Genetika rostlin
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Geneticky modifikované rostliny

Za posledních 50 let se lidská populace více než zdvojnásobila, z 3 na 7 miliard. Do r. 2050 se předpokládá, že přibudou více než 2 miliardy lidí a to hlavně v rozvojových zemí. Přesto asi 1/5 lidí hladoví. Z toho vyplývá tlak na neustálé zlepšování vlastností kulturních plodin, které slouží k obživě, např. na vyšší odolnost k patogenům a abiotickým stresovým faktorům prostředí aj. Úkolem šlechtění je aplikovat neustále nové metody, jednak klasické, ale především biotechnologické a molekulární včetně genového inženýrství, které mají potenciál zajistit vyšší výnosy plodin. Současné šlechtění můžeme tedy charakterizovat jako období aplikace molekulárních metod a genetických manipulací. Někdy se hovoří o tzv. molekulárním šlechtění.

Teoretický výzkum problematiky související s genetickými modifikacemi (GM) zahrnuje modelové druhy, studium různých metod transformace, využívání různých konstruktů nebo identifikaci cílových genů u různých organizmů. Aplikovaný výzkum se zabývá např. studiem stupně exprese transgenů a optimalizací postupů vedoucích ke konečnému produktu využitelnému ve šlechtění nové odrůdy.

První zemí, která pěstovala transgenní plodinu pro komerční využití, byla Lidová republika Čína začátkem 90. let. Byl to tabák rezistentní k virům. V USA firma Calgene získala jako první povolení pro pěstování GM plodiny jako potravinu, bylo to rajče FlavrSavr se zpožděným dozráváním r. 1994. V následujících kapitolách budou popsány hlavní znaky, které jsou cílem genetických modifikací, a mechanizmy jejich dosažení.

Rezistence k herbicidům

Prvním šlechtitelsky významným úspěchem bylo vnesení transgenu pro odolnost rostlin vůči herbicidům. Plevel má významný negativní podíl na výši výnosů a kvality určité plodiny. Je to důsledek konkurence mezi plodinou a plevelem při získání výživných látek a světla, plevele jsou také zdrojem různých škůdců. Aplikace herbicidů je tedy nezbytná. Jsou to chemické látky, které narušují určité metabolické, biochemické procesy v rostlině a tím ji poškozují. Jsou pro rostliny toxické. Řada těchto procesů probíhá v chloroplastech a často je ovlivňována fotosyntéza.

Problémem využití herbicidů je selektivní eliminace jen plevele a nepoškození kulturní plodiny. To je klasickými přístupy vyřešeno jen v některých případech, jednoděložné vs. dvouděložné. Navíc řada herbicidů zatěžuje přírodní prostředí. Vyřešení tohoto problému nabízejí genetické modifikace. Využívají se herbicidy nové generace, které jsou sice velmi účinné, ale účinkují jen na rostliny, ne na živočichy, a rychle se v prostředí rozkládají, aniž by zanechávaly škodlivé zplodiny. Byly známy dříve, než byly vytvořeny účinné transgenní rostliny, ale nedaly se použít pro ochranu před zaplevelením, protože působily na všechny rostliny, tedy i na kulturní odrůdy, které mají chránit; jsou to herbicidy totální.

Teprve po vnesení transgenů pro necitlivost k těmto herbicidům do rostlinných genomů kulturních druhů jsou tyto účinné a bezpečné herbicidy k dispozici pro ošetřování transgenních plodin. V praxi to znamená, že místo několikanásobného postřiku různými herbicidy se rostlina ošetří tímto novým herbicidem jen jednou nejvýše dvakrát. Celkové množství herbicidu se snižuje, uspoří se peníze, lidská práce, sníží se produkce skleníkových plynů. Vše je prospěšné pro životní prostředí.

Herbicid zpravidla působí toxicky na jediný enzym, významný pro život rostlin. Např. glyfozát (chem. A-fosfinometylglycin) inhibuje syntézu enzymu EPSPS, glufosinát (chem. kyselina dialkylfosforná) inhibuje glutaminsyntetázu, chlorsulfuron (chem. sulfonylmočovina) inhibuje acetolaktátsyntázy (ALS), bromoxynil (chem. nitril) inhibuje fotosyntézu, fotosystém II.

Vlivem dalších herbicidů dochází k inhibici:

• mitózy prostřednictvím narušení organizace mikrotubul,
• buněčného dělení,
• syntézy celulózy v buněčné stěně,
• syntézy lipidů,
• transportu auxinů.

Existují tři hlavní mechanizmy, tzv. strategie dosažení rezistence rostlin k herbicidům transgenozí:

1. Transgen kóduje nadbytek cílového enzymu (proteinu), který je inaktivován herbicidem. Tato nadprodukce způsobuje, že část enzymu – proteinu zůstane aktivní. Nadprodukce může být dosaženo integrací více kopií genu nebo použitím silných promotorů.
2. Transgen kóduje odlišnou (modifikovanou, mutantní) formu enzymu, která není herbicidem inaktivována. Tento modifikovaný protein je funkční.
3. Transgen kóduje enzym, který rozkládá herbicid. Dochází k detoxifikaci herbicidu, jeho přeměně na méně toxickou formu, nebo jeho odstranění. Strategií je využívání detoxifikačních mechanizmů rostliny, tj. přirozených obranných mechanizmů rostliny vůči toxickým látkám. Je prozatím využívána v minimální míře.

Dále budou popsány tři nejdůležitější typy herbicidů a jim odpovídající transgeny, které se využívají.

Transgeny pro rezistenci k herbicidu glyfozátu

Glyfozát (A-fosfinometylglycin) je vyráběný pod technickým názvem Roundup. Mechanizmus poprvé využila firma Monsanto, USA. Herbicid je účinný vůči 76 ze 78 nejvýznamnějších plevelů, je to derivát glycinu.

Mechanizmus účinku herbicidu na rostliny

Herbicid blokuje aktivitu enzymu 5-enolpyruvát šikimát-3-fosfosyntázy – EPSPS. V rostlinách je to klíčový enzym, který syntetizuje aromatické aminokyseliny (fenylalanin, tyrosin, tryptofan), stavební kameny bílkovin. V případě inhibice enzymu se netvoří určité proteiny. Tento enzym netvoří živočichové, ale jen rostliny, bakterie a některé houby. Na živočichy nemá herbicid škodlivé účinky, živočichové získávají aromatické aminokyseliny v rostlinné potravě.

Dopad

Dochází k inhibici buněčného dělení, meristematické aktivity a růstu rostlin. Také je inaktivována syntéza auxinů, jako je kyselina indolyloctová (IAA), která má jako prekurzor indol – ten je inaktivován herbicidem.

Využívané strategie rezistence

Ze 3 výše uvedených strategií se testují 2 až 3, z toho 2 nejdéle. Jsou již vytvořené komerční odrůdy běžně využívané v polních podmínkách.

Strategie 2

Strategie zahrnuje využití genu z bakterií rezistentních ke glyfozátu, nejčastěji z Agrobacterium. Ke kódující sekvenci bakteriálního genu je připojen promotor 35S CaMV a sekvence pro chloroplastový transportní protein z Arabidopsis nebo petunie. Tím je zajištěn transport proteinu do chloroplastů, místa účinku enzymu.

Gen aroA ze Salmonella typhimurium je vložen mezi promotor a terminální sekvenci genu ocs Agrobacterium v Ti plazmidu. Transgen kóduje obdobný enzym EPSPS, který však není glyfosátem blokován. Vnesený gen je pouze variantou vlastního rostlinného genu. Je to způsobeno bodovou mutací, která vede k záměně aminokyseliny prolinu za serin. Funkce enzymu je zachována.

Z dvouděložných druhů je transgen využit např. u sóje, bavlníku, řepky olejky. U jednoděložných druhů – kukuřice – je konstrukt optimalizován. Mutantní gen EPSPS z kukuřice byl izolovaný z explantátových kultur, připojen promotor z rýže a sekvence pro chloroplastový transportní protein je také z kukuřice. Protein kódovaný transgenem je funkční, enzym není rozkládán herbicidem v důsledku mutace.

Geneticky modifikovaný bavlník tvoří již více než 80 % z celkové produkce (hlavně rezistence ke glyfozátu Roundupu). GM bavlna je šetrnější k životnímu prostředí, snižuje potřebu orby a kypření. Snižuje množství reziduí, která přetrvávají hluboko v půdě.

