRNA.
7. 70S ribozomy.
8. Syntéza proteinů je inhibovaná antibiotikem chloramfenikolem.
9. Syntéza proteinů začíná A-formylmethioninem.
10. Chloroplastová mRNA není modifikována na 5´konci a na 3´konci tvoří typickou vlásenku.

Interakce mezi chloroplastovou a jadernou DNA

Chloroplastový genom není dostatečně velký, aby kódoval všechny proteiny přítomné v této organele. Všechny hlavní proteinové komplexy thylakoidních membrán, které jsou součástí fotosyntézy, obsahují proteiny kódované jadernými geny. Komplex ATP syntetázy, fotosystém I, fotosystém II a komplex cytochromu blf obsahuje komponenty kódované jak chloroplastovým tak jaderným genomem. Jaderné geny tvoří malé genové rodiny (1 až 5 genů), zatímco chloroplastové geny jsou přítomny až v 10 000 kopiích na buňku. Z toho vyplývá, že musí existovat přísná kontrola funkcí jaderných i chloroplastových genů, aby byla zajištěna koordinovaná souhra všech struktur. Kontrola exprese jaderných genů vlivem světla je důležitou komponentou této interakce.

Dalším rysem chloroplastových proteinů kódovaných jadernými geny je nutnost jejich transportu z cytoplazmy do chloroplastů. Tyto proteiny jsou syntetizovány jako prekurzorový protein, který je delší než vlastní zralý protein. Např. vazebný protein ferredoxin PS1-2 reakčního centra fotosystému I je syntetizován jako polypeptid sestávající z 212 aminokyselin, avšak zralý protein lokalizovaný v periferní thylakoidní membráně je dlouhý pouze 162 aminokyselin. Vysvětlením tohoto rozdílu je, že první A-terminální aminokyseliny vznikajícího PS1-2 polypeptidu tvoří signální místo pro přesnou lokalizaci tohoto proteinu uvnitř buňky. Tyto aminokyseliny jsou vyštěpeny z proteinu při transportu chloroplastovými membránami. Signální protein způsobuje jednak třídění proteinů do chloroplastů a také transport přes chloroplastovou membránu. Transportní peptid se váže nejdříve na lipidy a proteiny vnější membrány chloroplastu a pak je uchopen transportním aparátem, který tvoří proteinový pór. Tento aparát se skládá z proteinů vnější membrány TOC159, TOC75 a TOC34 (TOC – angl. translocon of the outer membrane of the chloroplast), a proteiny vnitřní membrány, TIC110 a jeden neznámý protein (TIC – angl. translocon of the inner membrane of the chloroplast). Složení tohoto komplexu je dynamické a mění se během procesu translokace. Po přenosu proteinu dovnitř chloroplastu, existují tři různá místa určení:

Proteiny, které zůstávají ve stromatu (např. Rubisco) ztrácejí svoje transportní peptidy a jsou skládány do funkčních proteinů procesem vyžadujícím ATP a velký chaperon Hsp60.

Proteiny, které fungují v thylakoidní membráně jsou rozpoznány a uchopeny chloroplastovou signální rozpoznávací částicí SRP a přítomného GTP.

Proteiny určené do lumenu thylakoidů (vnitřní prostor mezi thylakoidními membránami). Tyto proteiny mají dva signální peptidy. První je odstraněn při transportu přes chloroplastovou obalovou membránu stromatovou peptidázou. Druhý signální peptid je nyní na A-signálním konci polypeptidu. Umožňuje lokalizaci proteinu na thylakoidní membráně a je odstraněn při transportu do prostoru thylakoidní membrány thylakoidní peptidázou. V závislosti na proteinu, který je transportován, tento proces přenosu vyžaduje pouze rozdílné pH a ATP.

Kromě těchto tří kompartment může být cílovým místem proteinu transportovaného z cytoplazmy vnitřní i vnější membrána chloroplastu.

