Inkompatibilní systémy vyšších rostlin

U 90 z 320 čeledí vyšších rostlin byly nalezeny genetické mechanizmy, které znemožňují samoopylení. Tato blokáda se nazývá autoinkompatibilita. Obecně pod pojmem inkompatibilita rozumíme neschopnost rostlin tvořit semena, ačkoli tvoří funkční gamety, a to jak při samoopylení, tak i při cizosprášení s geneticky blízkými formami. Inkompatibilita je v rostlinné říši velmi rozšířená. Nejznámější je u čeledí Fabaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Brassicaceae, Papaveraceae a Poaceae. Z tohoto velkého rozšíření v rostlinné říši je vidět, že inkompatibilita hraje důležitou roli v evoluci.

Termín inkompatibilita zavedl v roce 1917 Stout při studiu fertility u Cichorium intybus, ačkoli tento mechanizmus byl znám již mnohem dříve. Již před dvěma stoletími Kőlreuter pozoroval, že u rodu Verbascum se při opylení vlastním, zjevně fertilním pylem netvoří semena, zatímco při cizosprášení se semena tvoří v dostatečném počtu.

Hlavní funkcí inkompatibilních systémů je zabránění inbridingu a tedy zajištění cizosprášení. Tento mechanizmus je uskutečňován na základě inkompatibility pylu a pletiva čnělky nebo blizny. Nelze jej tedy zaměňovat s formami sterility, kdy neschopnost vytvářet životaschopná semena je způsobena chromozomovými abnormalitami, některou formou poruchy tvorby gamet nebo vývoje embrya, popř. neschopností uvolňování pylu z prašných váčků.

Inkompatibilita je geneticky determinována jedním nebo více lokusy, označovanými symbolem S. Lokus má řadu charakteristik, které jsou společné všem čeledím:

• U některých druhů byl počet alel lokusu odhadnut až na 200. Jeden lokus může být tvořen skupinou několika vázaných genů.
• U diploidních rostlin jsou přítomny vždy dvě alely.
• Inkompatibilní reakce vzniká v případě, žealela (alely) S rodičovské rostliny poskytující pyl je stejná jako alela (alely) S  u mateřské rostliny.

Inkompatibilní systém vyšších rostlin je mechanizmus, který prostřednictvím lokusu S zabraňuje samooplození a tím zabezpečuje oplození mezi geneticky odlišnými jedinci. Byly získány poznatky týkající se molekulárních a biochemických procesů inkompatibility a postupně jsou odhalovány různé systémy.

Obr. 5.1 ukazuje klíčová pletiva rostliny, která souvisejí s mechanizmy inkompatibility. K oplození dochází tehdy, jestliže pylová zrna tvoří pylové láčky, které prorůstají bliznou a pletivem čnělky až do semeníku k vajíčkům. Během růstu pylové láčky se jedno haploidní jádro pylového zrna (generativní) dělí mitoticky a v pylové láčce jsou přítomna tři haploidní jádra. Může dojít k dvojitému oplození, jestliže láčka proroste k mikropylárnímu otvoru vajíčka.

Existují dva odlišné genetické mechanizmy kontroly autoinkompatibility kódované lokusem S. Je to gametofytická (GI) a sporofytická inkompatibilita (SI). Dále se rozlišuje také heteromorfní a homomorfní inkompatibilita, která se vztahuje pouze k morfologii květu. V rámci jedné čeledě mohou být druhy jak autofertilní tak autoinkompatibilní. Ale u inkompatibilních druhů v rámci čeledě existuje jen jeden systém (GI nebo SI).

Genotyp haploidního pylu (gametofyt) determinuje inkompatibilní reakci pylu při GI. V případě SI je inkompatibilní reakce determinována diploidním genotypem rostliny (sporofytem), která produkuje pyl (obr. 5.2). GI je u vyšších rostlin častější než SI.

Jsou opylovány tři různé mateřské rostliny s gametofytickým typem inkompatibility genotypů S₁S₂, S₂S₃, S₂S₄. Genotyp otcovské rostliny je S₁S₃. Veškerý pyl je genotypů S₁nebo S₃. Na blizně rostliny S₁S₂ vyklíčí pouze pyl s alelou S₃, opylení pylem S₁ je inkompatibilní, protože se setkává ve čnělce s identickou alelou. Vzniku zygot se účastní jen polovina pylových zrn. Na blizně rostliny S₂S₃ vyklíčí pyl S₁ a při opylení rostliny S₂S₄je kompatibilní veškerý pyl (obr. 5.2 I). GI se vyskytuje u řady druhů např. v čeledi Solanaceae

SI je charakteristická pro čeleď Brassicaceae. Typickým představitelem je Brassica oleracea. Pyl rostliny genotypu S₁S₃ je fenotypu S₁S₃ ať nese alelu S₁ nebo S₃. Je to způsobeno přítomností proteinů v obalech pylu, tzv. samčích determinantů, které mají původ v buňkách tapeta při mikrogametogenezi. U mateřských rostlin genotypů S₁S₂ a S₂S₃ k oplození po tomto opylení nedojde. Úspěšné je oplození pouze rostlin S₂S₄. Alely S jsou kodominantní, působí nezávisle (obr. 5.2II). U některých druhů jsou alely S ve vztahu dominance (kap. 3.2).

Rozdíl mezi GI a SI se projevuje i v načasování exprese inkompatibility u pylu. V důsledku přítomnosti a charakteru samčích determinantů dochází u GI k inhibici růstu pylové láčky ve čnělce (ale láčka vyklíčí na blizně). U SI je růst pylové láčky inhibován již na povrchu blizny.