Strategie 1

Podařilo se selektovat buňky petúnie z explantátových kultur schopné růst v přítomnosti zvýšené koncentrace glyfozátu. Tato tolerance byla důsledek amplifikace příslušného genu pro enzym EPSPS v genomu petúnie až na 20 kopií. Enzym sám byl beze změny. cDNA byla použita k tvorbě transgenu a introdukována do rostlinného genomu pod řízením promotoru 35S CaMV. Sekvence EPSPS obsahovala vlastní transportní protein, který zajistil přenos do plastidů. Transgen má 40x vyšší aktivitu exprimovaného enzymu EPSPS a tolerance rostlin vůči aplikaci herbicidu glyfozátu postřikem je 2 až 4x vyšší.

Transgeny pro rezistenci k herbicidům typu fosfinotricinu

Fosfinotricin (4-hydroxy-methyl phosphinoyl-D,L-homoalanin) je známý také pod názvem glufosinát, komerční název Basta.

Účinek herbicidu

Tento herbicid blokuje enzym glutaminsyntázu, který zneškodňuje amoniak, který se tvoří při používání dusičnanů i dalšími cestami. Pokud je enzym inhibován, amoniakové ionty se kumulují na toxickou koncentraci, rostlina uhyne. Glutaminsyntáza přeměňuje L-glutamát na glutamin. Inaktivace glutaminsyntázy také způsobuje inhibici fotosyntézy. Oba účinky se působením herbicidu kombinují.

Strategie rezistence 3

Pro získání necitlivosti k tomuto herbicidu se používají dva transgeny, které oba pocházejí z běžné půdní aktinomycety Streptomyces. Jsou to geny bar a pat. Gen bar (bialaphos resistance) byl získán ze S. hygroscopicus a obdobný gen pat (phosphinothricin acetyltransferase) byl klonován ze S. viridochromogenes. Enzymy kódované těmito geny přeměňují herbicid na sloučeninu, která je netoxická jak pro rostliny, tak pro živočichy a rychle se rozkládá. Enzymy dodávají acetylové skupiny k aminoskupině alaninu fosfinotricinu a tak jej inaktivují.

Tento způsob rezistence byl vyvinut v Plant Genetic Systems (PGS) patřící firmě Hoechst. PGS později získalo AgrEvo. Strategie byla využita u řepky olejné a kukuřice. Gen bar se často využívá jako selektovatelný marker při inzerční mutagenezi k identifikaci a selekci transformantů.

Transgeny pro rezistenci k herbicidům typu sulfonylmočoviny

Herbicidy založené na sulfonylmočovině (např. sulfuron) působí jen na dvouděložné rostliny, a proto se již dříve používal k ošetřování kultur obilovin. Nyní se tyto možnosti rozšiřují i na transgenní dvouděložné rostliny. Toxicita herbicidů typu sulfonylmočoviny je podobně jako u glyfozátu záležitost biochemických drah tvořících aminokyseliny, které živočichové nedovedou syntetizovat. Proto herbicid nepůsobí na živočichy. Herbicid inhibuje enzym acetolaktátsyntázu, který se podílí na syntéze aminokyselin.

Strategie 2

Jako transgen se používá např. gen pocházející z mutantní linie rostliny Arabidopsis thaliana.

Rezistence k hmyzím škůdcům

Transgeny z Bacillus thuringiensis

V přírodě žijící bakterie druhu Bacillus thuringiensis produkují při vytváření spór bílkovinu toxickou pro některé skupiny hmyzu; především pro larvální stadia hmyzu Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera aj. Jednotlivé poddruhy a kmeny produkují proteiny s různým spektrem citlivosti ke hmyzím taxonům. Tento protein se nazývá δ-endotoxin. Dříve se kultury této bakterie vyráběly ve velkých objemech (u nás např. ve Slušovicích) a používaly se jako postřik kulturních plodin proti hmyzím škůdcům (ekologický insekticid).

Různé geny cry pro δ-endotoxiny nebo jen jejich části se užívají jako transgeny a prostřednictvím T-DNA jsou včleňovány do rostlinného genomu (existují i α, β, γ endotoxiny). Geny jsou lokalizovány na plazmidech, kde tvoří rodiny genů, kterých bylo identifikováno asi 500. Aby se však dostatečně projevily v rostlinném genomu, musely se metodami genového inženýrství upravit. V poslední době byla účinnost tohoto systému podstatně zvýšena a spektrum hmyzích řádů, na které působí, rozšířeno (Coleoptera, Lepidoptera, Diptera).

Účinnost transgenů byla obvykle dosti nízká. Příčinou byla především nestabilita mRNA v rostlinných buňkách. Původní geny byly proto modifikovány. Gen pro δ-endotoxin z B. thuringiensis var. tenebrionis byl znovu syntetizován tak, aby při zachování struktury výsledného proteinu bylo využito degenerovaných kodonů, vyskytujících se v rostlinném genomu nejčastěji. Takovýto gen byl vnesen do genomu bramboru a byla zjištěna vysoká rezistence k mandelince bramborové (Leptinotarsa decemlineata). Transgenní brambory mají vysokou odolnost k mandelince bramborové, jejich výnosové a jakostní parametry zůstávají stejné a mikrobiální populace na transgenních rostlinách se jen nepatrně liší od těch, které byly nalezeny na standardních odrůdách. U tabáku bylo dosaženo podstatného zvýšení proporce δ-endotoxinu v proteinech listů, jestliže byl protein směrován do chloroplastů. Nyní existuje transgenní kukuřice odolná proti zavíječi kukuřičnému (Ostrinia nubialis). Kukuřice odolná k zavíječi kukuřičnému MON810 se smí pěstovat ve všech zemích EU. Obdobně byl upraven také gen cryIA(b) pro rezistenci k motýlím škůdcům, který se vnášel do genomu rýže. Další geny jsou vhodné pro navození odolnosti vůči broukům nebo háďátkům.

Transgeny pro δ-endotoxin byly zavedeny také do genomu sóje, rajčete, brokolice, bavlníku a dalších kulturních rostlin. Na toxickou formu se endotoxin mění až ve střevu hmyzu, kde je zásadité prostředí a kde dochází k jejich vazbě se specifickými receptory.

Další mechanizmy rezistence rostlin k hmyzu směřují k využití transgenů rostlinného původu

Transgeny kódující syntézu antimetabolických proteinů, které narušují proces trávení u hmyzu

Inhibitory proteáz

Inhibitory proteáz jsou malé proteiny z různých rostlinných druhů, které inhibují proteázy v trávicím traktu hmyzu.

Např. inhibitory serinových proteáz mají dvě aktivní místa a inhibují trypsin a chymotrypsin. Tyto proteiny jsou hojné v semenech a zásobních orgánech některých druhů rostlin.

První gen, který byl identifikován a přenesen do genomu druhého druhu, je gen z Vigna savi, čeleď Fabaceae. Byl to gen pro inhibitor trypsinu. Účinkuje proti motýlům a dvojkřídlému hmyzu. Gen byl introdukován do genomu řepky, bramboru, rýže, pšenice, jahodníku, slunečnice, tabáku, rajčete, jabloně, salátu. Další gen ze sóje byl vnesen do genomu řepky, topolu, rajčete, bramboru, tabáku.

Gen pro inhibitor cysteinové proteázy z rýže byl vnesen do genomu topolu, měl inhibiční účinek vůči broukům.

Je však známo, že hmyz se může přizpůsobit těmto inhibitorům proteáz. Lepidoptera nebo Coleoptera mohou nadprodukovat proteázy nebo produkovat nové typy proteáz, které jsou necitlivé k inhibitorům. Proto je potřeba u transgenních rostlin využívat více typů inhibitorů proteáz současně, tedy více genů.

Inhibitory amyláz

V genomu fazolu existuje celá skupina genů pro proteiny, které jsou obsaženy v semenech a fungují jako inhibitory α-amylázy. Gen pro inhibitor α-amylázy má základní funkci při ochraně rostlin před hmyzem a navozuje rezistenci. Introdukcí genu do genomu hrachu byla sledována rezistence k některým broukům. Další geny s touto funkcí byly introdukovány z obilovin do tabáku.

Geny pro chitinázy

Hmyz obsahuje polysacharid chitin jednak v exoskeletu, ale také v peritrofní membráně. Aktivita enzymů chitináz (degradují chitin) tak může narušovat trávení hmyzu. V této oblasti nebyly zaznamenány výrazné výsledky; perspektivní je jejich využití v kombinaci s geny cry.

