OOOOODODOOOOO 0ÚD0OO0O00O0O OQODODQOOnŮnŮ □onononoaOcoD O a O a ^ ~ ^"(iflOflO OQODOuukjOOODO □onoaonoDODOn oooaonoDonoao MASARYKOVA UNIVERZITA Využiti genetické rozmanitosti při identifikaci člověka RNDr. Pavel Lízal, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie lizal@sci. muni. cz Využití genetické rozmanitosti při identifikaci člověka 1) Genetika a genetická rozmanitost 2) Jak vzniká genetická rozmanitost 3) Jak ji lze zjistit 4) Využití pro identifikaci osob GENETIKA PODOBNOST / ODLIŠNOST ROZMANITOST 1) Zdroje - jak vzniká 2) Jak ji lze zjistit i a 3) Využití ROZMANITOST 1) Zdroje - jak vzniká 1) Mutace nové varianty genů dědičné změny v DNA vznikají náhodně nezbytné v evoluci individuální mutace 2) Pohlavní rozmnožování rozmanitost gamet nové kombinace • crossing-over • splývání gamet evoluční výhoda ROZMANITOST Vznik odlišných gamet u heterozygotů homozygoti AA nebo aa heterozygot Aa 7% 93% člověk má asi 6,7 % genů v heterozygotních sestavách tj. asi 1 575 genů — teoreticky tedy může vzniknout 21575 druhů gamet to je asi 10480 (uvádí se, že celkový počet protonů a neutronů na Zemi je odhadem 1076) člověk může za život uplatnit jen nepatrné množství gamet tolik druhů gamet ještě nemohlo ani vzniknout za dobu existence člověka na Zemi ROZMANITOST • doposud žádné dvě gamety nemohou být úplně shodné = žádní dva lidé z celého počtu žijících lidí v současnosti, minulosti či vzdálené budoucnosti nemohou být geneticky shodní (vyjma jednovaječných dvojčat) ROZMANITOST 1) Zdroje - jak vzniká 2) Jak ji lze zjistit i a 3) Využití ROZMANITOST Jak ji lze zjistit 1) Vnější pozorovatelné znaky - fenotyp např. výška postavy, barva kůže, morfologie lebky apod. Problém: • jsou ovlivněny prostředím • často se mění i v průběhu života jedince ROZMANITOST 1) Vnější pozorovatelné znaky - fenotyp Lze využít takové znaky k identifikaci člověka? • pokud jsou dostatečně individuální • pokud se nemění v průběhu života jedince • počítačová identifikace obličeje, duhovky a sítnice oka (nová biometrie) ROZMANITOST 2) Znaky s jednoduchou dědičností nevýhodou obvykle obtížnější stanovení výhodou je nulový vliv prostředí příkladem jsou krevní skupiny • nejpoužívanější jsou asi skupiny ABO systému • Karl Landsteiner, Jan Janský • dlaždicový test, srážení s protilátkami • 3 alely, lA5 lB5 i skupina A (lA lA, lA i) - v populaci 41,5 % lidí skupina B (lB lB, lB i) - v populaci 14,1 % lidí skupina 0 (ii) - v populaci 37,8 % lidí skupina AB (lAlB) - v populaci 6,6 % lidí ROZMANITOST Jak ji lze zjisti 2) Znaky s jednoduchou dědičností Lze využít takové znaky k identifikaci člověka? pravděpodobnost shody dvou lidí je 34 % = asi každý třetí člověk má stejnou krevní skupinu v systému ABO spíše vylučovací metoda (tříhlavé paternitní spory, vícehlavé paternity s malým počtem) Dalšími krevními skupinami jsou např. RH systém, MN, Diego, Duffy, Lutheran, Lewis