Obr. 5.1 Pletiva účastnící se mechanizmů inkompatibility.
(Zdroj: Hughes, 1996)

Gametofytická inkompatibilita

Gametofytickou inkompatibilitu poprvé popsali East a Mangelsdorf (1925) u Nicotiana sanderae. V tomto systému je inkompatibilita podmíněna vzájemným působením pylu a pestíku, tj. haploidním genomem každého pylového zrna a diploidním genomem pletiva čnělky, kterou pylová láčka prorůstá do semeníku k vaječné buňce. Inkompatibilní reakce, tedy neschopnost růstu pylové láčky, nastává tehdy, jestliže pylové zrno nese shodnou alelu jako pletivo pestíku. Jsou však možné i takové případy, kdy se mechanizmus inkompatibility uplatní až v zárodečném vaku (inkompatibilní systém haploid – haploid). Takovýto mechanizmus je charakteristický pro víceleté druhy rodu Freezia, Hemerocallis a Narcissus.

Jeden mnohoalelní lokus

Na příkladu Nicotiana sanderae lze demonstrovat GI determinovanou jedním lokusem S. Tento lokus obsahuje velký počet alel: S₁, S₂, S₃, …, S_n. Diploidní sporofyt je většinou heterozygotní (např. S₁S₂, S₁S₃). Každé pylové zrno obsahuje pouze jednu z alel S. Ke kompatibilnímu opylení dojde pouze v tom případě, kdy se daná alela pylu setká s odlišnými alelami v pestíku.

Genetické založení tohoto systému inkompatibility předurčuje minimální počet alel v izolované populaci na tři. Populace se pak bude skládat ze tří genotypů: S₁S₂, S₁S₃ a S₂S₃. Při opylení (samoopylení i cizosprášení) budou z devíti reciprokých kombinací tři inkompatibilní (při samoopylení) a zbývajících šest bude kompatibilních, i když pouze polovina pylových zrn bude schopna prorůstat čnělkou a účastnit se oplození (tab. 5.2 A). Se zvyšujícím se počtem alel v populaci se bude zvyšovat podíl kompatibilních opylení. Budou-li v populaci čtyři alely S, pak ze 36 možných kombinací bude 6 inkompatibilních, ve 24 kombinacích bude kompatibilní pouze polovina pylových zrn a 6 bude plně kompatibilních (tab. 5.2 A, B).

Obr. 5.2 Kompatibilní a inkompatibilní křížení rostlin s I/ jednolokusovým gametofytickým, II/ sporofytickým systémem autoinkompatibility. Prorůstání pylových láček a oplození.

Obecně lze říci, jestliže v dané populaci je počet kombinací opylení (samoopylení i cizosprášení) T a počet inkompatibilních kombinací I_S, pak lze jejich vztah vyjádřit:

Další zvláštností populací s gametofytickým systémem inkompatibility se třemi alelami je jednosměrná kompatibilita potomstva při jeho křížení s rodičovskými genotypy: jestliže mateřské rostliny S₁S₂ budou opyleny pylem rostliny S₁S₃, v potomstvu budou rostliny genotypů S₁S₃ a S₂S₃; rostliny mateřské populace mohou být opyleny oběma genotypy rostlin potomstva, avšak rostliny otcovské populace mohou být opyleny pouze rostlinami S₂S₃.

Až na nepatrné výjimky (např. Solanaceae) mají všechny druhy určité čeledě určitý systém inkompatibility. Gametofytický systém s jedním mnohoalelním lokusem S byl prostudován zejména v čeledích Fabaceae (Trifolium), Solanaceae (Nicotiana, Lycopersicon, Solanum, Petunia), Scrophulariaceae (Antirrhinum, Nemesia), Rosaceae (Prunus, Malus), Oenotheraceae (Oenothera) a Liliaceae (Lilium). V některých případech je tento systém funkční u kulturních druhů (např. Prunus avium, Trifolium repens), jindy se vyskytuje pouze u planě rostoucích předků (např. Lycopersicon peruvianum vs. L. esculentum; Nicotiana alata vs. N. tabacum). U kulturních druhů tedy došlo ke ztrátě inkompatibility modifikací lokusu S.

Dva mnohoalelní lokusy

Tento systém inkompatibility byl poprvé objeven u druhů Secale cereale a Festuca pratense Lundqvistem r. 1955. Později byl popsán i u jiných druhů čeledě Poaceae,např. u Phalaris coerulescens, Hordeum bulbosum, Dactylis glomerata, Lolium perenne. Později v letech 1991 až 1993 byl identifikován třetí lokus T, který se podílí na determinaci inkompatibility u P. coerulescens, L. perenne a S. cereale. U S. cereale je lokus S lokalizován na chromozomu 1R, lokus Z na chromozomu 2R a lokus T na chromozomu 5R. U L. perenne je lokus S lokalizován na chromozomu 6 a lokus Z na chromozomu 2.

Genetická determinace inkompatibilní reakce je v tomto případě charakterizovaná dvěma lokusy označenými S a Z, které se dědí nezávisle, avšak funkčně spolupůsobí. Inkompatibilita se projeví při identitě alel obou lokusů v genotypu pylu a pestíku. Má-li pyl a pestík identické alely pouze v jednom lokusu, opylení je kompatibilní. Kompatibilní reakce je určena pouze genotypem gametofytu, neboť se jedná o gametofytický systém, přitom alely téhož lokusu jsou rovnocenné (neexistuje mezi nimi vztah dominance a recesivity) a také mezi alelami různých lokusů není epistatický vztah.

Tento systém inkompatibility lze demonstrovat na řadě křížení:

1. ♀ S₁S₁ Z₃Z₃ x ♂ S₂S₂ Z₄Z₄ kompatibilní
2. ♀ S₁S₁ Z₃Z₃ x ♂ S₁S₁ Z₄Z₄ kompatibilní
3. ♀ S₁S₁ Z₃Z₃ x ♂ S₁S₂ Z₃Z₄ kompatibilní
4. ♀ S₁S₂ Z₃Z₄x ♂ S₁S₁ Z₃Z₃ inkompatibilní

Z uvedených příkladů je vidět, že reciproká křížení (3) a (4) vedou k různým výsledkům. U křížení (3) prorůstá pyl S₁Z₄, S₂Z₃ a S₂Z₄.