Rezistence k virům

Geny pro plášťové proteiny

Roku 1985 byla vyslovena hypotéza, podle které hostitel, u něhož dochází k expresi určitých sekvencí nukleových kyselin patogena, se může stát rezistentní k tomuto patogenu. Hypotéza byla poprvé potvrzena roku 1996 u tabáku. Transgenní rostliny s genem pro plášťový protein byly rezistentní k viru tabákové mozaiky. V současné době se projev transgenu pro plášťový protein považuje za obecně působící mechanizmus rezistence k odpovídajícímu viru. Zdrojem transgenů pro plášťové proteiny jsou viry.

V polních pokusech byly úspěšně testovány rostliny brambor, které jsou rezistentní k viru X. Další pokusy se provádí s rezistencí k viru Y a viru svinutky listů brambor. Přítomnost bílkoviny v rostlinné buňce působí odolnost proti tomu typu viru, z něhož pochází gen, a proti virům příbuzným. Plášťový protein je zabudován do buněčné stěny rostliny a brání vniknutí dalších virových částic se stejným plášťovým proteinem. Stupeň rezistence závisí na konstrukci chimérického genu a na místě začlenění v rostlinném genomu.

Výsledky

• Brambor – PVX, PVY, virus X a virus Y, PLRV
• Vojtěška – AIMV virus mozaiky vojtěšky
• Rajče – TGMV virus zlaté mozaiky rajčete
• Pšenice – BYDV virus zakrslosti ječmene
• Rýže – RTSV, RSV, RYMV
• Virus mozaiky okurku
• Papája – PRSV potyvirus
• Podzemnice olejná – TSWV

Virus kóduje kromě plášťového proteinu také protein, který umožňuje pohyb a replikázu. Od toho jsou odvozeny další strategie.

Rezistence k proteinu pro pohyb

Při použití transgenů pro defektní proteiny pohybu docházelo k omezení pohybu TMV uvnitř rostliny. Defektní proteiny se hromadí v plazmodezmatech, kterými se virus v rostlině pohybuje. Transgenní rostliny tabáku, které obsahují defektní protein přenosu TMV, jsou rezistentní nejen k TMV, ale i k CaMV a AMV.

Rezistence založená na antimediátorových konstruktech

Dlouho se nedařilo získat rezistenci k virům pomocí antimediátorových konstruktů transgenů. Antimediátorová RNA vzniká transkripcí DNA, která je komplementární ke kódující genové sekvenci. V současné době jsou pouze v některých případech pro získání rezistence k rostlinným virům účinné transgeny kódující antimediátorovou RNA k rostlinným virům. Tak je tomu např. u potyviru – viru žluté mozaiky bobu (BYMV), nebo u geminiviru – viru zlaté mozaiky rajčete. U tabáku a bramboru byl jako transgen využit gen pro antivirový protein z Phytolacca americana. Tento protein působí rezistenci k virovým infekcím obecně.

Další mechanizmy

Byly popsány transgenní rostliny bramboru, které ve svém genomu mají krysí gen pro 2-5 oligoadenyl syntetázu a které jsou rezistentní k viru X bramboru více než transgenní rostliny s genem pro plášťový protein tohoto viru. Enzym úzce souvisí s interferonovým systémem savců. Interferony jsou specifické proteiny, vylučované savčími buňkami při virové infekci, při proliferaci buněk a imunitních procesech. Indukují syntézu dalších proteinů, které vedou k inhibici množení virů. Jedním z těchto proteinů je právě 2-5 oligoadenylát synthetasa.

Plášťové bílkoviny a příslušné geny denně konzumujeme ve velkých kvantech, protože mezi rostlinami v naší stravě jsou i rostliny virózní. Konzumujeme plášťový protein, ale i virovou RNA, které v transgenní rostlině budeme ušetřeni.

Rezistence k bakteriálním chorobám

Geny pro PR proteiny

• typu glukanáz
• typu chitináz

Jsou to enzymy, které degradují polymery buněčné stěny mnoha mikroorganizmů, neškodí rostlině, ani jiným živočichům.

Zdrojem genů jsou:

• rostliny – rýže, ječmen. Gen pro chitinázu z rýže byl introdukován do genomu okurky – rezistence k Botrytis cinerea,
• bakterie – Serratia marcescens – extracelulární i intracelulární formy enzymů,
• houby – Trichoderma harzianum Zvýšená tolerance tabáku a ječmene k Rhizoctonia solani.

Ke kódujícím sekvencím se přidávají promotory 35S CaMV.

Geny pro antimikrobiální proteiny

Mnoho genů kóduje proteiny s antihoubovým a antibakteriálním účinkem.

• Gen pro lysozym z bakteriofága T4 – který narušuje buněčné stěny bakterií, enzym narušující chitin a peptidoglykany. Byl využit jako transgen a začleněn do genomu bramboru, zde působí vysoký stupeň rezistence k Erwinia carotovora.
• Účinné jsou transgeny pro některé toxické proteiny jiných rostliných druhů. Např. exprese genu pro thionin ječmene v genomu tabáku vede ke zvýšení rezistence k bakteriálním patogenům, např. Pseudomonas syringae.
• Transgen pro rezistenci k tabtoxinu z Pseudomonas syringae patovar tabaci působí rezistenci tabáku k tomuto patogenu.
• Geny pro defenziny – proteiny identifikované v živých buňkách, aktivují obranné mechanizmy – vážou se na mikrobiální plazmatickou membránu a mají lytickou aktivitu.
• Gen alfAFP pro defenzin z vojtěška do bramboru – defenzin se hromadí v extracelulárních prostorách listů a kořenů. Výsledkem je rezistence k houbě Verticillium dahlia.

Geny pro indukci hypersenzitivní a systémové rezistence

Jako transgeny se využívají rasově specifické geny (R geny), které byly identifikovány, např. z genomu rýže a Arabidopsis. Gen Pto s 35S promotorem byl vnesen do rajčete. Aktivuje se inkompatibilní interakce mezi produktem genu R (Prf) a produktem Avr genu (AvrPto) patogena, protein PTO působí jako prostředník pro zprostředkování této interakce. Aktivuje se signalizační kaskáda, výsledkem je aktivace transkripčních faktorů pro geny PR – dochází k hypersensitivní reakci rostliny, aktivací kyseliny salicylové se signál šíří po rostlině a indukuje se systémová rezistence. Rostliny jsou rezistentní k patogenu Pseudomonas syringae f. sp. tomato.

Složení zásobních látek

Oleje

Celková produkce rostlinných olejů ve světě se odhaduje na 100 mil. tun ročně. Hlavní 4 kulturní plodiny pro produkci olejů jsou sója (Kanada a USA), palma olejová, řepka olejná a slunečnice. Oleje slouží k přímé konzumaci člověkem a zkrmování zvířaty, jednak pro různé průmyslové využití. Rostlinné oleje jsou triglyceridy mastných kyselin. To znamená, že tři mastné kyseliny jsou esterifikovány třemi hydroxylovými zbytky glycerolu. Ve všech případech je podstatné složení mastných kyselin.

Základní výstavba mastných kyselin se děje v chloroplastech, kde dochází ke skládání jednotek obsahujících dva uhlíky do řetězců obsahujících 16 až 18 uhlíků. V jedlých olejích převažují mastné kyseliny, které mají 18 uhlíků a 1 až 3 dvojné vazby. Olejové kyseliny se charakterizují čísly, z nichž první udává počet uhlíků a druhé počet dvojných vazeb. Někdy se také ještě uvádí, ve kterých polohách se nacházejí dvojné vazby. Tento údaj se píše před obě čísla. Mastné kyseliny bez dvojných vazeb jsou nasycené, s dvojnými vazbami nenasycené. Zápis tedy vypadá např. takto: 18:1, což označuje kyselinu olejovou s 18 atomy uhlíku a jednou dvojnou vazbou.

Kyselina	Počet uhlíků : počet dvojných vazeb
laurová	12:0
palmitová	16:0
stearová	18:0
olejová	18:1
linolová	18:2
linolenová	18:3
eikosenová	20:1
eruková	22:1

Hlavním prekuzorem všech olejových kyselin je kyselina palmitová. Ke vzniku dalších mastných kyselin dochází dvěma cestami:

1. prodlužování uhlíkatého řetězce
2. desaturace, kterou vznikají mastné kyseliny s jednou, dvěma nebo třemi dvojnými vazbami.