a další Pro identifikační účely jsou málo rozmanité. Nekódující DNA - 90 až 95 % genomu Kódující DNA 5 až 10 % genomu ■"'ířatr^i^' ^^"^ůb" ^J^táÉÉdl&ľ^-; 10% ROZMANITOST 3) Rozmanitost na úrovni DNA Jak ji lze zjisti v -1 nekódující DNA se analyzují tzv. krátká tandemová opakování (STR) | TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGbAT^jATA GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAA CAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC _^ 7 repeats........ ^_ _^ 8 repeats........ ^_ _^ 9 repeats........ _^ 10 repeats........ 11 repeats........ 12 repeats........ 1 3 reneate i—i—i—i—i—i—i—r- Tato opakování mají jednoduchou mendelistickou dědičnost matka x otec 8/8 7/7 potomek 8/7 ROZMANITOST 3) Rozmanitost na úrovni DNA Jak ji lze Lze využít takové znaky k identifikaci člověka? • v daném úseku se jedinci mohou lišit v délce tohoto úseku • i přesto, pokud bychom analyzovali pouze jeden takový úsek - shoda by byla relativně vysoká = analyzujeme několik takových sekvencí ROZMANITOST 3) Rozmanitost na úrovni DNA Jak zjednodušený příklad pro 4 sekvence Vzorky z místa činu 7K I Vzorek podezřelého Vzorek podezřelého ! ROZMANITOST 3) Rozmanitost na úrovni DNA Jak ji lze zjistit ve skutečnosti se takto analyzuje celkem 16 sekvencí ji. h bij. i Pravděpodobnost shody je pak menší než 10~15 dnes žije na zemi asi 7 miliard lidí, tedy 7 x 109 Velmi spolehlivá metoda pro identifikaci osob ROZMANITOST 3) Rozmanitost na úrovni DNA Jak ji lze SNP • jednonukleotidový polymorfizmus • pravděpodobně asi nejrozmanitější znak • tato rozmanitost ještě vyšší než při využití opakujících se sekvencí (změna může nastat v každém z 3,5 x 109 nukleotidů) každý jedinec je skutečným originálem, který zaniká jeho smrtí ROZMANITOST 1) Zdroje - jak vzniká i a 3) Využití identifikace pomocí DNA paternitní spory ROZMANITOST Forenzní genetika K čemu je to dobré identifikace člověka pro kriminalistické účely zavedl v roce 1984 Sir Alec Jeffreys, VB, „DNA fingerprinting, DNA profiling" DNA profil konkrétního jedince 1 2 3 4 ROZMANITOST Forenzní genetika K čemu je to dobré Historie [ • poprvé metoda použita v Anglii - imigrační spor - prokázat identitu chlapce, který žádal o povolení k nastěhování k rodičům žijícím v Anglii 1986 první aplikace v kriminalistice - Scotland Yardu pomohla osvobodit neprávem obviněného člověka ze znásilnění a zavraždění dvou školaček (1983, 1986) a identifikovat pachatele mezi obyvateli městečka (4 500 mužů) pomocí zajištěného spermatu 21.11.1983 - znásilněna a zavražděna 15letá Linda Mannová zajištěno sperma pachatele, pachatel nedopaden 1986 - blízko místa předchozího zločinu znásilněna a zavražděna 15letá Dawn Ashworthová k činu se doznal 17letý mladík, vraždu Lindy Mannové však popíral 1987 - policie se obrátila na Aleca Jeffreyse - srovnal DNA ze spermatu s DNA podezřelého mladíka sperma v