Další znaky tohoto systému ukážeme na jiném příkladu. Předpokládejme, že u rostliny heterozygotní v obou lokusech, S₁S₂ Z₃Z₄, získáme samoopylením potomstvo (i u autoinkompatibilních druhů je to za zvláštních podmínek možné). V tomto potomstvu bude 9 genotypů s četnostmi odpovídajícími teoretickému poměru 1 : 2 : 1 : 2 : 4 : 2 : 1 : 2 : 1. Výsledky křížení všech těchto genotypů mezi sebou včetně samoopylení ukazuje tab. 5.3.

Z tabulky je zřejmé, že genotyp S₁S₂ Z₃Z₄ je autoinkompatibilní. Bereme-li ho jako mateřskou formu, je se všemi ostatními genotypy inkompatibilní, jestliže ho však bereme jako otcovskou formu, je naopak se všemi ostatními genotypy kompatibilní. Dále je vidět, že podíl kompatibilních opylení je zde mnohem vyšší (60,9 %) než byl v potomstvu nuceně samosprášených rostlin S₁S₂, tedy v jednolokusovém systému (37,5 %).

Obecně lze říci, že stabilita inkompatibility je ve dvoulokusovém systému mnohem menší než v systému s jedním lokusem S.

Studium alel inkompatibility ve zcela neznámém systému je úkol velmi složitý. Ve dvoulokusovém a složitějším systému je determinace alel poměrně snadná pouze v tom případě, máme-li k dispozici rostliny známého genotypu.

Tři a více lokusů

Při analýze vztahů v systému inkompatibility se dvěma lokusy jsme došli k závěru, že jednosměrná inkompatibilita je charakteristická pro ty případy, kdy otcovská forma je homozygotní v lokusech, ve kterých je mateřská forma heterozygotní (♀ S₁S₁ Z₃Z₃x ♂ S₁S₂ Z₃Z₄ je kompatibilní, avšak ♀ S₁S₂ Z₃Z₄ x ♂ S₁S₁ Z₃Z₃ je inkompatibilní).

V některých případech se může stát, že rostlina A je kompatibilní jako otec se dvěma druhými rostlinami, B a C a rostlina B je jako otec kompatibilní s rostlinou C, avšak při tom jiná křížení mezi A, B a C jsou inkompatibilní. Kdybychom chtěli tyto případy vysvětlit na základě dvou lokusů inkompatibility, pak by se tato tříúrovňová kompatibilita dala zapsat:

A: S₁S₂ Z₃Z₄ → B: S₁S₁ Z₃Z₄→ C: S₁S₁ Z₃Z₃

Vidíme, že rostlina C by musela být dvojnásobně heterozygotní, což v případě legitimního křížení není v tomto systému inkompatibility možné. Tyto případy, které byly objeveny např. u Ranunculus acris, mohou být vysvětleny na základě tří lokusů inkompatibility. U Beta vulgaris a Papaver rhoeas byly na základě čtyřúrovňové jednosměrné inkompatibility odhaleny 4 lokusy inkompatibility.

V předchozím jednolokusovém mnohoalelním systému gametofytické inkompatibility jsme poznali, že se vzrůstajícím počtem alel v lokusu vzrůstal podíl kompatibilních křížení lineárně. Ve vícelokusovém systému roste tento podíl se vzrůstajícím počtem lokusů exponenciálně.

Molekulární analýza gametofytické inkompatibility

Nicotiana, Petunia

Druhy rodu Nicotiana mají gametofytické mechanizmy inkompatibility. Molekulární analýza byla iniciována identifikací hlavního glykoproteinu čnělky jako samičího determinatu. Z knihovny cDNA byl izolován klon cDNA ze zralé čnělky a byl potvrzen jako gen kódující čnělkový glykoprotein. Přítomnost mRNA tohoto genu byla zjištěna ve zralých čnělkách a semenících a protein kódovaný genem byl detekován ve velkých koncentracích v mezibuněčných prostorách na povrchu pletiv, kterými prorůstá pylová láčka.

Sekvenční analýza klonu cDNA ukázala, že je homologní se skupinou houbových ribonukleáz (RNáz) a v důsledku toho byl nazván S-RNáza (30 kDa). Tab. 5.4 dokládá tvorbu enzymu degradujícího RNA během inkompatibilního opylení u Nicotiana alata. Rostliny různých genotypů byly opyleny pylem, jehož nukleové kyseliny byly radioaktivně značeny ³²P. Po určitém čase, aby mohlo dojít ke klíčení pylových láček, byla extrahována RNA ze čnělek a byla zjištěna koncentrace radioaktivní RNA (pocházející z pylu). Tab. 5.4 ukazuje, že z inkompatibilních křížení bylo získáno málo pylové RNA a z kompatibilních křížení to byly podstatně vyšší koncentrace. Toto potvrzuje předpoklad, že RNáza je produkována během inkompatibilního křížení (obr. 5.3).

Jako samčí determinant pylu byl identifikován protein SLF (S-locus F box), který funguje jako cytoplazmatický receptor v pylové láčce (obr. 3B). Byla tak korigována první představa funkce tohoto receptoru jako transmembránového (obr. 5.3A).

Model interakce pyl – čnělka

Geny pro samčí a samičí determinant jsou těsně vázané v lokusu S. Konkrétní dvě alely se dědí společně jako jeden znak, proto hovoříme o dvou haplotypech v případě heterozygotnosti rostliny v lokusu S. Na obr. 5.3 je schéma interakce pylu a buněk čnělky, při které dochází k S-RNázové aktivitě. S-RNáza je produkována buňkami čnělky a tento protein je transportován do prorůstajících pylových láček v pletivu čnělky. K rozpoznávací reakci mezi proteinem pylu a proteinem čnělky dochází na základě vazebných míst těchto proteinů, pokud jsou produkty různých haplotypů. Po navázání S-RNázy na receptor dojde k její detoxifikaci a neprojeví se její RNázová aktivita. V rostoucí pylové láčce aktivní S-RNáza, která se nenaváže na receptor, degraduje mRNA v láčce, což vede k zastavení růstu láčky a nedochází k oplození (obr. 5.3B).