Pro potravinářské účely je žádoucí, aby v olejích převažovaly nenasycené mastné kyseliny s jednou dvojnou vazbou a se středním (16–18) počtem uhlíků (především 18:1). Hlavním cílem je snížení obsahu kyseliny erukové 22:1 a linolenové 18:3 a zvýšení obsahu kyseliny olejové.

Dvě prozatím nejpozoruhodnější linie s modifikací poměru mastných kyselin v olejích semen byly uvedeny do polních pokusů v letech 1993–94 firmou Calgene. Řepka obsahuje v olejích semen 1–2 % kyseliny stearové a méně než 0–1 % kyseliny laurové.

Obohacení mastné kyseliny dvojnou vazbou se uskutečňuje prostřednictvím enzymu desaturáza, Např. v 18 uhlíkovém řetězci delta⁹ desaturáza dodá na 9 uhlík dvojnou vazbu za vzniku 18:1. Kyselina olejová se může zvýšit až na koncentraci větší než 90 %. Toho bylo využito u řepky. Podobně u sóje bylo dosaženo obsahu kyseliny olejové 22 až 79 %.

Omega-3 desaturáza byla nejdříve identifikována pozičním klonováním u Arabidopsis. Gen byl použit k izolaci homologních genů z dalších organizmů, a ty pak byly využity ke genetickému inženýrství nesaturovaných (nenasycených) matných kyselin u rostlin.

Existují linie s obsahem 40 % kyseliny stearové a s obsahem 40 % kyseliny laurové v olejích semen. Odrůda s vysokým obsahem kyseliny laurové byla již v roce 1995 v USA uvolněna pro komerční využití. Byl zde využit antisens konstrukt pro delta⁹ desaturázu. Způsobilo to snížení enzymu desaturázy a snížení tvorby olejové kyseliny (18:1) na 1–2 % a zvýšení stearové až na 40 %. Tyto typy olejů jsou vhodné pro průmyslové využití.

Jsou i další linie novošlechtění, z nichž každá obsahuje jeden transgen, který mění obsah mastných kyselin v olejích semen. Odrůda s vysokým obsahem kyseliny laurové (12:0) obsahuje gen pro lauroyl-ACP thioesterázu z genomu jiné rostliny. Tento enzym způsobuje předčasné ukončení řetězce a hromadění mastných kyselin C₁₂ (kyseliny laurové) místo C₁₈ (kyseliny stearové a olejové). Oleje s převahou kyseliny laurové jsou využitelné hlavně pro výrobu mýdel a detergentů ale také v cukrářských tucích a náhražkách mléka. Odrůda s vysokým obsahem kyseliny stearové obsahuje antisense kopii genu pro stearát desaturázu z řepky. Tato antimediátorová genová konstrukce inhibuje projev genu pro stearát desaturázu, což vede k hromadění olejů s nadbytkem kyseliny stearové (18:0), protože je blokována její desaturace na kyselinu olejovou. Olej s vysokým podílem kyseliny stearové je zvláště vhodný pro výrobu margarinu.

Výjimku tvoří kyselina γ-linolenová, která má příznivé vlivy na léčení atopického exému kojenců, snižování alergie, snižování obsahu cholesterolu v krvi a další parametry. Vyskytuje se ale převážně jen ve speciálních typech olejů (z pupalky, brutnáku, jader černého rybízu). Bylo dosaženo přeměny kyseliny linolenové v γ-linolenovou. Přeměna se uskutečňuje prostřednictvím enzymu delta⁶ desaturázy. Gen pro tento enzym byl klonován z genomu sinice Synechocystis, upraven a pokusně přenesen do genomu tabáku. V semenech docházelo k syntéze kyseliny γ-linolenové; cílem je obohacení oleje řepky o tuto kyseliny.

Obsah ligninu

Genetické modifikace u stromů jsou zaměřeny na nízký obsah ligninu ve dřevu, aby bylo vhodnější pro výrobu papíru. Ročně stojí odstraňování ligninu ze dřeva 20 miliard dolarů. Gen zodpovědný za tvorbu ligninu byl nalezen a pracuje se na jeho vyřazení z funkce u vybraných druhů stromů. Geneticky modifikované osiky mají o 45 % méně ligninu a zároveň rychleji rostou. Hledají se geny, které by zabránili GM stromům produkovat pyl a zabránilo se tak hybridizaci GM a normálních stromů. Tím by se také ulevilo lidem alergickým na pyl. Je snaha o rozluštění genetického kódu stromů; za vhodného kandidáta byl vybrán topol Populus balsamifera (genom 550 Mb). Pro srovnání, borovice Pinus taeda má genom velký 20 000 Mb, její genom je také sekvenován.

V roce 1994 se podařilo transgenozí dosáhnout změn složení lipidů. Do genomu tabáku byla vnesena antisens konstrukce, která inaktivuje geny pro cinnamyl alkoholdehydrogenázu, enzym katalyzující poslední krok biosyntézy prekursoru ligninu. Lignin byl pak pozměněn ve složení i struktuře a byl přístupnější chemické extrakci. Xylemová pletiva měla červenohnědou barvu. Genová konstrukce vnesená do genomu osiky podmiňuje červenohnědou barvu dřeva jako nový, nábytkářsky dobře využitelný znak podmíněný transgenozí.

Zásobní bílkoviny semen

Manipulace se spektrem zásobních bílkovin semen se provádí se dvěma praktickými cíli:

1. Optimalizace spektra aminokyselin v zásobních proteinech semen. Semena rostlin, zvláště luskovin a obilovin, slouží k potravinářským a krmivářským účelům, ale z hlediska složení aminokyselin nejsou plnohodnotná. Semena luskovin mají nedostatek methioninu a cysteinu, obilninám chybí lysin a methionin. Cílem genových manipulací je doplnit zásobní proteiny semen o typy, které obsahují nadbytek těchto aminokyselin.
2. Ve specifických případech je výhodné, aby byly do genomu vneseny geny pro další proteiny, které by mohly být ukládány podobně jako zásobní proteiny, protože jsou v této formě snadno extrahovatelné a využitelné např. farmakologicky.

Proteiny semen Brassica napus jsou významné z hlediska vyváženého, plnohodnotného složení aminokyselin, protože pokrutiny zbylé ze semen řepky po extrakci olejů se používají jako krmivo. Proteiny semen řepky mají nedostatek aminokyselin lysinu a methioninu. Byl klonován gen pro zásobní protein semen z Bertholetia excelsa (paraořech). Tento albumin 2S obsahuje vysoký podíl methioninu. Jeho gen, i s původním promotorem, byl vnesen do genomu řepky. V semenech dochází k expresi transgenu a tím ke zlepšení složení aminokyselin v jejich proteinech.

Stejný gen, ale pro protein legumin Vicia faba, byl včleněn také do genomu Vicia narbonensis a projevoval se v semenech této vikvovité rostliny, v nichž se trojnásobně zvýšil obsah methioninu.

Trvanlivost plodů rajčat

Existují dva typy transgenních rajčat. První typ jsou rajčata s genem flavr savr, izolovaným z cv. Caligrande. Později byl využit syntetický transgen. Gen řídí tvorbu antimediátorové-RNA, která blokuje tvorbu (vyřazuje z činnosti normální gen rajčat) polygalakturonidázy. Polygalakturonidáza je enzym, který se podílí na poslední fázi zrání plodů. Způsobuje rozklad pektinů ve středních lamelách buněčných stěn. Tento gen se do rajčat vnášel proto, že se předpokládalo, že aktivita enzymu způsobuje měknutí plodů. Zjistilo se, že tomu tak není, že ztráta aktivity enzymu sice měknutí plodů nezabrání, zabrání však do značné míry kažení plodů a plody získají lepší chuťové vlastnosti. Obchodní skladovatelnost se prodloužila z 1 až na 2 až 3 týdny.

Druhý gen, který byl do dědičného základu rajčat vnesen, aby zlepšil vlastnosti plodů, je opět syntetický gen, který zamezuje expresi jednoho z genů pro syntézu etylénu. Etylén je plynný rostlinný hormon. Signál zprostředkovaný etylénem spouští mimo jiné kaskádu procesů, které vedou ke zrání plodů. Pokud se v průběhu vývoje plodů etylén v příslušnou dobu netvoří, plody nečervenají a nedozrávají a zůstávají na keřích velké a zelené. Je možno je pak sklidit všechny najednou, bez poškození je transportovat a ještě po transportu delší dobu skladovat. Jestliže mají dozrát, dají se do kontejneru, do kterého se vpustí etylén. Ke spotřebiteli se pak dostanou plody v optimální kvalitě, čerstvě dozrálé a nepoškozené.