obou případech znásilnění patřilo stejnému pachateli, avšak neshodovalo se s DNA podezřelého policie odebrala vzorky mužům z okolních vesnic (přes 4 500 mužů) shoda opět nalezena nebyla o sedm měsíců později - policie zjišťuje, že pekař Colin Pitchfork přemluvil kamaráda, aby se místo něj zúčastnil odběru DNA dodatečný odběr prokázal shodu - odsouzen k doživotnímu vězení ROZMANITOST Forenzní genetika K čemu je to dobré V ČR poprvé použita analýza DNA v roce 1990 27.6.1990 kolem 7:30 byla na dámském WC PedF MU zavražděna 19letá studentka Jana Krkošková vražda se sexuálním motivem, sperma nebylo zjištěno zajištěn zvláštní druh krevní stopy - kapky na jedné kachličce druhý den zadržen 26letý Milan Lubas měl obvázanou dlaň pravé ruky, byl již dvakrát trestán mimo jiné i za znásilnění, po amnestii v roce 1990 propuštěn účast na vraždě popřel zranění nejdříve vysvětloval úrazem na stavbě, později jako obranu při přepadení odebrána krev a porovnána s krví z kachličky, zajištěna také krev z riflí podezřelého bohužel podezřelý měl stejnou krevní skupinu jako oběť policisté požádali doc. Feráka (UK v Bratislavě) o provedení identifikace novou metodu pomocí DNA 24.10.1990 - znalecký posudek potvrdil, že krev na dámském záchodě patřila podezřelému a krev na ponožkách a riflích byla krví zavražděné Lubas byl odsouzen na 23 let do vězení, 4.2.1993 spáchal ve vězení sebevraždu Příklad výpočtu pravděpodobnosti shody v DNA Profil DNA pachatele: H - TPOX I U n D3S1358 Lokalizace 13 mikrosatelitů + AME n i—i D5S818 FGÄ R CSF1 PO 1 □ 2 3 4 5 B TH01 Q VWA Alely v 16 markerech D7S820 10 AMEL D16S539 □ D 15 16 B p D18S51 b o U Y D3S1358 15/17 TH01 7/9 I D21S11 29/31 I D18S51 17/18 I Penta E 5/13 I D5S818 12/13 I D13S317 8/11 I D7S820 9/10 I D16S539 12/12 CSF1PO 11/12 I Penta D 12/13 I AME - pohlaví XY I vWA 17/18 I D8S1179 12/14 TPOX 8/9 I FGA 19/24 j Příklad výpočtu pravděpodobnosti shody v DNA Alelové četnosti 17 mikrosatelitních sekvencí ve vzorku populace České republiky EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ. mládeže a tělovýchovy IhVEäTICE ĎO ROZVOJE 'VÍOĚLÁVÁUi £_! OP Vrdttávfail I hfifl*ijrclh:c*CliOpmi 1< :s* .cd Allele D2S1338 B3S1358 05S818 B7S820 B8S1178 B13S317 B16S538 B18S51 D19S433 021811 CSF1PÜ FGA Penta D Penta E TH01 TPOJÍ vWA H: 282 H:141 ľ H:1410 H:141 ľ H:141 ľ H: 1410 H: 1411- H: 1411- H: 282 H: 1407 H: 1411- H: 1410 H: 1128 H: 1128 N: 1411 N: 1410 N: 1411 \ - - - - - - - - - - - - - - 0,0004 - - i - - - - - - - - - - - - - 0,0657 0,0025 - - - - 0.00Ü4 - - - - - - - - - 0,0009 - 0,225 0,0004 - - - 0.0025 0.0159 - - - - - - 0,0004 - 0,0027 0,1559 0,1545 0,0004 - \ - - 0.005 0.1641 0.0117 0.13Ü5 0.0Ü96 0,0004. - - 0,0025 - 0,0066 0,0075 0,1013 0,5493 - r~ - - 0.0468 0.1534 0.0078 0.0812 0.1Ü17 - - - 0,0415 - 0,2402 0,0195 0,1857 0,1032 - 9.3 - - - - - - - - - - - - - - 0,321 - - - - 0.0621 0.2789 0.0716 0.055 