Obr. 5.3 Model účinku S-RNázy při inkompatibilní reakci mezi buňkami čnělky a pylových láček u r. Nicotiana a Petunia. Samčí determinant jako (vlevo) transmembránový receptor, (vpravo) cytoplazmatický receptor.
(Zdroje: Hughes, 1996; Iwano a Takayama, 2012)

Papaver rhoeas

Druhy rodu Papaver mají gametofytický typ inkompatibility a podařilo se klonovat gen kódující tzv. malý protein blizny (15 kDa). Tento protein není S-RNáza, ale podobně jako tyto proteiny vykazuje úplnou vazbu s lokusem S u máku. Gen kódující tento protein byl exprimován u E. coli a ukázalo se, že rekombinantní protein inhiboval pylová zrna klíčící v podmínkách in vitro. Autoinkompatibilní reakce u máku je spojena s uvolňováním Ca²⁺ do cytoplazmy pylových zrn a tato skutečnost vedla k vytvoření modelu vysvětlujícího interakci mezi pylem a bliznou, která je ve zjednodušené formě uvedena na obr. 5.4A.

Obr. 5.4 Model působení malého proteinu blizny na inhibici růstu pylové láčky při inkompatibilní reakci u Papaver rhoeas. Nahoře vlevo / vpravo interakce samčího a samičího determinantu jako produktů buněk pylu a blizny, dole mechanizmus buněčné smrti a zastavení růstu pylové láčky.
(Zdroje: Hughes, 1996; Iwano a Takayama, 2012; Thomas et al., 2006)

Vazbou proteinu blizny s receptorem S v rozpoznávacích místech se aktivuje inkompatibilní reakce, jejíž signalizační kaskáda je zahájena tokem Ca²⁺ do klíčící pylové láčky a zvyšuje se tak koncentrace Ca²⁺ v cytoplazmě pylu. Během 1,5 min. se aktivují dva mechanizmy, do nichž jsou zapojeny dva pylové proteiny, p26 a p56. p26 má fosfatázovou aktivitu a má důležitou funkci při tvorbě ATP a biopolymerů nezbytných pro nově se tvořící membrány a buněčnou stěnu při růstu pylové láčky. Při inkompatibilní reakci je redukována fosfatázová aktivita proteinu p26. Fosforylací proteinu p26 se zvyšuje koncentrace fosfátu až na toxickou úroveň. Pylový protein p56 má kinázovou aktivitu (MAP kináza). MAP kinázy jsou často aktivovány stresem a podílejí se na programované buněčné smrti. Při inkompatibilní reakci se také aktivuje kaskáda apoptotického mechanizmu, která má za důsledek uvolňování cytochromu c z mitochondrií, tvorbu kaspáz a fragmentaci jaderné DNA v pylové láčce. Mechanizmus je doprovázen i reorganizací a depolymerizací vláken F-aktinu v cytoskeletu. Toto vše zastavuje růst pylové láčky.

K inhibici vývoje pylu při gametofytické inkompatibilitě máku dochází na povrchu blizny. Na rozdíl od jiných druhů, kde k inhibici dochází při prorůstání pylové láčky, je to způsobeno nepřítomností čnělky u máku.

Sporofytická inkompatibilita

Sporofytický systém inkompatibility poprvé popsali v roce 1950 Hughes a Babcock u Crepis foetida a Gerstel u Parthenium argentatum. Vyznačuje se tím, že reakce pylu (každého pylového zrna) je podmíněna diploidním genotypem somatického pletiva (sporofytu), ve kterém pyl vzniká. Znamená to tedy, že při mikrosporogenezi si všechen pyl bez ohledu na svůj genotyp ponechává fenotypovou reakci dominantní alely přítomné v samčím diploidním pletivu, popř. je tento vztah kodominantní. Například otcovská rostlina S₁S₂ bude mít všechen pyl fenotypu S₁ při dominanciS₁ > S₂, ačkoliv část pylových zrn ponese alelu S₂. Křížení ♀ S₁S₂ x ♂ S₁S₃ je inkompatibilní, neboť všechen pyl bude fenotypově S₁, a tedy inkompatibilní s pletivem blizny S₁S₂. Reciproké křížení je také inkompatibilní.

Na rozdíl od gametofytického systému je ve sporofytickém systému možnost vzniku homozygotů vzhledem k alelám S. Např. při křížení ♀ S₂S₃ x ♂ S₁S₂ a dominanci S₁ > S₂ v pylu vznikne potomstvo S₁S₂, S₁S₃, S₂S₂ a S₂S₃.

Vzhledem k morfologii květů můžeme v systému sporofytické inkompatibility rozlišit dvě skupiny: heteromorfní a homomorfní inkompatibilitu.

U většiny čeledí s inkompatibilitou kódovanou lokusem S je morfologie květů identická u všech rostlin v rámci druhu. U 23 čeledí byly identifikovány geny determinující morfologii květů, které jsou ve vazbě s lokusem S. Tyto rostliny mají heteromorfní inkompatibilitu.

Heteromorfní inkompatibilita

Již Darwin pozoroval, že u některých druhů rostlin existují rozdíly ve stavbě květů, které souvisejí se zábranou opylení. Termín „heteromorfní inkompatibilita“ pro tyto případy navrhli Fischer a Mather ve 40. letech minulého století.

Heteromorfizmus zahrnuje celou řadu znaků, jako např. velikost a tvar pylových zrn a buněk blizny, avšak nejzřetelněji se projevuje v délce čnělky (heterostylie). Známá je tzv. distylie, kdy druhy (nebo populace) se skládají z rostlin dvou typů: s květy s krátkými pestíky a dlouhými tyčinkami a květy s dlouhými pestíky a krátkými tyčinkami. Při tristylii mají květy kombinace tří délek pestíků a tyčinek.

V systému heteromorfní inkompatibility nedochází k oplození ani při samoopylení, ani při cizosprášení mezi morfologicky stejnými rostlinami. Heterostylie byla nalezena u více než 130 rodů z více než 20 čeledí, a to jak u rostlin jednoděložných, tak dvouděložných. Z toho tristylie byla zjištěna u 9 rodů, u ostatních byla distylie.