Tato rajčata byla uvolněna do americké prodejní sítě k 1. 6. 1994. Bylo prokázáno, že zbytky příslušné DNA i bílkoviny nejsou dieteticky závadné.

Hormon etylén vyžaduje specifické receptory pro citlivost a přenos signálu po směru reakce. Nově byly genetické manipulace biosyntézy etylénu zaměřeny na identifikaci genu kódujícího tento specifický receptor. Gen Etr1-1 kóduje mutovaný receptor, který kóduje dominantní necitlivost k etylénu u A. thaliana, a způsobuje významné zpoždění ve zrání plodů u rajčete a petúnie.

Pylová sterilita

Praktický význam pylové sterility v klasických šlechtitelských postupech spočívá především v nuceném cizosprášení pro produkci heterózního osiva. Při tvorbě transgenních odrůd je často požadavek, aby transgen nebyl přenášen pylem, tedy požadavek pylové sterility. Pylová sterilita využitelná ve šlechtění (jaderně cytoplazmatický typ s obnoviteli fertility) neexistuje u všech odrůd kulturních rostlin a je tedy žádoucí, aby transgenoze přinesla široce využitelné systémy. Takovéto systémy jsou v současné době asi čtyři.

První systém využívá chimérického genu pro barnázu z Bacillus amyloliquifaciens. Barnáza je extracelulární vysoce aktivní nukleáza této bakterie, která degraduje jak RNA, tak DNA. Je syntetizována jako neaktivní pre-proenzym, k jehož jedné úpravě dochází při opuštění bakteriální buňky a odstranění signálního peptidu, a potom teprve vně bakteriálních buněk ke druhé úpravě a vzniku aktivního enzymu. V bakteriálních buňkách současně existuje vnitrobuněčný inhibitor, protein barstar, který má 89 aminokyselin. Příslušný gen byl rovněž klonován. Upravený zkrácený gen pro barnasu (zbavený sekvencí, jež jsou u vzniklého proteinu upravovány) byl zařazen za promotor specifický pro tapetovou vrstvu buněk tabáku (označen TA29) a vnesen transgenozí do genomu tabáku a řepky olejné. Tím způsobil selektivní destrukci tapetových buněk prašníků a následně degeneraci pylových zrn. Stejný vliv měl i chimérický gen pro ribonukleázu T1 z Aspergillus oryzae s promotorem TA29. Pokud se použije obdobným způsobem v jiné transgenní linii gen barstar se stejným promotorem, pak tato linie může působit obdobně jako obnovitel fertility při klasické cytoplazmaticko-jaderné pylové sterilitě.

Jaderně podmíněná pylová sterilita byla získána u Petunia hybrida blokádou syntézy flavonoidů v prašnících, která vedla k předčasnému zastavení vývoje pylu. Bylo toho dosaženo jednak transgenozí jednak antisens genem a jednak kosupresí, tedy vnesením transgenu pro chalkonsyntázu, jehož přítomnost vedla k potlačení vlastního genomového genu pro chalkonsyntázu. Tento enzym katalyzuje první krok syntézy prekurzorů flavonoidů. K obnovení fertility byly flavonoidy aplikovány na bliznu nebo jako příměs pylu.

Třetí systém byl zatím použit pouze u tabáku. Pylové sterility tam bylo dosaženo expresí genu rolC Agrobacterium rhizogenes řízeného promotorem 35S. Exprese genu však vedla k morforegulačním změnám. Fertilita byla obnovena expresí genu pro antisens RNA u F₁ hybridů.

Čtvrtý systém byl rovněž využit u tabáku. Je to inducibilní systém destrukce specifických rostlinných pletiv. Je založen na aktivitě genového produktu genu E. coli argE, který mění netoxickou látku N-acetyl-fosfinotricin na herbicid fosfinotricin. U rostlin, které nesou tento gen, k jehož expresi dochází specificky v tapetálních buňkách prašníků, je tvorba pylu blokována po postřiku rostlin netoxickou koncentrací N-acetyl-fosfinotricinu.

Nové typy rostlin

Rýže s provitaminem A

Hlavní potravina asi pro 4 miliardy lidí je rýže. Hlavním problémem především v chudých zemích je nedostatek vitamínu A. Symptomem nedostatku je šeroslepost až úplná slepota. Uvádí se, že asi 124 mil. dětí má nedostatek vitaminu A, slepota postihuje až 0,5 mil. dětí ročně. Proto je snaha obohatit rýži o β karoten = provitamin A. Prostřednictvím genetických modifikací byla provedena introdukce tří genů do genomu rýže, jejichž exprese vedla k tvorbě provitaminu v endospermu.

Byly to geny psy (phytoen syntáza) z narcisu s promotorem specifickým pro endosperm, ctrl (karoten desaturáza) z bakterie Erwina a gen lcy pro enzym lykopen β-cyklázu. Tato modifikovaná rýže má žlutooranžovou barvu, proto se jí říká zlatá rýže. Další modifikace u rýže má za cíl zvýšit obsah železa.

Řepka olejná a sója se zvýšeným obsahem vitaminu E

Arabidopsis hraje důležitou roli i při odhalování genů, které mají příznivý dopad nenutriční kvalitu plodin. Cestou pozičního klonování genů u A. byl identifikován gen VTE3 kódující syntézu enzymu 2-metyl-6phytylbenzoquinol methyltransferázy, který je součástí biosyntézy vitaminu E. Gen pro tento enzym byl dlouho hledán, protože se předpokládalo, že přeměňuje delta-tokoferol na více biologicky aktivní γ-tokoferol. Delta-tokoferol se akumuluje v relativně vysoké koncentraci u sóje a dalších olejnin. Transgenní rostliny sóje s exprimovaným genem VTE3 během tvorby semen již neakumulují delta-tokoferol, tak zlepšují nutriční hodnotu sójového oleje. Koexprese VTE3 a Arabidopsis gamma-tokoferol metyltransferázy VTE4 v semenech způsobuje 100% akumulaci alpha-tokoferolu, který je biologicky nejvíce aktivním tokoferolem. Tak introdukce dvou genů Arabidopsis zlepšuje nutriční kvalitu sójového a řepkového oleje ve srovnání se standardem.

Kávovník s bezkofeinovými boby

Brazilskými vědci byly identifikovány rostliny kávovníku Coffea arabica téměř bezkofeinové (3 keříky z 3000) v důsledku spontánních mutací. Problém se řeší efektivněji genetickými modifikacemi. Pěstují s již rostliny, kterým chybí klíčový gen pro tvorbu kofeinu, a produkují o 50 až 70 % méně této látky. Toto snížené množství je i v zrnkách budoucí kávy. Podařilo se tak vytvořit produkt, který má srovnatelné množství kofeinu jako u produktů, u nichž je kofein odstraňován fyzikálními metodami. Alkaloid kofein se extrahuje ze zrn organickými rozpouštědly nebo kysličníkem uhličitým. První způsob je levný, ale používaná rozpouštědla jsou karcinogenní, a v kávě mohou zůstat stopy rozpouštědla. CO₂ je neškodný, ale aby se z plynu stalo rozpouštědlo, je třeba jej zkapalnit a zchladit. Celý proces je energeticky a technologicky náročný a výsledný produkt se prodražuje. Často se odstraňují i žádoucí aromatické látky.

U GM plodiny je káva bez kofeinu bez jakýchkoliv vedlejších nákladů. Kávovníkové keře se sníženým obsahem kofeinu patří ke kávovníku Coffea canephora. Na tvorbě kofeinu v rostlinách se podílí tři enzymy. Genetická modifikace je založena na zabránění exprese jednoho genu

Odolnost vůči stresovým faktorům

Je známo několik typů transgenů, které zvyšují odolnost rostlin k suchu a k nízkým teplotám. Jeden z nich je gen SacB z Bacillus subtillis. Tento gen kóduje enzym levansukrázu, který podmiňuje syntézu a akumulaci fruktanů. Transgen má promotor 35S a jeho kódující sekvence navíc signální sekvenci pro přenos enzymů do mitochondrií. Fruktany jsou molekuly polyfruktózy, které jsou produkovány některými bakteriemi a některými rostlinami. Rostlinné fruktany se skládají z 10–200 molekul fruktóz bakteriální mohou být ještě podstatně větší. Jsou rozpustné, mají schopnost depolymerace a opětné polymerace a tím ovlivňují stabilitu osmotické hodnoty při suchu a nízkých teplotách. Gen SacB, vnesený do genomu tabáku, zvyšuje toleranci k suchu. Zvýšenou toleranci k suchu podmiňuje také vnesení upraveného bakteriálního genu pro cholindehydrogenasu do rostlinného genomu. Tento enzym podmiňuje syntézu glycin betainu, což je rovněž osmotikum, které zvyšuje odolnost k suchu. Transgenní tabák je tak schopen růst na médiu s vysokým obsahem chloridu sodného.