0.0528 0,0071 - - 0,2764. - 0,1113 0,1319 0,0082 0,0621 - io:3 - - - - - - - - - - - - - - 0,0004 - - '11 - 0.0021 0.3255 0.2069 0.0726 0.345 0.2736 0,0135 0,0035 - 0,2725 - 0,1609 0,1119 0.0004- 0,2535 0,0007 '12- - 0.00Ü7 0.3858 0.1396 0.1545 0.255 0.3196 0,1095 0,0691 - 0,3292 - 0,195 0,1625 - 0,0309 0,0007 '13 - 0.0028 0.1571 0.0358 0.3278 0,0979 0,2052 0,1159 0,2482 - 0,0627 - 0,2012 0,1052 - 0,0004 0,0025 13.2 - - - - - - - 0,0004. 0,016 - - - - - - - - \& - 0.1247 0.0121 0.0046 0.2268 0.034 0,0358 0,1513 0,3617 - 0,0113 - 0,0594 0,0586 - - 0,106 14.2 - - - - - - - - 0,023 - - - - - - - - Í5 - 0.2364. 0.0025 0.0007 0.1031 0.0Ü14. 0,0018 0,1687 0,172 - 0,0032 - 0,0151 0,0488 - - 0,1109 15.2 - 0.00Ü4 - - - - _ - 0,0301 - - - - - - - - '16 0.0443 0.2427 - - 0.0198 - - 0,1534- 0,0408 - 0,0004- - 0,0062 0,0409 0,0004- - 0,1821 1G.2 - - - - - - - - 0,0213 - - - - - - - - Í7 0.18Ü9 0.2197 - - 0.0032 - - 0,1194 - - - 0,0011 0,0004 0,0364 - - 0,2693 17.2 - - - - - - - - 0,0089 - - - - - - - - '18. 0.1152 0.1552 - - 0.0011 - - 0,0811 - 0,0007 - 0,0121 - 0,0293 0,0004 - 0,2289 18.2 - - - - - - - - 0,0053 - - - - - - - - 0.1312 0.0145 - - - - - 0,039 - 0,0004. - 0,077 - 0,0138 - - 0,0836 19!2 - - - - - - - - - 0,0004 - - - - - - - 20- 0.1294- 0.0007 - - - - - 0,0209 - - 0,1436 - 0,0084- - - 0,0135 20:2 - - - - - - - - - - - 0,0004 - - - - - 21 0.0284 - - - - - - 0,0124 - - - 0,1826 - 0,0018 - - 0,0018 21.2 - - - - - - - - - - - 0,0007 - - - - - 22 0.023 - - - - - - 0,0057 - - - 0,1947 - 0,0004 - - - n n-i-7-1 SIMKOVA, H.,FALTUS, V., MARVAN, R., etal. Allele frequency data for 17 short tandem repeats in a Czech population sample. Forensic Science International: Genetics, 2009, vol. 4, no. 1, p.e15-e17. Příklad výpočtu pravděpodobnosti shody v DNA D3S1358 15/17 TH01 7/9 D21S11 29/31 D18S51 17/18 Penta E 5/13 D5S818 12/13 D13S317 8/11 D7S820 9/10 D16S539 12/12 CSF1PO 11/12 Penta D 12/13 AM E - pohlaví XY vWA 17/18 D8S1179 12/14 TPOX 8/9 FGA 19/24 D3S1358: 2 (0,2364x0,2197) TH01: 2 (0,1545x0,1857) D21S11: 2 (0,1951 x 0,0668) D18S51: 2 (0,1194x0,0811) Penta E: 2 (0,0657x0,1052) D5S818: 2 (0,3858x0,1571) D13S317: 2 (0,1305x0,345) D7S820: 2 (0,1534x0,2789) D16S539: 0,3196x0,3196 CSF1 PO: 2 (0,2725 x 0,3292) Penta D: 2 (0,195x0,2012) vWA: 2 (0,2693 x 0,2289) D8S1179: 2 (0,1545x0,2268) TPOX: 2 (0,5493x0,1032) FGA: 2 (0,077x0,1411) -'-1 P shody je 1,189 x 1018 (1 z 8,41 x 1 o17) Pozn.: dnes žije na zemi asi 7,0 miliard lidí, tedy 7,0 x 109, v ČR žije zhruba 1 x 107 lidí ROZMANITOST Forenzní genetika 2002 - Národní databáze DNA (Kriminalistická databáze) - osob, které byly odsouzeny pro spáchání zvláště závažných trestných činů - osob proti nimž bylo pro tyto trestné činy vedeno trestní stíhání* - osob obviněných* ze spáchání trestného činu - osob, po kterých bylo vyhlášeno pátrání - DNA profily mrtvol, kosterních nálezů a zbytků