Heteromorfní inkompatibilita se velmi zřídka vyskytuje u hospodářsky významných rostlin, byla popsána u čeledí Linaceae (Linum), Plumbaginaceae (Plumbago, Ceratostigma, Limonium), Lythraceae (Lythrum), Amaryllidaceae (Narcissus), Pontederiaceae (Eichhornia) a Primulaceae (Primula).

Klasickým případem distylie je Primula vulgaris. P. vulgaris má sporofytický systém inkompatibility determinovaný 2 alelami lokusu S. Tyto alely se podílejí na kontrole různých pozic blizny a prašníků v květech. Populace tohoto druhu mají stejný počet rostlin s dlouhými čnělkami a krátkými tyčinkami (tzv. „pin“ – genotyp ss) a rostlin s krátkými čnělkami a dlouhými tyčinkami (tzv. „thrum“ – genotyp Ss). U rostlin pin jsou buňky blizny mnohem větší a pylová zrna menší než u rostlin thrum (obr. 5.5).

Obr. 5.5 Dimorfní heterostylie u Primula vulgaris se sporofytickým typem inkompatibility.
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Zcela kompatibilní jsou pouze kombinace ♀ pin x ♂ thrum (ss x Ss) a ♀ thrum x ♂ pin (Ss x ss). Opylení vlastním pylem je inkompatibilní.

Heterostylie či heteromorfizmus nemusí však být spojen s genetickými mechanizmy inkompatibility (např. u Narcissus tazetta z čeledě Amaryllidaceae nebo Anchusa hybrida – Boraginaceae). Tyto druhy jsou autoinkompatibilní, avšak nelegitimní opylení je fertilní.

Tristylie je známá ve třech čeledích krytosemenných (Oxalidaceae, Lythraceae a Pontederiaceae). V populacích jsou tři morfologické skupiny květů: s dlouhými, středními nebo krátkými čnělkami. Tyčinky mají obvykle dvě ze tří možných délek komplementujících v květu s délkou čnělky. Takovéto tři skupiny rostlin pozoroval už Darwin v populacích Lythrum salicaria (obr. 5.6).

Mechanizmus opylení u inkompatibility s tristylií je takový, že pyl z tyčinek určité délky je kompatibilní pouze s pestíkem stejné délky. To znamená, že pyl z tyčinek, které jsou v každém květu dvou různých délek, může oplodit oosféry v pestících květů dvou komplementárních forem. Geneticky je tento systém determinován dvěma nezávislými lokusy (M a S), každý s dvěma alelami:

• dlouhá čnělka: genotyp mm ss
• střední čnělka: genotypy Mm ss nebo MM ss
• krátká čnělka: genotypy MM SS, Mn SS, MM Ss, Mm Ss, mm Ss nebo mm SS.

Dominantní alela S determinuje krátkou čnělku a je epistatická k M; recesivní alela s v homozygotním stavu spolupůsobí s M nebo m a determinuje střední či dlouhou čnělku. Kromě toho existují mezi rostlinami ještě jiné rozdíly, např. ve tvaru pylových zrn a struktuře blizen. Takovýto genetický mechanizmus inkompatibility byl zjištěn u Lythrum junceum. U L. salicaria je genetická determinace složitější v důsledku autotetraploidie. Některé heteromorfní druhy, jako např. Armeria maritima mají konstantní délku čnělky, ale jsou dimorfní vzhledem k morfologii pylu a blizny (obr. 5.7).

Obr. 5.6 Tristilie u Lythrum salicaria se sporofytickým typem kompatibility.
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Obr. 5.7 Dimorfizmus blizen u Armeria maritima var. typica.
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Homomorfní inkompatibilita

Už v roce 1912 pozoroval Correns sporofytickou kontrolu inkompatibility pylu u Cardamine pratensis (Brassicaceae), avšak teprve v 50. letech byla genetická kontrola tohoto systému podrobně prozkoumána u dvou druhů čeledě Asteraceae, u Crepis foetida a Parthenium argentatum. Systém homomorfní sporofytické inkompatibility je velmi důležitý u hospodářsky významných plodin především z čeledí Asteraceae, Brassicaceae a Convolvulaceae. Vyznačuje se těmito vlastnostmi:

1. Inkompatibilita je kontrolována jedním lokusem S s několika alelami, jejichž počet je obvykle menší než v jednolokusovém gametofytickém systému, i když u některých druhů (např. Brassica oleracea) bylo zjištěno více než 50 alel.
2. Všechen pyl rostliny vykazuje stejnou reakci (inkompatibilní nebo kompatibilní), neboť tato reakce je dána diploidním genotypem pletiva sporofytu, ve kterém pyl vznikl.
3. Dvě alely mohou působit buď nezávisle, nebo spolupůsobit tak, že jedna je dominantní nad druhou, a to jak v pylu, tak v pestíku (tab. 5.5). Recesivní alela je inaktivní.
4. Identita aktivních alel v pylu a pestíku způsobuje inkompatibilní reakci. Tab. 5.6 ukazuje různé modely kompatibility v potomstvech různých křížení.
5. Vztahy dominance a nezávislých alel se mohou různě kombinovat v pylu a v pestíku, což může vést k poměrně složitým reakcím. Např. při křížení ♀ S₁S₃ x ♂ S₁S₂ mohou nastat vztahy, jak je uvedeno v tab. 5.4. Příklady různých vztahů alel u některých rostlin jsou na obr. 5.8.

Zvláštní druh inkompatibility se vyskytuje u Theobroma cacao. Všechny pylové láčky proniknou čnělkou do zárodečného vaku, avšak při inkompatibilním křížení nedojde k oplození vajíčka. Celý systém je kontrolován nejméně pěti alelami S se složitými vztahy (obr. 5.8), není však vyloučeno i působení jiných nezávislých lokusů.

Z uvedených případů je zřejmé, že vzájemné vztahy alel při sporofytické inkompatibilitě jsou poměrně složité. Naštěstí existuje již několik vypracovaných metod a postupů, které umožňují poznat tyto vztahy a využít je. Jsou to např. různé způsoby překonání bariér inkompatibility, dokonce i u rostlin homozygotních pro alely S, takže lze u nich uskutečnit i nucené samoopylení. Pomocí těchto rostlin můžeme identifikovat neznámé alely u geneticky neprozkoumaných rostlin. Nuceným samoopylením heterozygotních rostlin známého genotypu a následným křížením v potomstvu lze objasnit vzájemné vztahy těchto alel. Pomocí zpětného křížení s rodičovskými formami nebo křížením s rostlinou známého genotypu si pak můžeme ověřit správnost předpokládaných vztahů alel S.