Zajímavou skupinu transgenů tvoří geny pro metalothioneiny. Jsou to živočišné proteiny, které mají schopnost pevně vázat některé toxické těžké kovy, jako např. kadmium, olovo, rtuť. Cílem praktického využití transgenních rostlin s těmito geny je získat rostliny, které by sloužily jako „odpadní koše“ a čistily půdu při rekultivacích.

Rezistence k chladu a suchu

K odstranění oxidativního stresu se využívá antioxidantů, genů, kódujících látky enzymatické i neenzymatické povahy, které mají schopnost odstraňovat kyslíkové radikály. Příkladem je superoxiddizmutáza; gen z tabáku byl vnesen do genomu vojtěšky.

Odolnost vůči dehydrataci je možné řešit prostřednictvím změn ve složení lipidů plazmatické membrány. Trstuje se gen izolovaný ze sinice a změny ve spektru mastných kyselin prostřednictvím enzymu delta-desturázy, který tento gen kóduje. Dochází k menším ztrátám vody.

Geny pro fruktany jako osmoprotektanta se využívají k ochraně enzymů a membrán před poškozením.

Rezistence k zasolení – je známo, že v rostlinách je protein, který vychytává sůl a ukládá ji v oddělených kompartmentech uvnitř rostlinných buněk. Pokud je soli hodně, bílkovina nestačí všechnu sůl zabudovat a volná sůl přítomná v rostlině naruší normální biochemické pochody v buňkách, a rostlina usychá. Bylo vytvořeno geneticky modifikované rajče, které vytváří více proteinu transportujícího sůl, a to rostlině dovoluje růst a produkovat plody i v případě, že je zalévána 50x slanější vodou než je běžné. Rajče odolává vodě, která obsahuje třetinu solí vody mořské. . Gen byl získán z arabidopsis – AtNHX1.

Rajče je obecně považováno za citlivé k chladu. Stejně jako u arabidopsis konstitutivní exprese transkripčního faktoru CBF1 (C-repeat/dehydratation response element binding factor 1) z rodiny AP2/EREBP způsobuje zvýšenou toleranci k chladu, oxidativnímu stresu a vodnímu deficitu u rajčete a řepky olejky.

Tvorba protilátek

V živočišných organizmech jsou protilátky důsledkem variability základních proteinů – imunoglobulinů. Molekula imunoglobulinu je tvořena ze čtyř polypeptidových řetězců, ze dvou těžkých řetězců o stejné primární struktuře a ze dvou lehkých řetězců. Těžké řetězce obsahují asi 430 aminokyselinových zbytků a lehké asi 214. Molekula imunoglobulinu je tvořen pohromadě bisulfidickými vazbami. Každý řetězce sestává ze dvou základních oblastí:

• konstantní oblasti (C). To je úsek, který se vyznačuje relativně neměnnou sekvencí aminokyselin.
• variabilní oblasti (V). To je úsek, kterým se imunoglobuliny příslušného typu těžkého nebo lehkého řetězce navzájem liší.

Variabilní oblast každého řetězce je složena ze tří hypervariabilních úseků a čtyř úseků základní struktury. Hypervariabilní úseky jsou na rozdíl od úseků základní struktury značně proměnlivé a tvoří vazebná místa pro antigen. Specifita imunoglobulinu vzhledem k antigenu je tedy podmíněna primární strukturou variabilní oblasti. Část konstantní oblasti těžkého řetězce je flexibilní a svou flexibilitou usnadňuje vazbu antigenu k imunoglobulinu.

Úplná molekula IgG má tvar písmene Y a má mnoho nezávislých domén. U člověka je 5 základních typů těžkých řetězců, které se dělí na další podtypy. Podle toho, jaký typ nebo podtyp těžkého řetězce se v molekule imunoglobulinu vyskytuje, zařazujeme ho do jedné z pěti tříd:

1. IgG se nacházejí jako protilátky v séru,
2. IgM se vyskytují jako receptory na povrchu B-lymfocytů,
3. IgA se vyskytují ve slinách,
4. IgD působí jako receptory v nezralých lymfocytech,
5. IgE se vyskytují při parazitární imunitní odpovědi.

V průběhu zrání B lymfocytů dochází k častým rekombinacím v hypervariabilních oblastech a to vede k velké variabilitě imunoglobulinů. Monoklonální protilátky obsahují jen jeden typ imunoglobulinů. Teoreticky může vzniknout nejméně 500 milionů kombinací. Geny pro monoklonální protilátky je možno vnést do rostlinného genomu. Nemusí obsahovat celý lehký a celý těžký řetězce, ale jen jejich variabilní oblasti (Fab – antibody binding fragment). Využití transgenních rostlin pro produkci monoklonálních protilátek bylo poprvé publikováno v r. 1989. Pro produkci celé protilátky je třeba vnést do rostlinného genomu gen pro lehký řetězec i gen pro těžký řetězec. Oba mohou být na jednom úseku exogenní DNA (jedné T-DNA) nebo mohou geny pro lehký a těžký řetězec existovat ve dvou různých transgenních liniích a ke vzniku protilátky dojde až po zkřížení obou linií.

IgG jsou vylučovány do mezibuněčných prostor. Zmenšené deriváty těchto proteinů však jsou lokalizovány v cytoplasmě. Úseky, které jsou schopny vázat antigeny, tvoří jen malou část celé molekuly. K imunitní odpovědi stačí, aby rostlinné buňky syntetizovaly tyto úseky (domény Fv). Dalším zjednodušením je, že tyto domény se skládají jen z jednoho řetězce, místo obvyklých dvou scFv (single chain Fv). Tyto scFv fragmenty jsou velmi malé a odpadají problémy spojené se vzájemným připojením obou velkých molekul řetězců. Gen pro scFv je syntetická sekvence DNA, která kóduje variabilní lehkou a variabilní těžkou doménu. Obě jsou spojeny vazebnou sekvencí a tvoří malý polypeptid (asi 28kDa). Tyto scFv mohou být dále modifikovány. Například dva různé scFv mohou být spojeny. Tyto fragmenty mohou být použity proti některým regulačním proteinům rostlinných buněk, nebo proti rostlinným patogenům, např. virovým proteinům.

Předpokládá se, že rostliny budou zdrojem nejlacinějších protilátek. Bylo prokázáno, že rostliny budou vhodné pro pasivní imunizaci spočívající v pojídání transgenních rostlin obsahujících fragmenty protilátek. Protilátky, využitelné v průmyslu mohou být ukládány v semenech rostlin a tam dlouhodobě skladovány, dokud nebudou izolovány.

Prvním příkladem produkce funkční protilátky rostlinou (tabák) byl myší imunoglobulin IgG1. Tvorba protilátky se skládala ze dvou kroků. V 1. kroku byly vytvořeny dvě transgenní linie tabáku vždy s jedním genem pro těžký nebo pro lehký řetězec. V 2. kroku byly kříženy dvě rostliny produkující odlišný řetězec a byl vytvořen hybrid mající v genomu oba geny a produkující kompletní protilátku v listech, kde byla součástí proteinů (1,3 %).

Protilátky proti Streptococcuc mutans, původci zubního kazu, působí průkazně proti této bakterii. Protilátky rozpoznávají streptokokový antigen a brání kolonizaci patogena v ústní dutině. Ke genetické modifikaci byl použit tabák. Do jedné linie rostlin tabáku byl introdukován gen pro těžký řetězec, do druhé gen pro lehký řetězec. Kompletní protilátky produkovaly hybridní rostliny získané křížením obou typů rostlin

V roce 1999 firma Monsanto vyprodukovala rostlinné protilátky proti herpesvirům. Pokusným objektem byla sója. Byly získány čtyři typy rostlin, které produkovaly H řetězec, L řetězec, J (joining, nezbytný pro tvorbu dimerů) řetězec a sekreční komponentu. Teprve křížením jednotlivým rostlin byl vytvořen čtyřnásobný hybrid produkující kompletní protilátku.