lidských těl neznámé totožnosti - DNA profily získané z míst dosud neobjasněných trestných činů - obsahuje několik desítek tisíc profilů (pouze profily DNA) - *avšak u podezřelých a obviněných osob jen za zvláštních podmínek Zákon č. 321/2006 Sb., změna trestního řádu V § 114 se za odstavec 3 vkládá nový odstavec 4, který zní: "(4) Nelze-li úkon podle odstavců 1 až 3 pro odpor podezřelého nebo obviněného provést a nejde-li o odběr krve nebo jiný obdobný úkon spojený se zásahem do tělesné integrity, je orgán činný v trestním řízení oprávněn po předchozí marné výzvě tento odpor překonat; policejní orgán potřebuje k překonání odporu podezřelého předchozí souhlas státního zástupce. Způsob překonání odporu musí být přiměřený intenzitě odporu." ROZMANITOST Zákon č. 321/2006 Sb., změna zákona o Policii ČR V § 42e se doplňuje odstavec 3, který zní: "(3) Nelze-li úkon podle odstavce 1 pro odpor osoby provést a nejde-li o odběr krve nebo jiný obdobný úkon spojený se zásahem do tělesné integrity, je policista po předchozí marné výzvě oprávněn tento odpor překonat. Způsob překonání odporu musí být přiměřený intenzitě odporu.". Zajímavost: vzorky DNA jsou v ČR po získání DNA profilu, dle vyjádření policie, likvidovány! neexistuje tedy možnost pozdějšího provedení kontrolní analýzy Analýza DNA je použitelná i pro identifikace ve velkém vzorku: • např. v Německu v roce 1998 bylo provedeno DNA profilování u více než 16 000 mužů při hledání pachatele znásilnění a vraždy 11 -lete dívky • Kmetíněves - vražda 13-leté dívky, DNA pachatele za nehty zavražděné, testováno 700 vzorků (pozitivní č. 632) ROZMANITOST Forenzní genetika K čemu je to dobr Další zajímá vosti: vzorek DNA - pouze jeden z mozaiky důkazů zajištění vzorku - odběrové tyčinky pachatelé jsou připraveni - ochranné pomůcky, nepozornost, otisky chiméry pomůže i nehumánni DNA DNA po polibku rekreační genetika - genealogie, nevěra stanovení barvy očí a vlasu podle DNA barva vlasů > 80% pravděpodobnost, barva očí až s 96% pravděpodobností „stanovení" příjmení podle DNA ROZMANITOST Forenzní genetika K čemu je to dobré Identifikace obětí: teroristických činů (New York, 11.9.2001) přírodních katastrof (tsunami, Asie, prosinec 2004) při hromadných neštěstích (požár lanovky, Kaprun, 11.11. 2000) | K identifikaci se používá DNA oběti a DNA žijícího příbuzného i r New York, 11.9.2001 '.V Abbottabad, Pákistán 1.5.2011 Usáma bin Ládin - DNA sestry zemřela zhruba rok před jeho zabitím na mozkový nádor ve Všeobecné nemocnici v Massachusetts po její smrti byl uskladněn vzorek mozkové tkáně ROZMANITOST Paternitní spory K čemu je to dobré klasické určení otcovství speciální případy (záměna miminek v Třebíči roku 2007) v současnosti populární testování věrnosti (rekreační genetika) Třebíč, 2007 DĚKUJI ZA POZORNOST RNDr. Pavel Lízal, Ph.D. Iizal@sci. muni. cz https://sites.google.com/site/lizalpal/