U druhů se sporofytickou inkompatibilitou nenarušuje zdvojení počtu chromozomů inkompatibilní reakci (na rozdíl od mnoha rostlin s jednolokusovým systémem gametofytické inkompatibility).

Názorné srovnání sporofytického systému inkompatibility s gametofytickým ukazuje tab. 5.7. Pro jednoduchost je sporofytická inkompatibilita demonstrována případem, kdy alely S působí nezávisle jak v pylu, tak v pestíku a gametofytická inkompatibilita je kontrolována jedním lokusem S.

♀ ♂ Potomstvo

Křížení:

• A S₁S₂ x S₃S₄ S₁S₃, S₁S₄, S₂S₃, S₂S₄
• B S₁S₃ x S₂S₄ S₁S₂, S₁S₄, S₂S₃, S₃S₄
• C S₁S₄ x S₂S₃ S₁S₂, S₁S₃, S₂S₄, S₃S₄
• D S₁S₃x S₂S₃ S₁S₂, S₁S₃, S₂S₃, S₃S₃

Křížení uvnitř potomstev

P ♀ S₁S₂x ♂ S₃S₄

F₁ S₁S₃, S₁S₄, S₂S₃, S₂S₄

F₂:

Molekulární analýza sporofytické inkompatibility

Brassica oleracea

Molekulární studium inkompatibility u B. oleracea bylo zahájeno identifikací proteinu syntetizovaného bliznou jeden den po vykvetení a uvolňování pylu z prašníků. Protein obsahuje glykosidické vazby a byl nazván SLG (angl. S-locus-specific-glycoprotein) – protein specifický pro lokus S. Skríningem cDNA knihovny blizny se podařilo izolovat klon cDNA tohoto proteinu o délce 2 kb. Tento klon reprezentuje mRNA syntetizovanou bliznami v kritické době syntézy proteinu SLG (právě při otevírání květů). Tato mRNA není produkována listy ani pletivy semenáčků. SLG mRNA se netvoří u autokompatibilních mutantů B. oleracea. Pomocí in situ hybridizace se podařilo dokázat, že protein SLG je přítomen v buněčných stěnách buněk blizny, v tzv. papilách.

(→ úplná dominance, ---- nezávislé působení)
Obr. 5.8 Vztahy mezi alelami u některých druhů se sporofytickou inkompatibilitou
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Model interakce pylu a blizny

Při skríningu genomové knihovny B. oleracea (genů SLG) byl izolován další gen, který měl do určité míry homologní sekvenci s cDNA sondou SLG. Protein byl nazván SRK (angl. S-locus receptor kinase – podle kinázové domény), je vázán s lokusem S a SLG a je také exprimován v buňkách čnělky.

V rámci lokusu S B. oleracea bylo postupně identifikováno celkem 17 genů v těsné vazbě. Dva z nich, SLG (S-locus-specific glycoprotein) a SRK (S-locus receptor kinase) jsou považovány za geny, které se podílejí na schopnosti blizny rozeznat příbuzný a nepříbuzný pyl (samičí determinanty). Oba geny jsou vysoce polymorfní a jejich exprese byla zjištěna pouze na povrchu zralých blizen. I v prašnících byla zjištěna nízká úroveň mRNA těchto genů, vlastní proteiny se zde nepodařilo detekovat. Třetí gen lokusu S spojený s inkompatibilní reakcí je gen SCR (S-locus cystein protein), jehož exprese probíhá naopak pouze v prašnících. Produktem je protein, který je považován za samčí determinant inkompatibility.

Obr. 5.9 Model objasňující interakci proteinů SLG a S kinázy při inkompatibilní reakci u Brassica oleracea(vlevo). Vpravo proteiny SRK (S kináza) a SCR jako samičí a samčí determinanty.
(Zdroje: Hughes, 1996; Iwano a Takayama, 2012)

Gen SLG má velikost 1,3 kb a kóduje glykoprotein o molekulové hmotnosti 55 kDa, který je vylučován do buněčné stěny papilárních buněk (buňky na povrchu blizny; obr. 5.9A). Přestože je aminokyselinová sekvence genů SLG velmi polymorfní, vždy má v podobné pozici 12 cysteinů. To svědčí o jejich významu při formování terciární struktury patrně nutné pro normální funkci glykoproteinu. Na každém aminokyselinovém řetězci je několik potenciálních N-glykosylačních míst, z toho dvě místa jsou konzervativní.

Klíčovou roli v rozpoznání pylu hraje protein SRK, což je samičí determinant. SLG se také účastní rozpoznávacího procesu. Gen SRK kóduje membránový protein (obr. 5.9B, 10), který je pravděpodobně proteinkináza serin-threoninového typu, a skládá se ze tří domén: 1. extracelulární doména (S-doména) má v rámci jednoho haplotypu značnou podobnost s SLG (min. 90%). Část genu SRK kódující S-doménu obsahuje 12 konzervativních cysteinů, stejně jako je tomu u ostatních genů z tzv. S-genové rodiny. S-doména je spojena přes 2. doménu transmembránovou s 3. cytoplazmatickou doménou, která je sekvenčně blízká protein kinázám. Kinázová aktivita SRK byla prokázána expresí cytoplazmatické domény v E. coli. SRK je příbuzná s rostlinnými kinázami, které se podílejí např. na obranných mechanizmech proti patogenům či regulaci vývoje meristému. Obranný systém i mechanizmus inkompatibility jsou založeny na rozpoznávací reakci. Inkompatibilita má možná původ právě v mechanizmu obrany proti patogenům.