Enzym Rubisko (ribulózo-1,5-bifosfát karboxyláza) pro fixaci CO₂, je multiproteinový komplex s podjednotkami dvou typů. Gen pro menší podjednotku (rbcS) je lokalizován v jádře, gen pro větší podjednotku (rbcL) je v cpDNA. Podjednotka enzymu determinovaná jaderným genem je transportována z cytoplazmy do chloroplastu, malé podjednotky enzymu jsou ve stromatu. Protein se skládá z osmi malých a osmi velkých podjednotek ve formě dimerů a má tvar krychle. Rubisco je jeden z nejčastějších proteinů na Zemi, tvoří až polovinu proteinů ve stromatu chloroplastů. Tvorba tohoto proteinu vyžaduje koordinaci tří subbuněčných kompartmentů, jádra, cytosolu a chloroplastu.

Mitochondriální DNA

Organizace mitochondriálního genomu

Mitochondrie, stejně jako chloroplasty, obsahují vlastní chromozom, mtDNA. Mitochondriální genomy rostlin jsou větší než mitochondriální genomy savců nebo kvasinek. Existují však značné rozdíly i mezi jednotlivými druhy rostlin. Např. Brassica campestris má mitochondriální genom 218 kb, zatímco Cucumis melo 2 400 kb. MtDNA A. thaliana má asi 366 kb a obsahuje 57 genů. MtDNA některých druhů rostlin byla kompletně sekvenována (A. thaliana, Oryza sativa a Beta vulgaris).

Rozdíly ve velikosti mitochondriálního genomu nelze vysvětlit rozdíly v množství repetitivních sekvencí. Ty tvoří většinou jen 10 % genomu. Větší velikost genomu nelze vysvětlit ani větším počtem mitochondriálních genů, neboť studium syntézy proteinů izolovanými mitochondriemi ukázalo podobný počet mitochondriálních polypeptidů a to i u rostlinných druhů, které mají velice rozdílné genomy. Velikost a struktura mitochondriálních genů také nezpůsobuje tuto variabilitu, i když mitochondriální geny mohou obsahovat introny. MtDNA neobsahuje větší množství cpDNA, i když určité množství zde bylo zjištěno (u kukuřice asi 4 až 5 %). V mitochondriích některých linií kukuřice s cytoplazmatickou samčí sterilitou jsou kromě mtDNA přítomny i plazmidy. Jsou to malé kružnicové nebo lineární útvary, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí od 1,4 do 7,4 kb, a jejich hlavní význam je spojen s pylovou sterilitou. Hlavní typy jsou označeny S, R a D. Plazmidy S mohou zůstat extrachromozomální nebo se mohou integrovat do mtDNA. Rostliny kukuřice s cytoplazmatickou samčí sterilitou a s cytoplazmou cms-S mají mitochondriální plazmidy S-1 a S-2. Tyto plazmidy se začlenily do mtDNA. Kromě mitochondriálních plazmidů mohou mitochondrie rostlin obsahovat i 1- a 2-řetězcovou plazmidovou RNA dlouhou až 18 kb. Kompletní sekvence plazmidů mitochondrií jsou známé u Zea mays, Beta vulgaris, O. sativa a Vicia faba.

Analyzovat strukturu rostlinných mitochondriálních genomů je obtížné částečně proto, že se jejich struktura rychle mění. Malé kružnicové molekuly mtDNA v živočišných buňkách (asi 16 kb) mohou být vizualizovány elektronovou mikroskopií. U rostlinných buněk se elektronovou mikroskopií nedaří kružnicové molekuly mtDNA identifikovat. Byly identifikovány pouze kružnicové struktury, které však byly příliš malé, než aby šlo o celý mitochondriální genom. Předpokládá se, že mtDNA existuje v buňkách ve formě několika subgenomových kružnicových struktur, které vznikají častými rekombinacemi v oblastech s malými repeticemi.

Mitochondriální genom kukuřice má 570 kb, z toho je 540 kb jedinečných sekvencí. V genomu je 7 velkých repeticí větších než 700 bp a mnoho krátkých repeticí. Velké repetice mohly vzniknout jako důsledek rekombinace mezi malými repeticemi a ty mohly vzniknout reverzní transkripcí „nefunkčních“ částí mitochondriálních transkriptů.