V roce 1999 byla také publikována zpráva, že byla vytvořena rostlinná terapeutická vakcína, která je schopna bránit růstu experimentálně udržovaných nádorových buněk myši (non-Hodgins lymphoma cells). U laboratorní myši docházelo k uzdravení 80 % zvířat, při čemž v kontrolním vzorku všechny myši do tří týdnů umíraly. Vakcína proti této chorobě existuje, produkuje se biotechnologicky savčími buňkami v kultuře a je velice drahá. Produkce rostlinnými buňkami je mnohem levnější a je naděje, že bude možno využít rostlinné vakcíny k léčení některých nádorových onemocnění u lidí.

Rostlinné vakcíny

Transgenní rostliny mohou produkovat proteiny, které jsou vlastní lidským patogenům, napadajícím epiteliální membrány. Jedná se o bakterie a viry, způsobující nachlazení, ale také ty, které jsou přenášeny kontaminovanými potravinami nebo pohlavním stykem. Vakcíny, účinné proti těmto infekcím, stimulují mukózní imunitní systém k produkci imunoglobulinů IgA (S-IgA). Tato imunitní odpověď vzniká v buňkách epitelu respiračního a trávicího traktu. K imunizaci dochází pojídáním čerstvé zeleniny nebo jiných rostlinných produktů. Transgenní rostliny, u nichž v jedlých pletivech dochází k produkci antigenů, mohou být využívány jako levné "potravinové vakcíny". Zatím byly USA patentovány některé transgeny, využitelné v rostlinách jako vakcíny. Prozatím se počítá s jejich využitím v rostlinách tabáku a bramboru, perspektivně banánů, jahod, salátu, ředkviček, mrkve, rajčat atp. Jsou to zejména tyto transgeny:

1. Protein spaA ze Streptococcus mutans. Tato bakterie se vyskytuje v ústní dutině člověka a je hlavní příčinou zubních kazů. V listech transgenního tabáku její uvedený protein tvoří asi 0,02 % proteinu listů.
2. Povrchový antigen hepatitis B (HBsAg). Hrubý extrakt listů tabáku obsahuje 0,01 % tohoto proteinu z celkového množství proteinů listů. Byl použit k  imunizaci myší a vyvolával imunitní reakci.
3. Termolabilní enterotoxin B z E. coli a podjednotka B toxinu cholery. V zemích třetího světa se občas objevuje nakažlivé průjmové, někdy smrtelné onemocnění, způsobené některými kmeny E. coli. Enterotoxin (LT) z E. coli je multimerní protein, který je strukturně, funkčně i antigenními vlastnostmi podobný toxinu cholery (CT). U myší byl prokázán imunitní charakter transgenních rostlin tabáku a bramboru.

Farmakologicky využitelné vzácné proteiny

K hlavním úspěchům genového inženýrství již v letech 1980–1990 patřilo, že byly klonovány geny pro lidský inzulin, interferon a růstový hormon. Biotechnologické firmy tyto vzácné proteiny začaly vyrábět pro terapeutické účely s využitím transgenních mikroorganizmů a živočichů. Se sekvenováním lidského genomu jsou rozpoznávány a klonovány další geny pro vzácné proteiny, které by mohly reparovat některé genetické choroby člověka. V mnoha případech nemusí jít jen o lidské geny a genetické choroby.

K hlavním úspěchům genového inženýrství již v letech 1980–1990 patřilo, že byly klonovány geny pro lidský inzulin, interferon a růstový hormon. Biotechnologické firmy tyto vzácné proteiny začaly vyrábět pro terapeutické účely s využitím transgenních mikroorganizmů a živočichů. Se sekvenováním lidského genomu jsou rozpoznávány a klonovány další geny pro vzácné proteiny, které by mohly reparovat některé genetické choroby člověka. V mnoha případech nemusí jít jen o lidské geny a genetické choroby.

Hirudin je protein, který působí proti srážení krve. Patologickým typem srážení krve u starších osob je trombóza a při jejím léčením se využívá antitrombinových látek. Z nich nejznámější je heparin. Ten ale má své nevýhody. Pijavky mají ve svých slinách antikoagulační protein hirudin. Je to malý protein (7kDa), který je vysoce acidický, tvoří komplexy s trombinem a je to nejsilnější existující inhibitor trombinu. Je to farmakologicky významný protein, který již byl biotechnologicky vyráběn (prostřednictvím E. coli, Streptomyces, bakulovirů, kvasinek). Ten však je řádově méně účinný než přírodní. Přírodní hirudin obsahuje v poloze 63 tyrosin, na který je vázána síra, ale vyráběný prostřednictvím mikroorganizmů tuto anomální aminokyselinu neobsahuje. Nyní je možnost ho produkovat prostřednictvím transgenních rostlin. Upravený chimérický gen byl včleněn do genomu Brassica napus tak, aby polypeptid kódující hirudin byl součástí proteinu oleosinu. Oleosiny jsou proteiny, které se nacházejí v membránách olejových tělísek buněk zásobních orgánů semen. Vyznačují se tím, že se velmi snadno extrahují a s nimi se extrahuje i hirudin. Ten se od oleosinu oddděluje proteolytickým štěpením. Jedná se tedy o vnesení fúzního transgenu oleosin hirudin.

Další skupina proteinů, o jejichž produkci prostřednictvím transgenních rostlin se uvažuje, jsou některé minoritní proteiny lidské krevní plazmy. Ty jsou rovněž produkovány pomocí savčích buněk in vitro, ale produkce prostřednictvím rostlin je často výhodnější. Jedním z takovýchto proteinů je cytokin GM-CSF. Ten je potřebný po transplantaci kostní dřeně, kdy často dochází k infekcím a tento protein zvyšuje imunitu. Gen byl klonován a kódující sekvence má 432bp. Polypeptid má signální peptid 17 aminokyselin a zralý polypeptid má délku 127 aminokyselin. Pro expresi v rostlinách bylo třeba zkonstruovat chimerický gen, který má jiný signální peptid. Byl to signální peptid gluteinu rýže a z téhož genomu byl také promotor. Docházelo k dostatečné expresi proteinu v semenech tabáku a není pochyb o tom, že v současné době je již protein exprimován v semenech některých produkčně výhodných kulturních druhů rostlin.

Dalšími kandidáty jsou geny pro faktory srážlivosti krve pro léčení hemofilie FVIII a IX. Je velmi pravděpodobné, že některé proteiny, produkované v zásobních proteinech semen, budou vhodné přímo ke konzumaci bez izolace pro aktivní i pasivní imunizaci.

Jiný typ lidských proteinů, které bude vhodné produkovat prostřednictvím transgenních rostlin, jsou proteiny lysozómů. Lysozómy jsou degradativní organely živočišných buněk a jsou důležité pro degradaci makromolekul a recyklaci vzniklých monomerů. Lysozomy obsahují nukleázy, fosfatázy, proteázy a další enzymy, které degradují polysacharidy a lipidy. Absence některé ze specifických hydroláz v lysozymech vede k hromadění nerozložených molekul substrátu a u člověka to má za následek pestré klinické obrazy. Např. Tay-Sachsova nemoc, která vede v nervových buňkách k hromadění gangliosidu G_M2, vede k smrti obvykle ve věku dítěte kolem pěti let. Gaucherova choroba je defektem enzymu glukocerebrosidu (kyselé b-glukosidázy) a vede k akumulaci glykosfingolipidů v buňkách makrofágů, což vede k vážným poruchám kostry a trávicího traktu. Tato dědičná choroba se dá léčit dodáváním chybějícího enzymu, problém je však jeho získávání v dostatečném množství. Velmi vhodné jsou pro jeho produkci transgenní rostliny. Chimérický gen byl vnesen do genomu tabáku a projevuje se v proteinech listů v míře, při níž se již vyplatí jej extrahovat.