U čeledě Brassicaceae je skupina genů strukturně příbuzných s SLG a SRK, komplexní multigenová rodina exprimující se jak v generativních tak ve vegetativních pletivech. Předpokládá se, že i tato skupina genů je zapojena v různých mechanizmech rozpoznávání pylu a buněk čnělky. Geny jsou sekvenčně příbuzné s SLG, ale nejsou geneticky vázané na lokus S (jsou lokalizovány na jiném chromozomu). Jsou označovány jako geny SLR (S-locus related). Byly analyzovány geny SLR1, SLR2 a SLR3. SLR1 je exprimován v blizně a produktem je glykoprotein sekretovaný podobně jako SLG do buněčné stěny papilárních buněk (obr. 5.10). Není ovšem tak vysoce polymorfní. SLR2 je ve vazbě s SLR1, je exprimován v blizně a sekvenčně podobný genům SLG izolovaným z pylově recesivních haplotypů. Exprese SLR3 byla zjištěna i ve vegetativních orgánech. Geny a jejich produkty jsou zapojeny do mechanizmu tvorby adhezní vrstvy na blizně, která umožňuje kontakt pylu a papilárních buněk blizny.

Obr. 5.10 Model objasňující interakci samčích (pyl) a samičích determinantů (papila blizny) při inkompatibilní reakci u Brassica oleracea
(Zdroj: Sáková a kol., 2002)

Pylovým proteinem je malý protein patřící do rodiny proteinů povrchu pylových zrn (PCP – pollen coat protein), které jsou součástí tzv. tryfinu. Je to materiál bohatý na proteiny a lipidy, který je součástí vnější buněčné stěny pylového zrna. Předpokládá se, že PCP má významnou úlohu v procesu pylové adheze. Dlouho se však nedařilo najít hlavní samčí determinant. Nedávno se podařilo identifikovat gen SCR a prokázat, že kóduje pylový samčí determinant (obr. 5.10). Proteiny SCR tvoří novou třídu proteinů PCP. Tak jako ostatní PCP jsou malé, bohaté na cystein, struktura jejich aminokyselinového řetězce se ovšem liší od známých zástupců rodiny PCP. Gen SCR je v těsné vazbě s geny SLG/SRK a vykazuje specifickou a vývojově regulovanou expresi v buňkách tapeta. Protein SCR funguje jako ligand (samčí determinant) a pokud je na blizně rozeznán komplexem SLG-SRK, následuje odmítnutí prorůstání pylu. SRK a SLG tvoří receptorový komplex analogický s mezibuněčnými signálními mechanizmy savců. V případě opylení inkompatibilním pylem je samčí determinant SCR navázán na receptor SRK, což vede k jeho aktivaci a spuštění signalizační kaskády, která vede k degradaci proteinů buněk blizny nezbytných pro růst pylové láčky a v konečném důsledku znamená inhibici klíčení pylu.

Pro výzkum inkompatibility u rodu Brassica jsou také významné poznatky získané studiem hydratace pylu. Pro start růstu pylové láčky je nutné, aby na blizně došlo k úplné rehydrataci pylových zrn. Protože se jedná o druhy se suchou bliznou, zdrojem vody jsou papilární buňky. Při hydrataci proniká voda z papilárních buněk přes obalovou vrstvu do pylu. Krátce po dopadu pylového zrna na bliznu (10 min) se vytvoří adhezní vrstva (obr. 5.10). Je tvořená převážně tryfinem a zajišťuje spojení mezi pylem a bliznou. V tryfinu byly nalezeny proteiny ze skupiny oleosinů, které zřejmě umožňují transport vody do pylu. Průběh hydratace pylu se dělí na tři fáze a klíčová je druhá fáze, která trvá asi 10 min., a při níž probíhá rychlý transport vody do pylového zrna, a to až do dosažení plného turgoru. Jestliže je pyl inkompatibilního haplotypu, je hydratace ve své druhé fázi zastavena, tedy před tím, než je dosaženo turgoru pylového zrna. Hydratace pylu je zřejmě prvním z kontrolních mechanizmů, kdy se rozhoduje o úspěchu nebo neúspěchu opylení.

Po dopadu pylového zrna na bliznu se musí proteiny SCR a PCP přesunout do buněčné stěny papilární buňky. Tato difúze probíhá krátce po opylení (časné stadium). Proteiny PCP se v buněčné stěně dostávají do kontaktu s proteiny SLG a SLR1, které jsou zde volně ve velkém množství. Protože SLG vážou PCP, mohly by usnadňovat transport hlavního samčího ligandu SCR na plazmatickou membránu. SCR se pravděpodobně váže k aminokyselinovým zbytkům uvnitř extracelulární S-domény SRK. Model předpokládá, že po navázání ligandu dojde k dimerizaci SRK a autofosforylaci, a tím je vyvolána inkompatibilní odpověď. Autofosforylace SRK je normálně blokována thioredoxinem a jeho oddělení proběhne až po navázání pylového ligandu.

Využití inkompatibility ve šlechtění

První práce o inkompatibilitě byly zaměřeny především na její evoluční význam. S tím, jak se později objevily různé problémy při pěstování rostlin s inkompatibilitou, pokročil i výzkum mechanizmu působení v některých systémech. Teprve poměrně nedávno se začaly poznatky využívat ve šlechtění rostlin.

Jedním z prvních problémů, které byly zdárně vyřešeny na základě znalostí inkompatibility, bylo zavedení autokompatibilních druhů u Prunus domestica místo autoinkompatibilních, které vyžadovaly pěstování více stromů v těsné blízkosti, jejich současné kvetení a příhodné podmínky pro hmyzí opylovače, aby byla zabezpečena dobrá sklizeň. V současné době se ve šlechtění druhů s inkompatibilními systémy můžeme setkat s potřebou zavedení inkompatibility do určitého kultivaru či druhu, nebo naopak se snahou o její trvalé či dočasné odstranění. Šlechtitele také zajímají způsoby využití inkompatibility při získávání hybridních semen, nebo získávání kultivarů okrasných rostlin, které v důsledku ztráty tvorby semen mají delší periodu kvetení.