Sekvenování mtDNA odhalilo, že mtDNA obsahuje i sekvence homologní s cpDNA. Navíc také tyto sekvence byly zjištěny v jaderném genomu. To odhalilo možnost přenosu DNA mezi organelami a jádrem a r. 1982 vzniklo označení promiskuitní DNA pro sekvence, které byly nalezeny ve více než jednom ze tří genetických systémů – jádro, mitochondrie, chloroplast, jako relikty extenzivního přenosu DNA mezi organelami.

MtDNA obsahuje geny pro enzymy, které se podílejí na oxidativní respiraci, syntéze ATP a mitochondriální translaci.

Exprese mitochondriálních genů

Úprava transkriptů

Proteinové produkty mitochondriálních genů nelze odvodit ze sekvencí mtDNA přesně, protože RNA je modifikována posttranskripčními úpravami (angl. RNA editing). Ty zahrnují záměny C bazí genomu za U báze v mRNA, mění se 5’ netranslatované oblasti (zkr. UTR), 3’ UTR a také introny a exony.

Některé mitochondriální geny obsahují introny. U řady intronů byly identifikovány sekvence homologní s virovou reverzní transkriptázou. Funkční význam této homologie nebyl objasněn.

Translace

Mitochondriální genom kóduje část proteinů mitochondrií, které se podílejí na translaci. Ne všechny potřebné tRNA geny jsou přítomny v mtDNA vyšších rostlin, a proto další tRNA musí být transportovány do mitochondrií z cytoplazmy. Ribozomy mitochondrií jsou strukturálně více podobné prokaryotickým ribozomům. Mají sedimentační koeficient 77 až 78S a na rozdíl od cytoplazmatických ribozomů (80S) jsou inhibovány antibiotiky chloramfenikolem a tetracyklinem. Rostlinné mitochondriální ribozomy mají také podjednotky 5S rRNA, které nejsou u jiných eukaryotických mitochondriálních ribozomů. Jak rRNA tak tRNA mitochondrií rostlin jsou více podobné rRNA a tRNA z chloroplastů a eubakterií než těmto molekulám vyskytujícím se u živočichů a kvasinek.

Stejně jako chloroplastové mRNA ani mitochondriální mRNA nemají 5’ konec krytý čepičkou a obvykle nemají ani 3’ poly(A) konec. Mitochondrie mají poněkud odlišný genetický kód. Např. kodon CUA kóduje aminokyselinu leucin u jaderných genů, ale threonin u mitochondrií (kvasinky), jaderný stop kodon UGA kóduje u mitochondrií aminokyselinu tryptofan.

Interakce mezi mitochondriální a jadernou DNA

Protein syntetizovaný v cytoplazmě musí opět nést signální sekvenci, úsek na molekule, který umožňuje jeho rozpoznání jako proteinu určeného pro transport do mitochondrií. Je jím krátký úsek na začátku řetězce, uspořádaný do šroubovice tak, že jedna její strana je po délce hydrofobní, druhá kladně nabitá.

Takto označené proteiny jsou uchopeny systémem chaperoninů (Hsp) a dalších pomocných proteinů a dopraveny k vnější mitochondriální membráně, kde se systém naváže na multiproteinový pór označovaný jako TOM (angl. translocase of the outer membrane). Protože molekula ve tvaru klubíčka se přes TOM nedostane, je nutno ji rozbalit a jako jednorozměrný řetězec přesunout přes vnitřní mitochondriální membránu.

Jestliže je protein určen pro mitochondriální matrix, musí překonat ještě vnitřní mitochondriální membránu. V té se nachází pórový komplex TIM (angl. translocase of the inner membrane) složením odlišný od TOM. Obě membrány k sobě přilnou a protein prochází komplexem TOM/TIM. Zavedení do TIM vyžaduje přítomnost membránového potenciálu na vnitřní membráně, tj. mitochondrie musí být energeticky nabité.

Z vnitřní strany je protein uchopen opět chaperoninem (Hsp70), pomocí proteinázy je odštěpena signální sekvence a působením dalšího chaperoninu získá konečné uspořádání.

---

Doplňující animace k tématu

---

On-line prezentace

Ke kapitolám Struktura rostlinného genomu a Genomika rostlin.