Produkt	Druh transgenní rostliny
Krevní proteiny
albumin	brambor a tabák
enkefaliny	tabák, Arabidopsis thaliana
interferon a	rýže
GM-CSF	tabák
scFv	tabák
Potenciální vakcíny
HIV, rhinovirus	Vigna
HBsAg	tabák
endotoxin E. coli	tabák a brambor
antigen malárie	tabák
lidský sérový albumin	tabák, brambor
virus neštovic	tabák

Tvorba fytáz

Fytáza je enzym, který je univerzálně rozšířen a podmiňuje degradaci kyseliny fytové, která je hlavní zásobní formou fosforu v semenech. Rostliny nemají dostatek tohoto enzymu. Fytáza z Aspergillus niger přeměňuje kyselinu fytovou na další formy a pak dochází až k přeměně na fosfor. U přežvýkavců mikroflóra zajišťuje rozložení kyseliny fytové rostlinného původu až na využitelný fosfor. Avšak v trávicím traktu drůbeže zůstává většina anorganického fosforu nespotřebována a je výhodné, aby hladina fytázy v rostlinách byla zvýšena. Kyselina fytová je navíc antinutričním faktorem, který brání vstřebávání dalších minerálů, jako je železo, zinek, vápník nebo hořčík. Gen pro fytázu z Aspergillus niger se projevuje v genomu tabáku a uvažuje se i o biotechnologické produkci enzymu prostřednictvím rostlinných buněk.

Tvorba biodegradovatelných polyesterů

Organizmy mohou za specifických podmínek uchovávat uhlík a energii ve formě osmoticky inertních polymerů. U bakterií to mohou být polyestery jako poly (3-hydroxybutyrát) (PHB) a jiné poly(3-hydroxyalkanoáty) (PHA). Tyto látky jsou využitelné jako biodegradovatelné plasty. Jsou značně perspektivní vzhledem ke zvyšujícím se problémům hromadění umělohmotného odpadu. Polyhydroxyalkanoáty jsou syntetizovány např. v bakteriích Pseudomonas aeruginosa, P. oleovorans nebo Alcaligenes eutrophus. Tvorba PHB je u bakterií zprostředkována třemi enzymy:

1. 3-ketothiolasou (gen phbA)
2. NADH-dependentní acetoacetyl-CoA reduktázou (gen phbB) a
3. PHB syntázou, také nazývanou PHB polymerázou (gen phbC).

Produkce PHB je vázána na syntézu mastných kyselin, jejíž podstatná část probíhá v chloroplastech.

Polyhydroxybutyrát se hromadí v transgenních rostlinách Arabidopsis thaliana, které jej syntetizují. Do genomu Arabidopsis thaliana byly přeneseny upravené 3 bakteriální geny, které mají všechny promotor 35S. PHB se hromadí v listech, v buněčných inkluzích v cytoplasmě, vakuolách i buněčném jádře, ale tvoří jen asi 0,14 % sušiny. Akumulace PHB se silně zvyšuje, jestliže je dopravován do chloroplastů. Tvoří potom až 14 % sušiny. Produkce polyhydroxybutyrátu prostřednictvím Arabidopsis thaliana je jen modelový přístup. Pro vlastní průmyslovou produkci se předpokládá, že tento polymer bude produkován v plastidech hlíz bramboru. Pravděpodobně by pro tento účel byly vhodné již existující transgenní brambory, jejichž hlízy neobsahují škrob. Uvažuje se rovněž o akumulaci v semenech. Přitom je samozřejmou podmínkou, aby transgenní rostliny nebyly závadné pro ekosystémy a člověka. Rostlinné části, kumulující PHB nebudou vhodné k požívání. Nemohou to tedy být takové rostlinné části, které obvykle slouží jako potrava nebo krmivo, aby nedošlo k záměně. Nemohou to být ani semena plodin, která jsou příležitostně konzumována ptáky. Produkce PHB bude vyžadovat podrobný rozbor z hlediska zajištění neškodnosti transgenních rostlin. Předpokládá se, že to budou semena takových rostlinných druhů, která nejsou pojídána člověkem ani požírána zvířaty (např. Ricinus communis).

Transgenozí bylo dosaženo také akumulace fruktanů v rostlinných pletivech. Fruktany jsou některými rostlinami syntetizovány. Jsou to polyfruktosové molekuly, které slouží k akumulaci cukrů. Ve vakuolách jsou enzymy, které mění sacharosu na fruktany a ty pak mohou být degradovány specifickými hydrolasami. Zatímco rostlinné fruktany se skládají z 5–60 zbytků fruktosy, bakteriální se skládají až ze 100 000 zbytků fruktosy (u rodů Bacillus, Pseudomonas, Streptopcoccus). Gen SacB z Bacillus subtillis, který kóduje příslušný enzym levansacharasu byl modifikován a vnesen do buněk tabáku. Transgenní rostliny akumulovaly fruktany shodné s bakteriálními v množství 3–8 % sušiny. To otevírá perspektivu produkce fruktanů pro potravinářské i průmyslové účely prostřednictvím transgenních rostlin. Kromě toho gen SacB, vnesený do genomu tabáku, zvyšuje toleranci k suchu. Zvýšenou odolnost k suchu podmiňuje také vnesení upraveného bakteriálního genu pro cholindehydrogenázu do rostlinného genomu. Tento enzym podmiňuje syntézu glycin betainu, což je rovněž osmotikum, které zvyšuje odolnost k suchu. Transgenní tabák je pak schopen růst na mediu s vysokým obsahem chloridu sodného.

Fytoremediace

Existují transgenní rostliny, které jsou schopné měnit toxickou formu dvojmocných iontů rtuti na mnohem méně toxickou formu elementární rtuti. Transgenních rostlin se již ujala biotechnologická firma PhytoWork Inc., která chce produkovat transgenní rostliny pro remediaci.

Zajímavou skupinu tvoří geny pro metalothioneiny. To jsou živočišné proteiny, které mají schopnost pevně vázat některé toxické těžké kovy, jako například kadmium. Většina rostlin hromadí kadmium v kořenech, ale u salátu, tabáku a některých dalších se kadmium dostává i do listů. Jakýkoli způsob konzumace rostlin pak může nepříznivě ovlivňovat lidské zdraví. Jsou dva způsoby využití transgenů pro metalothioneiny:

1. Exprese v kořenech zdržuje toxické kovy již v kořenech a nedovolí jim hromadit se v požívaných částech rostlin.
2. Druhou možností je využít rostlin k tzv. bioremediaci, t.j. odstranění toxických látek z půdy tím, že budou ve zvýšené míře akumulovány v rostlinách a ty pak zlikvidovány.

Ničivé účinky trinitrotoluenu (TNT) se neomezují jen na exploze. TNT a látky vznikající jeho rozkladem jsou pro člověka a další živé organizmy silně toxické. Nejen výrobní haly, skladiště, ale i rozsáhlé prostory vojenských střelnic jsou touto látkou silně kontaminovány. V likvidaci TNT by měly pomáhat i GMO. Bakterie Pseudomonas putina s dědičnou informací obohacenou o gen pro světélkující enzym a geny pro enzymy rozkládající TNT se intenzivně množí právě v místech, kde je půda kontaminována výbušninou. Fluoreskující světlo z rostoucích bakterií pak tato místa jasně označí. Po geneticky modifikovaných „bakteriálních průzkumnících“ může přijít GM „úklidová četa“. V laboratořích byly získány rostliny tabáku s dědičnou informací obohacenou o gen pro nitroreduktázu. Díky ní dokáže tabák rozkládat TNT a může růst i na půdách znečištěných výbušninou. Při laboratorních pokusech tabáky zlikvidovaly TNT z živné půdy za 3 dny a samy žádné TNT neobsahovaly. Byly jej schopny rozložit na neškodné látky.

Také byla získána GM bakterie druhu Sinorhizobium meliloti, která je schopná rozkládat dinitrotoluen (DNT), jednu z látek vznikajících při rozkladu TNT. Mikroorganizmus patří mezi hlízkové bakterie žijící symbioticky na kořenech motýlokvětých rostlin (bobovité, Fabaceae). Kontaminovaná půda byla obohacena jak GM bakterií, také zde byl vysazen hostitel – vojtěška. Na jiných pozemcích kontaminovaných DNT vysadili vojtěšku bez bakterií. Vojtěška podporovaná GM bakteriemi vytvořila dvakrát tolik zelené hmoty než vojtěška bez GM bakterií. Navíc rostliny a bakterie dokázaly z půdy odstranit téměř všechen DNT i při velmi silném znečištění.

On-line prezentace

Ke kapitole Geneticky modifikované rostliny.

Téma Genetické modifikace rostlin

Téma Genetické modifikace pro zlepšení výživy člověka