Je samozřejmé, že před tím, než budeme chtít změnit inkompatibilní reakci nebo ji využít, je nutné znát její genetickou podstatu u daného druhu či kultivaru. Již bylo uvedeno dříve, že studium dědičnosti inkompatibility a identifikace genotypů v jednotlivých liniích, je možné pomocí křížení. Kromě toho existují další doplňující způsoby, např. sérologická charakteristika pylu a pestíku, stanovení jejich izoenzymových spekter, využití speciálních signálních genů vázaných se specifickými geny S, opylení izolovaných pestíků in vitro apod.

Zavedení inkompatibility do odrůdy

Pro šlechtitelské účely je někdy potřeba zavést inkompatibilitu do odrůdy, linie nebo specifického klonu, nebo posílit již existující inkompatibilitu. Odrůdy, kterým chybí inkompatibilita, mohou patřit k druhům, jejichž jiné odrůdy mají velmi silnou inkompatibilní reakci (např. Brassica oleracea, Chrysanthemum morifolium). Jindy se inkompatibilita vyskytuje u planě rostoucích příbuzných druhů. V těchto případech se může přenos inkompatibilních alel uskutečnit vnitrodruhovým nebo mezidruhovým křížením. Takovýto přenos byl úspěšný např. u Lactuca a Phaseolus.

Odstranění inkompatibility

Existují tři způsoby trvalého odstranění inkompatibility:

1. zdvojení počtu chromozomů,
2. indukce mutací,
3. přenos kompatibility do inkompatibilní linie.

Zdvojení počtu chromozomů (např. použitím kolchicinu) u diploidních druhů je účinné při odstranění inkompatibility pouze v gametofytických systémech. Poněvadž pylové láčky tetraploidních rostlin obsahují dvě alely S, vzniká možnost interakce alel v heterogenních pylových láčkách (obr. 5.11). Z obrázku je zřejmé, že indukcí tetraploidie autoinkompatibilního druhu lze navodit autokompatibilitu. Tak tomu bylo např. v rodech Trifolium, Nicotiana, Prunus a Petunia.

Při indukci mutací ozářením paprsky X způsobily mutace v některých případech ztrátu inkompatibility jak u pylu, tak u pestíku (Trifolium repens), v jiných případech pouze u pylu (Oenothera, Petunia, Prunus). Většinou se ozařují poupata ve stadiu pylových mateřských buněk. Postup, kterým byla získána autokompatibilní reakce u třešní a její přenesení do kultivaru s vynikajícími vlastnostmi uvádí obr. 5.12.

Obr. 5.11 Kompatibilita u diploidních a tetraploidních rostlin. Diploidní pyl S₁S₂ je kompatibilní ve čnělkách S₁S₂ resp. S₁S₁ S₂S₂, neboť v důsledku interace alel v pylu došlo k odstranění inkompatibilní reakce.
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Obr. 12 zároveň ukazuje, jak pomocí křížení mohou být kompatibilní alely přeneseny do inkompatibilních linií. Jestliže šlechtitel potřebuje k získání čistých linií odstranit inkompatibilitu z odrůdy, bude mít ovšem i zájem uchovat si inkompatibilitu v takovémto šlechtitelském materiálu. Mít obě tyto vlastnosti v jedné linii je pro šlechtitele výhodné např. při masovém získávání hybridních semen F₁ (linie s autoinkompatibilitou). Přenos kompatibility do inkompatibilních odrůd byl popsán např. u Chrysanthemum morifolium.

Obr. 5.12 Postup získání autokompatibilních (S₃S_f) rostlin pomocí indukce mutací a přenesení této mutace do jiného kultivaru s vynikajícími vlastnostmi (S₁S₃) u Prunus domestica.
(Zdroj: Řepková, Relichová, 2001)

Pseudokompatibilita

Pseudokompatibilita (pseudofertilita) se vyskytuje při nelegitimním oplození následujícím po samoopylení nebo po křížení mezi rostlinami v jinak inkompatibilních kombinacích. Objevuje se za speciálních podmínek v přírodě spontánně, nebo ji lze navodit záměrně některou z uvedených metod:

1. Ozáření pylu – ozářením pylových mateřských buněk v poupatech lze docílit toho, že pyl je při samoopylení funkční. Tato metoda byla s úspěchem použita u některých druhů Solanaceae, kde v potomstvu vznikali buď homozygoti, nebo heterozygoti pro alely S, u nichž se obnovila původní inkompatibilní reakce.
2. Opylení v poupatech – nanesení zralého pylu na blizny v poupatech několik dnů před kvetením je nejrozšířenější metodou vedoucí k pseudokompatibilitě. Tato metoda je vhodná pro druhy s gametofytickou, tak i sporofytickou inkompatibilitou. Podrobně byla rozpracována v rodech Brassica a Raphanus. U některých druhů bylo opylení v poupatech efektivnější, jestliže na nezralou bliznu byl nanesen výměšek z povrchu zralých blizen.
3. Opylení na konci vegetace – u některých druhů se na konci vegetačního období nebo v podmínkách pozdního podzimu značně zeslabuje inkompatibilita. Např. u tabáku může být rostlina autoinkompatibilní po celou růstovou sezonu s výjimkou několika málo posledních dnů, kdy dochází k samooplození. Spolehlivost této metody je však sporná. Dokonce u téhož druhu (B. oleracea) byly získány protichůdné výsledky.
4. Působení vyšších teplot – u několika druhů (např. Oenothera, Trifolium, Lycopersicon) došlo po působení vyšších teplot (do 60 ˚C) na pestíky k překonání inkompatibilní reakce.
5. Chirurgické metody – tyto metody jsou založeny na umístění pylu na řeznou plochu čnělky po odstranění blizny (např. u Brassica) nebo na zavedení pylu přímo do semeníku (Petunia). U petúnie bylo také úspěšné oplození in vitro nanesením pylu na placentu.
6. Opakované opylení – v některých případech je možné dosáhnout oplození tak, že za několik hodin po kompatibilním opylení naneseme na bliznu inkompatibilní pyl nebo použijeme pro opylení přímo směs pylu.

On-line prezentace

Ke kapitole Inkompatibilní systémy vyšších rostlin.